Système immunitaire

4 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à trois gavages de matières fécales, un traitement antibiotique, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et sept injections bloquant des voies immunitaires, certaines subissant en plus une chirurgie. Les tumeurs peuvent limiter leur mobilité, les antibiotiques provoquer des diarrhées et le tout des pertes de poids. Le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier ces interactions, les organoïdes ne reproduisant pas selon lui le dialogue entre immunité intestinale et tumeur.

Objectifs

De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal (TMF) peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les mécanismes expliquant l'efficacité des TMF sont encore à étudier. Parmis ceux potentiels, la modulation du métabolisme et de l'immunité post-TMF seront étudiés dans ce projet. Dans ce projet, nous testerons un métabolite mis en évidence dans d'anciens projets, associé à une meilleure efficacité des traitements par immunothérapies post-TMF. Nous étudierons plus en détails les effets immunomodulateurs de ce métabolites, sur sa voie d'action (locale ou systémique) et ses effets sur le thymus.

Bénéfices attendus

En effet, nous avons mis en évidence un métabolite associé à la réponse aux immunothérapies chez les patients, et nous étudierons son effet dans ce projet, en association aux TMF et au traitement par immunothérapie. De plus les modulations immunitaires seront étudiées, et notamment le rôle du thymus. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire et du métabolisme de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que le métabolite étudié pourrait constituer un biomarqueur de la réponse aux TMF + immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux ICI, et de pouvoir sélectionner des donneurs. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques.

Procédures

Les interventions prévues seront l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée de moins d'1 minute), l'administration orale de matières fécales avec une sonde de gavage oral (1 à 3 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection intrapéritonéale (4 fois maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements bloquant certaines voies immunitaires par injection intrapéritonéale (7 fois maximum, durée 1 minute). Dans les procédures 4 et 5, une chirurgie seral réalisée, sous anesthésie générale et les souris seront traités par un anti-douleur (une fois, durée 15-20 minutes). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, une fois par semaine si 100uL sont prélevés (durée 2-3 minutes). Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale, par lidocaïne.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger et transitoire lié aux manipulations. Les gavages oraux pourront provoquer un inconfort léger et transitoire pour la souris. Il y a un risque de diarrhée car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée, induisant une déshydratation légère et de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids modéré post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post injection de tumeur sous-cutanée. Les injectionspeuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris. Les chirurgies comportent un risque de douleur post-opératoire modérée.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées afin d’analyser les organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections sous-cutanées, intraveineuses et intrapéritonéales (i.p.) seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

1 200 souris vont être utilisées, aucune maintenue en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une plaie chirurgicale de la peau sous anesthésie, avec une douleur estimée modérée pendant environ quatre heures, et certaines sont réanesthésiées deux fois par semaine pendant trois semaines pour changer le pansement, jusqu'à sept anesthésies. Le porteur attend de ce modèle de cicatrisation l'identification de nouveaux acteurs moléculaires, les applications contre les plaies chroniques ou la fibrose restant présentées comme des hypothèses pour de futurs projets. Il indique 12 souris par condition, calculées par un logiciel statistique, sans détailler ce qui conduit au total de 1 200.

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes permettant la réparation de la peau est un enjeu de santé publique. L'avancée de nos connaissances dans ce domaine pourrait permettre l’amélioration du traitement d’épisodes cliniques aiguës (brûlure, choc mécanique …) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance de ces processus, les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire sont encore mal connus. Des données de la littérature montrent que certaines cellules de l’immunité produisent des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. En étudiant ces cellules en culture dans le laboratoire, nous avons identifié un mécanisme qui pourrait contrôler la production des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. Nous faisons l'hypothèse qu'à travers une étude plus poussée de ce mécanisme, nous pourrons faire progresser significativement notre compréhension globale des mécanismes de la réparation tissulaire et potentiellement identifier des cibles thérapeutiques. Le projet comporte deux objectifs : 1- déterminer si les résultats obtenus en culture sont valides dans une situation de réparation tissulaire physiologique dans l'animal, 2- identifier de nouveaux acteurs moléculaires de la cicatrisation. Pour atteindre ces objectifs, il est nécessaire d’utiliser un modèle de cicatrisation cutanée dans un animal modèle (la souris). Ce modèle reproduit les étapes de cicatrisation tissulaire observée chez l’Homme, et nous permet d'étudier les cellules et molécules d'intérêt dans un environnement complexe plus représentatif d’une situation physiologique. Nous comparerons des souris normales et des souris dans lesquelles les mécanismes étudiés ont été inactivés dans les cellules immunitaires. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de réparation tissulaire.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la réparation des tissues après une lésion. Les nouvelles molécules identifiées pourront être étudiées plus en détails dans de futurs projets, contribuant à l’avancée des connaissances scientifiques. De plus, il est établi que les cellules immunitaires jouent un rôle central dans les pathologies inflammatoires quand leur fonction réparatrice est altérée, par exemple dans les ulcères, les plaies chroniques des patients diabétiques, et les fibroses. De plus, cette fonction réparatrice est également diminuée chez les sujets âgés, sans que l’on en comprenne les mécanismes. Mieux connaître les acteurs moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire dans les cellules immunitaires permettra ainsi de formuler de nouvelles hypothèses sur les causes de leur dysfonctionnement dans des conditions pathologiques. Les nouvelles molécules identifiées dans ce projet pourront ainsi représenter de nouveaux candidats pour des approches thérapeutiques afin d’améliorer la régénération tissulaire et d’empêcher la fibrose dans les pathologies inflammatoires chroniques.

Procédures

Chaque animal subira une chirurgie de la peau (une seule fois, 10 min). Chaque animal sera anesthésié le temps de la chirurgie (10 min). Certains animaux seront anesthésiés à nouveau afin d'observer la cicatrisation et de changer le pansement (3 min à chaque fois, 2 fois par semaine, pour une durée maximale de 3 semaines), le nombre maximal d'anesthésie gazeuse sera de 7 fois pour ces animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie de la peau (une seule fois), avec une douleur modérée d'une durée moyenne. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide, 10 min), risque d'hypothermie (légère et rapide, 10 min) et douleur liée à une blessure cutanée (modérée et de moyenne durée, environ 4 heures). Pour les animaux qui seront suivis au cours du temps, le pansement sera changé sous anesthésie 2 fois par semaine, les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide, 3 min), risque d'hypothermie (légère et rapide, 3 min).

Devenir

Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des données de la littérature montrent que les macrophages, chez l’Homme comme chez la souris, produisent des molécules bénéfiques pour la réparation tissulaire. Des expériences pilotes in vitro ont identifié des mécanismes moléculaires pouvant contrôler la production de ces molécules bénéfiques. Il est nécessaire de confirmer ces résultats dans un modèle in vivo. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La peau est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier les macrophages. Ainsi, les macrophages de la peau ont certainement des propriétés différentes de celles de tout autre organe. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires nécessaires pour la cicatrisation cutanée. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d'un logiciel statistique, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 12 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Pour analyser le rôle de nos molécules d'intérêt dans la cicatrisation in vivo, nous analyserons dans un premier temps la cicatrisation de la plaie au cours du temps. Si nous mettons en évidence une différence significative entre souris déficientes et contrôles, nous poursuivrons les analyses. Dans le cas contraire, le projet s'arrêtera.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans le cadre de ce modèle de blessure cutanée, les animaux sont anesthésiés par un agent anesthésiant inhalable et un analgésique est administré aux animaux lors de la chirurgie. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et le réveil afin d'éviter l'hypothermie. Des pansements adaptés sont utilisés (compresse stérile, pansement semi-occlusif et bandage de contention). Les animaux sont surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins post-opératoires spécifiques seront mis en place si nécessaire, tels que l'injection de solution réhydratante en cas de déshydratation ou traitement par antispetiques en cas d'infection de la plaie. Les animaux seront pesés et évalués deux fois par semaine grâce à une grille de score pour mesurer de façon objective la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés (telles que des souris déficientes pour les molécules d’intérêt ou des techniques d’analyse d’expression de gènes), ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux

Une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans le foie, sous anesthésie, de cinq à dix minutes, est pratiquée sur des souris dont une partie a déjà reçu une injection à quinze jours de vie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie et leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet d'une protéine du virus de l'hépatite B sur les cellules immunitaires qui entourent la tumeur, à un stade précoce de cancer du foie. Le porteur annonce des douleurs de suture et des complications per-opératoires possibles, hypothermie et saignement, et mentionne l'injection pratiquée à quinze jours de vie sans jamais dire ce qu'elle contient.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se développe souvent sur un terrain cirrhotique associé à une inflammation chronique. Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du CHC. Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de développer des travaux, portant sur l'impact de ces formes virales, via la modulation de la réponse immunitaire, au cours de la carcinogenèse hépatique. L’un des mécanismes semble passer par la modulation de l'infiltration immunitaire intratumorale. L'objectif est de caractériser la composante immunitaire dans le microenvironnement tumoral (TME) en présence de ces différentes formes virales. A l'aide de nouvelles approches et modèles expérimentaux, le mécanisme de l'impact pro-tumoral de ces formes virales du VHB à un stade cancer du foie précoce sera étudié. Ce projet présente l'avantage d'étudier spécifiquement le stade précoce du CHC établi (3 semaines post-transplantation)

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la carcinogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge de carcinome hépatocellulaire de patients. La principale hypothèse est qu'une protéine du VHB module le micro-environnement tumoral facilitant l’activité pro-tumorale de certaines sous populations immunitaires. Grâce aux modèles murins, la modulation de l'activité et/ou du recrutement de l'infiltrat immunitaire intra/péritumoral par cette protéine virale, exprimée dans les hépatocytes, sera déterminée. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre de bloquer ces interactions intercellulaires et, en conséquence, la progression du carcinome vers un stade tardif.

Procédures

Une injection unique à 15 jours de vie (une fois par animal concerné, d'une durée de 5 secondes) sur souris vigiles. Une injection de cellules tumorales du foie murin sera réalisée par greffe : cette transplantation chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et couverte par des antalgiques en pré-opératoire, et en post-opératoire. Cette intervention ne sera réalisée qu'une fois par animal et sa durée est évaluée entre 5 à 10 minutes. Une euthanasie sera réalisée à la fin du projet de recherche à l'aide d'une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et une douleur de courte durée au site d’injection ou encore une inflammation locale. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. La greffe au niveau du foie implique une chirurgie, les souris pourront donc éprouver de la douleur au niveau des sutures des plans cutanés et musculaires, ainsi que les complications per-opératoires (hypothermie, saignement) malgré une prise en charge médicamenteuse adaptée.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié sous anesthésie afin de prélever le foie et la rate et permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux en utilisant une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous avons précédemment réalisé des cultures cellulaires en utilisant des modèles 2 et 3 dimensions de différentes lignées cellulaires et d'hépatocyes primaires afin d'étudier in vitro l'impact de l'expression de protéines du virus de l'hépatite B (VHB) sur la progression tumorale. Nous avons développé un modèle de co-culture en transwell permettant d'étudier les interactions entre les cellules d'hépatome exprimant ou non ces protéines du VHB et une sous-population immunitaire. Cependant, la mise en place d'un modèle in vitro récapitulant l'ensemble de la réponse immunitaire innée et acquise hépatique n'est pas encore disponible, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers le modèle in vivo pour étudier l'impact de la présence d'une des protéines du VHB sur l'activation des différents acteurs du système immunitaire au cours du carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Un total de 840 animaux seront inclus dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Des souris contrôles seront réutilisées, si possible, entre différentes procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A l'issue des procédures, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate, éventuelles métastases tumorales) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin génétiquement identique (syngénique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons explorer. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie soit de 7 à 10 semaines de vie. L'établlissement d'un cancer du foie au stade précoce nécessitera une période allant de 3 semaines à 6 mois de suivi selon les différents modèles expérimentaux.

Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.

Objectifs

Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.

Bénéfices attendus

La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.

Procédures

Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.

Raffinement

Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.