Système immunitaire
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Rôle des molécules S100A dans la pathogenèse du diabète de type 2 EU 2/2
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Gavées jusqu'à quinze fois un jour sur deux, saignées seize fois par la queue, entraînées sur tapis roulant cinq fois trente minutes par semaine pendant six semaines, les souris subissent aussi la pose d'une pompe osmotique sous la peau, des tests de force et un isolement de 48 heures pour mesurer leur dépense énergétique. 1 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent blesser l'œsophage et réduire la prise alimentaire, que la pompe provoque des douleurs plusieurs jours, que la course cause des blessures aux pattes et qu'une des molécules injectées est toxique pour les cellules du pancréas, avec crampes abdominales. Toutes sont tuées et nécropsiées en fin de procédure, sans qu'aucune soit réutilisée, l'objet étant le rôle d'une protéine dans le diabète de type 2 et la fonte musculaire.
Objectifs
L'obésité est un facteur de risque majeur de diabète de type 2 (DT2) qui représente un fardeau de santé publique et diminue l’espérance de vie en bonne santé. Ces deux pathologies sont également associées à une insulino-résistance et une sarcopénie, i.e. perte progressive de masse et de force musculaire. Nous avons mis en évidence une surexpression marquée d’une protéine d’intérêt. Cette protéine peut s’hétérodimériser avec une autre protéine de la même famille pour former un complexe multi-protéique. Ces protéines jouent un rôle clé dans l’inflammation et l’immunité. Cependant leur rôle dans la pathogenèse du DT2 reste incertain. Nous émettons l’hypothèse que cette protéine pourrait jouer un rôle causal dans les altérations métaboliques et fonctionnelles du muscle squelettique dans un contexte d’obésité et de vieillissement. L’objectif de ce projet est de : 1) démontrer un rôle causal de notre protéine d’intérêt dans le développement de l’insulino-résistance et de la sarcopénie ; 2) évaluer si l’inhibition de l’action de cette protéine prévient au moins en partie du développement de l’insulino-résistance et/ou de la sarcopénie associée à l’obésité et à l’âge. Ces questions exigent le recours au modèle animal pour se placer dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet visant à étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie promet de générer des bénéfices substantiels tant au niveau scientifique que clinique. En premier lieu, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ces pathologies métaboliques et musculaires, en étudiant spécifiquement le rôle de notre protéine d’intérêt. Une connaissance plus détaillée de l'implication de cette protéine pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, offrant ainsi des perspectives innovantes pour le développement de traitements spécifiques et efficaces. Sur le plan clinique, l'identification de la protéine comme un biomarqueur clé dans l'inflammation chronique associée à l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie pourrait améliorer le diagnostic précoce et la stratification des patients. Les praticiens pourraient ainsi mieux évaluer le risque de complications métaboliques et musculaires chez les patients obèses et ceux présentant une résistance à l'insuline, permettant une intervention préventive plus rapide et personnalisée. De plus, cibler cette protéine dans des approches thérapeutiques pourrait offrir une nouvelle avenue pour réduire l'inflammation et améliorer la sensibilité à l'insuline, atténuant ainsi les effets délétères de ces conditions sur la santé des patients. L'impact potentiel sur la gestion de la sarcopénie est également significatif. En étudiant les mécanismes par lesquels notre protéine d’intérêt contribue à la perte de masse musculaire et à la dysfonction métabolique, ce projet pourrait mener à des stratégies visant à préserver la masse et la fonction musculaire chez les personnes âgées et les patients atteints de maladies chroniques. Cela pourrait améliorer considérablement la qualité de vie et l'autonomie des individus affectés, tout en réduisant les coûts de santé associés aux complications liées à la sarcopénie. En somme, ce projet offre une opportunité de faire progresser notre compréhension des maladies chroniques liées à l'obésité et au vieillissement, tout en ouvrant la voie à des interventions thérapeutiques novatrices et personnalisées pour améliorer la santé et le bien-être des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 15 gavages (1 jour sur 2) et/ou à 7 injections sur 5 jours consécutifs seulement ainsi que 16 prélèvements sanguins à la queue (4 séquences de 7 prélèvements consécutifs). Tous les actes précédemment cités ne durent qu’au maximum 30 secondes chacun. Certains animaux auront une injection unique sous anesthésie générale. D’autres animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale une fois au cours de leur vie pour la pose de mini-pompe osmotique. Certains animaux auront une alimentation enrichie en lipides pendant un maximum de 12 semainesou encore deux tests d’effort et de préhension au maximum. Un nombre limité d’animaux sera entrainé sur tapis roulant 5 fois 30 minutes maximum par semaine pendant 6 semaines consécutives. Certains animaux subiront au maximum deux isolements de 3 minutes pour mesures de composition corporelle et d’autres subiront un isolement pour mesure de dépense énergétique pendant un maximum de 48h. Dans le second établissement utilisateur, un nombre restreint d’animaux subira une injection de traceur radioactif pendant 15 minutes avant mise à mort et l’ensemble des animaux seront mis à mort et nécropsiés.
Impact sur les animaux
Le régime hyperlipidique induit une obésité chez les animaux pouvant créer un inconfort. Le gavage répété peut causer du stress et des blessures oesophagiennes (entrainant une diminution de la prise alimentaire) abolis après arrêt des gavages. La pose d’une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie gazeuse peut provoquer des douleurs quelques jours après l’opération. La surexpression de notre protéine peut entraîner une inflammation associée à l’obésité et engendrer l'aggravation de l'insulino-résistance ainsi qu’une diminution des fonctions musculaires. Les prélèvements répétés de sang lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer du stress et des douleurs légères pendant 120 minutes au maximum. Les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant 2 à 3 minutes seulement. Les tests de force provoquent un stress pendant 120 minutes au maximum. La course provoque un stress pendant 120 minutes au maximum et peut provoquer des blessures légères aux pattes. La mesure de calorimétrie provoque un stress dû à l’isolement visuel et olfactif pendant 48h au maximum. Le transfert adoptif de cellules immunitaires peut provoquer une inflammation de bas grade. L’injection de certaines molécules est cytotoxique pour les cellules pancréatiques et peut engendrer des crampes abdominales.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort de manière réglementaire en fin de procédure et sont nécropsiés pour récolte d’organes et analyses ex vivo. Aucun animal de ce projet ne sera ré-utilisé.
Remplacement
Nous avons effectué des travaux préliminaires sur des modèles in vitro de myotubes humains montrant des effets de notre protéine d’intérêt sur la sensibilité à l’insuline et l’atrophie des myotubes. Le recours au modèle animal est indispensable pour évaluer les effets de cette protéine dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des études in vitro sont réalisées en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur les animaux. Des études pilotes permettront d'ajuster le protocole expérimental pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans les études principales ; ces études pilotes permettront aussi de s’assurer de la fiabilité du modèle. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats significatifs sont effectués.
Raffinement
Les animaux auront une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le responsable de la mise en oeuvre sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Lors des actes chirurgicaux ou injections douloureuses des anesthésies gazeuses sont prévues avec utilisation d’antalgiques en périopératoire. Lors des injections de produits provoquant des douleurs nous administrerons des antalgiques en amont. Pour les tests d’exercices physiques les animaux seront préalablement acclimatés et surveillés afin de détecter d’éventuelles blessures aux pattes. Pour les manipulations nécessitant l’isolement des animaux pendant 48 heures maximum, une surveillance accrue sera appliquée lors de leur retour en groupe afin de détecter des comportements agressifs. Nous pourrons alors ajouter des enrichissements dans les cages voire séparer les individus trop agressifs. Pour les animaux spontanément diabétiques nous réaliserons un change de litière plus fréquent et des contrôles de la glycémie. Pour l’expérimentation terminale dans l’établissement n°2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles de souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies métaboliques. Le modèle de souris choisi se prête bien aux phénotypage métabolique en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes moléculaires des maladies et de sa bonne susceptibilité aux régimes obésogènes. De plus, l’utilisation de souris spontanément obèses et diabétiques et leurs contrôles non-diabétique permettent une étude plus fine des mécanismes moléculaires. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 8 semaines. L’intérêt est ici d’étudier l’obésité, son développement et ses complications chez l’individu adulte.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement de maladies auto-immunes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une injection hydrodynamique de plasmides dans la veine peut provoquer chez des souris un hématome, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de leur état général dans les minutes qui suivent. 3 220 souris immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour y induire des maladies auto-immunes comme le lupus et tester des candidats médicaments, avec en outre des implants posés sous anesthésie, des prises de sang répétées et des prélèvements vaginaux quotidiens pendant au moins cinq jours. Le porteur annonce que ces injections "dureront entre 10 et 15 secondes". Les points limites retenus sont une perte de 25 % du poids de référence et le score clinique maximal. La plupart des souris sont tuées et 770 sont déclarées réutilisées : le porteur écrit que les souris en surnombre ou sans maladie induite peuvent être réaffectées à de la formation, et que celles qui ne développent pas la pathologie peuvent être réutilisées dans le même projet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments pour des maladies auto-immunes telles que le lupus. Pour ce faire, nous induirons à l’aide de molécules des maladies auto-immunes sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes, ou humanisées à l’aide cellules souches humaines et leurs dérivées provenant par exemple de sang de cordon ombilical, de moelle osseuse ou de sang périphérique humains ou murins. Différentes stratégies d’inductions pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament (biologiques, immunomodulateurs…) sur la progression de la maladie auto-immune mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans cet effet, dans le but de mieux prédire la réponse humaine aux traitements. Des souris sans maladies induites pourront également être utilisées comme contrôles négatifs dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques des maladies auto-immunes comme le lupus et à soutenir le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblées. L’utilisation de modèles murins immunodéficients, immunocompétents ou humanisés permet de modéliser différentes pathologies humaines, dans un contexte in vivo contrôlé, tout en tenant compte des spécificités du système immunitaire humain. Ainsi, ce projet permettra : -d’étudier la progression du lupus dans des modèles bien caractérisés, -d’évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de candidats médicaments à différents stades de développement, -de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des environnements immunitaires humanisés pertinents, -d’identifier des biomarqueurs de réponse ou de toxicité, -et de contribuer à une meilleure prédictibilité des résultats précliniques avant la transposition vers l’humain.
Procédures
Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Concernant les chirurgies (implants) la durée n’excédera pas 10 minutes. Elles seront réalisées sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. En parallèle, les candidats médicaments et molécules / cellules pour l'induction des maladies seront administrés afin d’évaluer leurs effets thérapeutiques. Les injections dureront quelques secondes et la fréquence sera définie selon le protocole d’étude. Des prises de sang pourront être réalisées pour évaluer les effets des traitements et caractériser la réponse immunitaire. Les fréquences de prélèvements seront définies dans le protocole d’étude. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Des prélèvements vaginaux pourront également être réalisés. Ils seront effectués quotidiennement pendant un minimum de cinq jours consécutifs, et si nécessaire, prolongés sur plusieurs semaines pour une évaluation complète du cycle œstral, notamment si les souris ne sont pas synchronisées. Ce prélèvement, très rapide, dure seulement quelques secondes. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre.
Impact sur les animaux
Les procédures prévues dans le cadre de ce projet peuvent entraîner diverses nuisances ou effets indésirables chez les animaux. Ces effets varient selon les modalités expérimentales, la nature des composés administrés et le statut immunitaire des souris (immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées). -Injection hydrodynamique intraveineuse de plasmides : peut engendrer un hématome et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une légère irritation locale transitoire, une inflammation minime ou du stress. -Implantation de capsules / implants : douleur, complications en lien avec la chirurgie. -Administration de traitements et induction des maladies : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées), amaigrissement progressif, troubles moteurs, lésions cutanées, atteinte des organes, altérations comportementales, œdèmes, douleurs articulaires ou encore altération de l’état général. - Prélèvements sanguins : hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû à la contention. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés dans la majorité des cas. Les animaux supplémentaires ou sur lesquels la maladie n’a pas été induite pourront être réallouer à de la formation.
Remplacement
Lorsque cela est scientifiquement pertinent, des alternatives in vitro seront envisagées afin de limiter l’utilisation d’animaux. Néanmoins, dans le cadre des pathologies auto-immunes, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro capable de reproduire fidèlement la complexité du système immunitaire humain ni ses interactions avec des composés thérapeutiques. L’utilisation de souris immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées demeure essentielle pour modéliser l’implication du système immunitaire, évaluer les effets des traitements et garantir la transposabilité des résultats. Ces modèles in vivo constituent donc un outil robuste, indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques et thérapeutiques du projet.
Réduction
Un total de 3220 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 70 études précliniques de 46 souris. Ce nombre de souris utilisées sera limité au strict nécessaire, en se basant sur l’expérience acquise dans les études antérieures et sur des considérations statistiques. Les effectifs par groupe seront déterminés selon la variabilité attendue des réponses, notamment immunitaires, et adaptés en fonction des objectifs : caractérisation phénotypique, réponse au traitement, suivi de biomarqueurs ou évaluation de la toxicité. En fonction des modèles pathologiques et de l’effet attendu, le nombre de souris par groupe pourra varier de 4 à 8. Certains animaux ne développant pas la pathologie attendue (groupe contrôle par exemple) pourront être réutilisés dans ce même projet ou utilisé en formation. Des études pilotes permettront également de valider certains protocoles ou dosages, avant d’engager des cohortes plus larges.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti- douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie suivi d’une euthanasie sans réveil (prélèvement terminal). Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue à partir d’un certain seuil. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie, une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites sont : -Perte de poids supérieur ou égale à 25 % du poids de référence (induction de la maladie) -Score clinique maximal atteint.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle préclinique de référence pour l’étude des maladies auto-immunes en raison de sa proximité génétique avec l’Homme (plus de 90 % de gènes orthologues), de sa physiologie bien caractérisée et de la disponibilité de lignées spécifiques adaptées à chaque pathologie. Selon les besoins, il est possible d’utiliser des modèles spontanés, chimiques ou humanisés via greffe de cellules sanguines humaines de patients atteints de maladies auto-immunes. Les lignées immunodéficientes permettent de reconstruire un système immunitaire humain chez la souris, pertinent pour évaluer la réponse à des traitements immunomodulateurs. Ces modèles sont essentiels pour étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes, évaluer de nouvelles approches thérapeutiques, et anticiper les effets secondaires immunitaires de façon prédictive. Les souris non humanisées seront incluses dans les études à partir de 6 semaines d’âge, âge correspondant à une maturité immunitaire et physiologique suffisante pour l’induction de pathologies et l’évaluation de traitements. Les souris humanisées seront quant à elles incluses à partir de 8 semaines, seuil à partir duquel une reconstitution immunitaire humaine stable et mesurable est généralement observée dans le sang périphérique.
Effets bénéfiques de la nutrition sur la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris obèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Un jeûne de 12 heures puis un gavage d'huile, un jeûne de 6 heures puis un gavage de sucre, une incision au bout de la queue avant chaque test pour prélever le sang : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 90 d'entre elles reçoivent 20 semaines d'alimentation riche en graisses, pour tester si des aliments enrichis en oméga-3 et en extraits de plantes renforcent l'immunothérapie contre le cancer du sein triple négatif chez des souris obèses. Identifiées par un poinçon à l'oreille, toutes reçoivent ensuite sous anesthésie une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire, puis 6 à 7 injections de traitement en 21 jours et une mesure de la tumeur tous les trois jours sous anesthésie. Le porteur retient des souris de 7 semaines parce que ce cancer "est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes", et écrit que l'étude "pourrait poser les bases de futures recherches chez l'Homme".
Objectifs
Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.
Procédures
• Une identification indivuelle par poinçonage de l’oreille sera appliquée aux 120 souris. • Trois groupes de 30 souris (90 souris) recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • Deux mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées brièvement dans un tube (moins de 2 min/souris). Les deux mesures seront réalisées à 16 semaines d’intervalle. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6 heures (le matin) avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (moins d’1 min/souris, contention incluse). Une petite incision à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée avant le test pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures (toute la nuit) avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (moins d’1 min/souris, contention incluse). Une petite incision à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée avant le test pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces deux tests seront effectués avec une semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi du cancer : - Avant l’injection des cellules cancéreuses, une injection du mélange d’anesthésiques sera réalisée dans l’abdomen de toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera donc sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur le plus précocément possible (toutes les souris vigiles, environ 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum soit entre J3 post injection des cellules et J7) - Traitement : 6 à 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection unique d’anesthésique pour toutes les souris (quelques secondes/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie profonde pour toutes les souris (30 sec/souris).
Impact sur les animaux
La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : Pour éviter d’avoir à recourir aux gavages quotidiens, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont directement ajoutés à la nourriture. Seules deux personnes expérimentées manipuleront les souris dès leur arrivée et tout au long de l’étude pour qu’elles s’habituent à leur présence.Une surveillance de tous les animaux sera mise en place deux fois par semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7 jours sur 7 après leur injection. A chaque passaque une vérification de l’état général des souris (apparence (pelage, posture, yeux, oreilles), comportement (activité, interactions, agressivité, réaction au toucher)) sera réalisée. De plus, un suivi du poids des souris serait réalisé une fois par semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite deux fois par semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule petite incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation forcée des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un médicament contre la douleur. Ensuite,une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la croissance de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les trois jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera quatre semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes
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- Oncologie
- Système immunitaire
Tuées à l'issue de chaque expérimentation pour le prélèvement de leurs organes de l'immunité, dont les ganglions et la rate, 450 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des lymphocytes B humains génétiquement modifiés ou leurs précurseurs, par la veine de la queue chez les adultes ou par injection dans le cœur chez des souriceaux de 2 jours, puis une prise de sang toutes les deux semaines, et éventuellement des immunisations et des greffes de cellules tumorales. Une mère peut refuser de récupérer un souriceau trop manipulé, et la taille des tumeurs greffées fait l'objet de points limites. Le porteur justifie le passage aux nouveau-nés par une meilleure prise de greffe, qui rend selon lui ses expérimentations "plus faciles à réaliser" et ses résultats "plus faciles à analyser".
Objectifs
L'objectif de ce projet est la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B humains ou leurs précurseurs puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer la capacité antitumorale de nos anticorps.
Bénéfices attendus
L'utilisation des souris immunodéficientes est un excellent modèle pour notre projet. En effet, ces souris ne possèdent plus de lymphocytes et ne peuvent alors plus détruire les cellules étrangères injectées. Elles sont donc capables de recevoir différentes cellules humaines, comme des lymphocytes B qui produiront des anticorps ou même des cellules précurseuses des lymphocytes, qui pourront alors produire des lymphocytes B humains dans les souris. Avec ce projet, nous testerons donc la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé (essai clinique de phase I) et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
La greffe des cellules sera unique et se fera soit par injection intraveineuse dans la veine de la queue chez les souris adultes soit par injection intracardiaque chez les souriceaux nouveau-nés. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Enfin des immunisations et des greffes de cellules tumorales pourront être appliquées sur les animaux si la reconstitution immunitaire a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse de cellules. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les autres nuisances attendues viendront de l'injection intracardiaque du nouveau-né. En effet, la mère pourrait ne pas vouloir récupérer son souriceau si celui a été trop manipulé. Des efforts afin de masquer les odeurs liées à la manipulation seront réalisés pour favoriser la réadoption des souriceaux par leur mère. Des effets indésirables pourront également survenir après les greffes de tumeurs, des points limites concernant la taille des tumeurs seront mis en place afin d'éviter trop d'inconfort et de souffrance aux souris.
Devenir
A l'issue de chaque expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution du système immunitaire humain dans la souris ainsi que sur le développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules précurseuses du système immunitaire. Ces dernières sont en effet capables de se différencier dans la moelle osseuse de la souris après injection et de fabriquer dans ces souris diverses populations immunitaires humaines, dont les lymphocytes B. Il est actuellement possible de différencier ces précurseurs in vitro mais uniquement vers quelques voies données, et non vers la différenciation en lymphocyte. Aucun modèle in vitro ne permet une différenciation complète vers toutes les lignées du système immunitaire. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon des critères généraux permettant de quantifier le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes, ce qui permet donc d'éviter le rejet des cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé de prise de xénogreffes, que ce soit des lymphocytes B humains ou leurs précurseurs. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de contamination par divers pathogènes car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Dans un premier temps, l’expérimentation sera commencée chez des animaux de 4 à 6 semaines. En effet, une meilleure prise de greffe des cellules humaines a lieu chez les animaux jeunes, en particulier pour les lymphocytes. Dans un second temps, l’expérimentation sera commencée chez les souriceaux nouveau-nés de 2 jours. En effet, il est maintenant démontré que la prise de greffe des cellules humaines est meilleure quand les cellules sont injectées chez les nouveau-nés, ceci rendant nos expérimentations plus faciles à réaliser et nos résultats plus faciles à analyser (plus de cellules humaines dans la souris donc des effets plus facilement monitorables).
Raffinement du modèle d’allergie alimentaire aux gliadines de blé chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Trois injections d'allergène à une semaine d'intervalle, puis un gavage qui déclenche la réaction : les souris présentent alors du grattage, des douleurs abdominales et un choc anaphylactique avec chute de la température corporelle. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récupérer les tissus destinés aux analyses immunologiques. Le projet est présenté comme un raffinement, puisqu'il vise à remplacer l'injection intrapéritonéale, que le porteur juge "plus douloureuse et peu performante", par une injection sous-cutanée, et le gavage par une administration à la micropipette. Comparer ces voies suppose pourtant de maintenir un groupe sensibilisé par voie intrapéritonéale et de provoquer des chocs anaphylactiques dans les quatre sous-groupes de vingt souris.
Objectifs
Les allergies sont répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. L’allergie au blé est l’une des allergies alimentaires les plus fréquentes. Au sein de notre laboratoire, nous avons mis au point différents modèles d'allergie alimentaire, mais dans un soucis de raffinement nous aimerions améliorer ce modèle en testant des voies de sensiblisation à l'allergène différentes (voie sous cutanée VS intra péritonéale) mais aussi différentes voies de déclenchement ou challenge allergique (MDA : Micropipette guided Drug oral Administration VS gavage oral). Ensuite, les différentes voies de sensibilisation et/ou de déclenchement seront comparées en étudiant les variables habituellement observées dans l'allergie alimentaire (Immonoglobulines E spécifiques, perméabilité intestinale, mécanismes immunologiques).
Bénéfices attendus
Ce projet à pour objectif d'essayer d'améliorer et de raffiner notre protocole d'allergie alimentaire aux gliadines de blé mis en place dans notre laboratoire en tentant de remplacer la sensibilisation par voie intra péritonéale, plus douloureuse et peu performante, par une sensibilisation par injection sous cutanée. Mais aussi en tentant de remplacer la provocation par gavage oral via une sonde qui est souvent douloureuse et peut provoquer des lésion de l'œsophage par une alternative moins invasive : la MDA pour Micropipette guided Drug oral Administration.
Procédures
Pour le groupe sensibilisation par voie intrapéritonéale IP : 3 injections par voie intra périntoneale à 1 semaine d'intervalle. Pour le groupe sensibilisation par voie sous cutanée SC : 3 injections par voie sous cutanée à 1 semaine d'intervalle. Pour le sous groupe provocation par gavage : 1 gavage oral. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (provocation), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.
Impact sur les animaux
Légères : inflammation légère au niveau du point d’injection, gêne abdominale suite à l’injection IP lors de la sensibilisation. Modérées : grattage, douleurs abdominales, choc anaphylactique (baisse de la température corporelle).
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, dans le cas de l’étude de l’influence des différentes voies d'exposition, le modèle in vivo reste irremplaçable. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, les allergies alimentaires sont caractérisées par des symptômes que seuls des modèles animaux, et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.
Réduction
Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur des tests statistiques et de la variabilité individuelle rencontrée lors de nos anciens protocoles, le nombre de souris a été déterminé à 20 souris par sous-groupe.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permettent de minimiser l'inconfort et la douleur.L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence d’un ou deux signes cliniques notables, le responsable du projet et la cellule du bien-être animal sont informés. Une surveillance accrue de l’animal est mise en place. En Présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, la cellule du bien-être animal et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendront la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à la mise à mort. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles et males. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les souris Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et 4 semaines de vie au début des procédures. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.
Impact des bactéries sur la réponse immunitaire dans le contexte d’un cancer du poumon orthotopique murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour savoir si les bactéries passées dans le sang après une chimiothérapie modifient la réponse immunitaire, 504 souris reçoivent des cellules cancéreuses du poumon dans une veine, puis des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant 33 jours. Elles vont toutes être tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un, cinq ou dix jours après une injection unique de cisplatine, pour prélever leurs poumons. Le porteur signale des difficultés respiratoires liées à la tumeur pulmonaire, une perte de poids due à la chimiothérapie et des diarrhées dues aux antibiotiques. La taille des groupes, sept animaux, est justifiée par la puissance statistique et par le fait qu'une seule personne doit pouvoir prendre en charge l'expérience, répétée trois fois.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. La chimiothérapie est un traitement fréquemment utilisé chez les patients. Plusieurs études ont montré qu’un traitement par chimiothérapie induisait une entrée de bactéries dans le flux sanguin mais l’impact de ces bactéries sur la réponse immunitaire n’a pas encore été étudié. Le cisplatine est une chimiothérapie couramment utilisée dans le traitement du cancer du poumon dont l’action est dépendante des cellules immunitaires Ainsi, nous voulons étudier l’impact des bactéries sur l’efficacité de la réponse immunitaire après cisplatine. En particulier, nous allons étudier la relation entre bactéries et le système immunitaire de façon plus vaste afin de voir toutes les conséquences de l’entrée de bactéries sur la chimiothérapie et la tumeur.
Bénéfices attendus
Le cancer est un problème de santé public majeur. Il est donc nécessaire de trouver des traitements efficaces et bien supportés par le patient. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux reçoivent les cellules tumorales du cancer du poumon non à petites cellules murin en intra-veineuse (1 minute pour l’injection). Les souris recevront des antibiotiques dans leur eau de boisson pendant 33 jours maximum. Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes) une seule fois. 1, 5 et 10 jours après le traitement par chimiothérapie, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort).
Impact sur les animaux
Le développement d’un modèle orthotopique du cancer du poumon peut conduire à une difficulté respiratoire. La chimiothérapie utilisée peut entraîner une perte de poids chez les souris. Les animaux pourraient ressentir une douleur lors de l’injection en intra-veineuse (IV) ou intra-péritonéale (IP). Les animaux pourraient développer de la diarrhée due au traitement par antibiotique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répéterons les expériences 3 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui le plus adapté en raison de la taille des groupes.
Raffinement
L’animal aura un temps d’acclimatation de minimum une semaine avant toute manipulation par l’applicateur du projet. Afin d’améliorer le bien-être des animaux, les souris ne seront pas isolées. De plus, de l’enrichissement sera présent dans les cages tel que des jouets, des frisotis pour leur nidification et des tubes pour qu’elles puissent se cacher. Des points limites ont été définis, prenant en compte les caractéristiques de l’étude, et un arbre décisionnel basé sur l’attribution de points lié au degré de sévérité des points limites a été mis en place permettant l’arrêt des souffrances suivant des critères définis.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.
Validation d’un nouveau modèle murin de shigellose carencé en ascorbate
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Nés de dix femelles reproductrices elles aussi privées de vitamine C, 480 souriceaux subissent une carence en ascorbate de leur naissance à leur mise à mort, qui peut freiner leur croissance et provoquer une ataxie. Au total 2 341 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après deux mises à jeun de six heures, elles sont infectées par Shigella par voie rectale ou orale, ce qui peut provoquer sur 48 heures une diarrhée sanglante, une inflammation de l'anus et une perte de poids, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Les souriceaux dont le génotype ne correspond pas à celui attendu sont tués d'emblée, en dehors de toute expérience.
Objectifs
Les diarrhées associées à des infections bactériennes se caractérisent par une gastro-entérite. Elles se transmettent par voie féco-orale, notamment dans les pays en voie de développement ou chez les voyageurs. Chaque année, elles tuent plusieurs millions de personnes, essentiellement des enfants de moins de 5 ans. La shigellose, causée par la bactérie Shigella, est responsable d’une vaste majorité de ces cas. Il n’existe à l’heure actuelle aucun vaccin commercialisé protégeant de ses infections, mais de nombreuses approches sont en cours d’étude. En effet, l’absence d’un modèle animal d’infection pertinent ne permet pas d’évaluer leur efficacité. Nous évaluons actuellement l’impact de la carence en ascorbate (plus communément appelé vitaine C) sur la sévérité de l’infection par Shigella, en utilisant des souris génétiquement modifiées ne synthétisant pas la vitamine C, à la différence des souris sauvages. Nos résultats indiquent une augmentation de l’invasion de la muqueuse colique par Shigella en carence d’ascorbate, mais les animaux récupèrent de l’infection au bout de 48h. Récemment une équipe américaine a mis en évidence qu’une mutation sur un autre gène augmentait la sensibilité des souris à l’infection par Shigella. Dans ce modèle, les infections sont plus marquées que chez les souris sauvages, toutefois, l’infection est également transitoire. Dans le cadre de ce projet, nous confirmerons ces résultats avec ce même modèle de souris génétiquement modifiées et généreront une nouvelle lignée murine combinant les deux mutations afin d’évaluer si une aggravation des symptômes de shigellose est observée. La virulence de Shigella a été étudiée depuis de nombreuses années dans divers modèles animaux qui, même imparfaits ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la virulence de ce pathogène. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet de récapituler l’infection du colon suite à l’ingestion de Shigella. Notre nouveau modèle de souris doublement muté pourrait permettre de suivre les étapes précoces et tardives des infections par Shigella. L’objectif de ce projet est de caractériser et valider ce nouveau modèle murin dans le cadre d’une infection par Shigella via la voie intrarectale et per os et éventuellement le valider pour l'évaluation de l’efficacité de candidats vaccins actuellement en phase de développement.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun vaccin commercialisé protégeant des infections par Shigella, responsable de la mort de plusieurs millions de personnes chaque année. Ceci s’expliquant notamment par l’absence d’un modèle animal pertinent d’infection permettant non seulement de récapituler la shigellose humaine dans son entièreté et ainsi de suivre les différentes étapes précoces et tardives de l’infection, mais de fait d’évaluer l’efficacité de vaccin candidat. Dans notre projet, la validation d’un nouveau modèle murin, doublement muté, constituerait une avancée majeure dans la compréhension des différents mécanismes mis en place de la virulence de Shigella ; mais proposerait aussi une nouvelle voie d’évaluation de candidats vaccin actuellement en phase de développement.
Procédures
480 animaux générés ainsi que les 10 femelles reproductrices subiront de leur naissance à leur mise à mort (3 ou 4 semaines d’âge selon le groupe) une carence modérée en ascorbate via une dose sous-optimale d’ascorbate dans l’eau de boisson . Les animaux générés seront soumis à un génotypage sur une biopsie de queue. Tous les animaux subiront avant l’infection par Shigella ou le véhicule deux mises à jeun. La première durera 6h et la seconde 6h. Tous les animaux subiront les actes suivants : Contention et préhension; les gavage et injection sur animal vigile seront d'une durée inférieure à 1 minute; L'injection sous anesthésie gazeuse s'executera pendant une durée de 2 minutes maximum. Enfin, chaque animal se vera prélever un volume sanguin terminal sous anesthésie. Ce prélèvement se fera sur une durée inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
En relation avec la phase d’induction de carence modérée, des précédentes études ont montré que celle-ci avait un impact sur le développement de l’animal au niveau phénotypique (petite taille) et pouvait induite des symptômes liés au scorbut comme un phénomène d'ataxie. La biopsie de queue pour génotypage peut entrainer un stress ainsi qu'un léger inconfort chez les animaux. La mise à jeun provoquer chez ces derniers un stress et une légère perte de poids. Suite à l’infection par la bactérie Shigella, les points suivants pourraient être observés sur 48h (basé sur les précédents travaux réalisés) : - perte de poids - présence de diarrhée sanguinolente - inflammation de l’anus - présence de mucus sur l’anus - vivacité générale de l’animal altérée. Lors des procédures de gavage, il pourrait être observé une dyspnée secondaire à une fausse route induite par l'acte.
Devenir
Pour ce projet, les animaux ayant un génotype non attendu seront mis à mort ainsi que ceux à des fins de prélèvements post mortem.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo d’un nouveau modèle faisant suite à d’autres validations réalisées également in vivo mais qui jusqu’à aujourd’hui n’ont pas permis de récapituler totalement l’infection du colon suite à l’ingestion de Shigella. Il s’inscrit dans une continuité de compréhension des mécanismes de la virulence de ce pathogène et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens alternatifs que l'animal vivant. De plus, l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle de choix pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine, ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. Enfin, les modèles cellulaires d’infection de Shigella ne rendent pas compte de la modulation des mécanismes de virulence de ces pathogènes dans le contexte inflammatoire et ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’objectif in fine de ce projet étant d’évaluer des candidats vaccins, le recours à la souris est indispensable.
Réduction
Pour ce projet d’une durée de 5 ans, chaque procédure a été revue avec un biostatisticien afin d'établir le nombre d'animaux minimum nécessaire et suffisant pour atteindre l’objectif fixé de manière fiable statistiquement et robuste. Cet effectif repose également sur notre connaissance du modèle et basé sur les résultats de précédents travaux. Enfin, l’utilisation des deux sexes permet la genèse de moins d’animaux pour atteindre l’effectif total, participant au principe des 3R.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées de façon optimale pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Pour se faire, des critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse ont été définis, mis en place et seront pris en compte via des grilles de scoring. Ils seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (matériel de nidification à base de coton compressé et de frisure de papier, barreau à ronger, tunnel transparent de manipulation), et disposeront de nourriture et d’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Dans le cadre des infections par injection, les animaux seront préalablement anesthésiés afin de palier à tout stress. De même, tout acte de prélèvement sanguin terminal se fera sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le cobaye et la souris sont les seuls modèles animaux permettant d’étudier la virulence de Shigella. Or, le cobaye ne permet pas de tester ni des infections prolongées ni des candidats vaccin. En effet ce test nécessite une immunisation des animaux pendant 8 semaines, âge auquel les cobayes ont atteint l’âge adulte et ne sont plus sensibles à l’infection. L’objectif in fine de ce projet étant d’évaluer des candidats vaccins, le recours à la souris est indispensable. L’ensemble des données dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle de choix pour mener à bien ce projet. Etant une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine, une analyse comparative et critique des résultats obtenus pourront être faites. Pour ce projet, les animaux seront utilisés dès la naissance. En effet, une infection par Shigella est plus efficace chez des souriceaux jeunes (environ 3 semaines). Utiliser les animaux à leur naissance permettra l’induction d'une carence modérée en ascorbate avant infection à l'âge de 3 semaines. De plus, d'un point de vue clinique, l'infection par Shigella touche majoritairement des enfants de moins de 5 ans. L'utilisation de souriceaux nous permettra ainsi d'être le plus représentatif possible. AVENANT : En se basant sur les résultats obtenus lors de précédents travaux sur la même thématique, les animaux seront infectés à 5 semaines d'âge, permettant une conciliation entre carence établie et sensibilité à l'infection tout en restant représentatif du jeune enfant.
Rôle de la reprogrammation métabolique des cellules myéloïdes dans le remodelage cardiaque post-ischémique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Nourries huit semaines au régime gras, opérées pour provoquer un infarctus du myocarde, irradiées treize minutes avant une greffe de moelle osseuse, parfois privées de leur rate, 5 700 souris vont être utilisées et toutes tuées. 3 540 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 2 160 d'un niveau sévère. L'infarctus provoqué détruit une partie du muscle du ventricule gauche, l'irradiation entraîne fatigue, perte de poids et troubles digestifs, et une des lignées employées porte un déficit immunitaire. Le porteur écrit avoir calculé l'effectif au plus juste par des tests de puissance, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 5 700 souris.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès mondiale et posent un défi croissant aux systèmes de santé. La gestion des facteurs de risque, comme l'hypercholestérolémie, réduit ce fardeau, mais le rôle du système immunitaire est peu connu. Ce projet a pour but de caractériser les effets cellulaires et moléculaires d'un régime riche en lipides, court et transitoire, sur le remodelage cardiaque post-ischémique et de tester une approche thérapeutique pour limiter les dommages cardiaques délétères induits par l'alimentation. Les objectifs sont: 1. Caractériser les effets de la pré-exposition au régime riche en lipides sur le remodelage cardiaques à différents temps (avant et après l'infarctus) chez des souris mâles et femelles. 2. Étudier l’impact de l’exposition au régime riche en lipides sur les réponses immunitaires innées. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’insuffisance cardiaque ischémique. 4. Tester des agents pharmaceutiques pour inverser la reprogrammation pathogénique des progéniteurs de la moelle osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes du risque résiduel à long terme causé par une alimentation riche en lipides, et pourrait permettre de développer des nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules myéloïdes.
Procédures
Exposition diète riche en matières grasses - durée 8 semaines // Infarctus du myocarde - durée 30 minutes // Traitement pour une déplétion de la microbiote avec un cocktail d’antibiotiques // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection d’anticorps - durée 1 minute, chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie ou Injection d’agents pharmaceutiques - durée 1 minute, 3 fois par semaine durant les 8 semaines postérieures au régime gras // Transplantation de la moelle osseuse - irradiation dure 13 minutes, transplantation dure 10 minutes. // Splénectomie (ablation de la rate)- durée 30 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Le prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire peut induire une douleur légère de courte durée au point du prélèvement. 5/ La transplantation de moelle osseuse par voie rétro-orbitaire peut provoquer une potentielle douleur de courte durée au point d’injection. 6/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires. Les infarctus du myocarde vont entraîner la mort d’une partie du tissu cardiaque ventriculaire gauche. 7/ Les souris de la lignée Rag2 -/- présentent un phénotype dommageable car elles ont un déficit immunitaire. 8/ L’irradiation peut entraîner des effets secondaires tels que fatigue, perte de poids et troubles digestifs transitoires.
Devenir
À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. Ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Ces modèles sont également nécessaires pour la validation des stratégies thérapeutiques pour mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’étude des maladies cardiovasculaires. Les souris génétiquement modifies (gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. En plus, la souris permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grâce à ces modèles de souris, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce ayant des temps de reproduction plus longs et avec des nombre de naissances moins importants. Ce modèle murin est bien prédictif de la pathologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines et chez lesquelles le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la puberté n’est pas systématiquement atteinte, ce qui peut induire un biais car les hormones sexuelles jouent un rôle dans le remodelage cardiaque. Dans le cadre de ce projet, afin d’induire une immunité entraînée, il est important de pré exposer les souris à un régime riche en matières grasses pendant 2 semaines a un jeune âge (6 semaines). Ensuite, l’infarctus sera induit quand les souris arrivent à un âge de 16 semaines. Faire un infarctus avant les 10 semaines peut réduire fortement la survie des souris.
Evaluation de l’immunogénicité de la protéine VP2 du virus de la peste équine chez les équidés
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
15 chevaux vont être utilisés, chacun subissant vingt-trois prises de sang et trois injections vaccinales, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Répartis en trois groupes de cinq selon la dose d'antigène, ils reçoivent deux injections à cinq semaines d'intervalle puis un rappel un an plus tard, pour mesurer la production d'anticorps contre le virus de la peste équine. Le porteur indique que ce candidat vaccin a déjà protégé totalement des souris infectées, et retient le cheval comme espèce cible la plus sensible au virus. Tous les chevaux sont gardés en vie et réutilisés dans d'autres travaux de recherche, et leurs prélèvements serviront de matériaux de référence au laboratoire.
Objectifs
La peste équine est une maladie des équidés causée par un virus figurant sur la liste des maladies à déclaration obligatoire de l'Organisation mondiale de la santé animale en raison de son taux de mortalité élevé (~95 %) chez les chevaux. Ce virus est endémique dans les zones tropicales et subtropicales d'Afrique, mais s'est propagé à plusieurs reprises hors de son habitat africain au 20eme siècle, provoquant de graves épidémies dans le bassin méditerranéen et en Europe et, plus récemment, jusqu'en Thaïlande. Le virus est transmis d’un animal à un autre par des moucherons piqueurs hématophages. Les facteurs liés au changement climatique (températures, vent) peuvent permettre l'introduction de ces vecteurs dans des régions jusqu’alors indemnes, et accroître le risque d’introduction du virus, comme cela a été montré pour les virus de la fièvre catarrhale du mouton (FCO) et de la maladie hémorragique épizootique (MHE), qui sont aussi vectorisés par les moucherons. La FCO et la MHE ont émergé en Europe et ré-émergent chaque année pendant la période d’activité de ces moucherons. Les mesures pour prévenir et traiter la peste équine restent limitées. Bien qu'un vaccin utilisant le virus de la peste équine atténué, c’est-à-dire non infectieux, soit disponible et utilisé en Afrique du Sud, il existe un potentiel de retour à la virulence, et son utilisation en Europe n’est pas approuvée. Le but de cette étude est de développer des vaccins innovants pour la peste équine. Ces vaccins sont constitués de protéines formant une nanostructure, sur laquelle sont greffés des antigènes. Les antigènes sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation). L’antigènes d’intérêt pour cette étude est la protéine virale VP2, connue pour induire une réponse immunitaire chez l’animal infecté et ainsi de protéger complétement l’animal vacciné d’une infection. Ces candidats vaccins ont été testés sur des souris sensibles à l’infection et la protection des souris vaccinées a été totale. L’objectif de ce projet est maintenant de tester ces candidats vaccins dans l’espèce cible la plus sensible au virus, qui est le cheval. Dans le but de déterminer la meilleure composition du vaccin permettant d’induire la meilleure production d’anticorps, 3 doses d’antigènes seront testées. Au total, 3 groupes de 5 chevaux feront l’objet de cette étude.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer si le candidat vaccin permet la production d’anticorps contre le virus de la peste équine jusqu’à 1 an après la vaccination et ainsi protéger les équidés lors d’une infection qui peut leurs être fatale. De plus, les prélèvements issus de cette expérimentation serviront de matériaux de référence pour les activités du laboratoire.
Procédures
Les chevaux recevront 2 injections du vaccin (1 minute) à 5 semaines d’intervalle et une une injection un an après la primo-vaccination (1 minute). Au total, 23 prises de sang (2 minutes par prise de sang) seront réalisées par cheval lors de cette procédure.
Impact sur les animaux
Les chevaux peuvent ressentir une légère douleur lors des injections du vaccin et lors des prises de sang de contrôle. Il existe un risque très faible de formation d’hématome à la suite de la ponction veineuse. Un gonflement local au niveau du point d’injection du vaccin peut être observé ainsi qu’une augmentation transitoire de la température.
Devenir
Les chevaux seront tous gardés en vie et réutilisés pour d’autres activités de recherche.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif pour tester l’efficacité du vaccin pour la production des anticorps spécifiques sur l’espèce cible la plus sensible au virus : le cheval. Ce vaccin a été précédemment testé sur le modèle murin avec succès.
Réduction
Au total 15 chevaux seront utilisés pour cette procédure et répartis dans 3 groupes distincts (3 doses différentes de vaccins). Par lot, le nombre de chevaux a été fixé à 5. Le nombre de 5 chevaux par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure par des tests statistiques non paramètriques.
Raffinement
La vaccination sera réalisée par un vétérinaire et les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel expérimenté avec une contention légère (tenue au licol) par un animalier familier au sein de leur groupe pour limiter le stress. Un vétérinaire, praticien hospitalier spécialisé en médecine équine, sera présent lors de la primo vaccination et du rappel et restera sur site pendant les 24 heures suivantes, pouvant ainsi intervenir en cas de nécessité. Il sera également contacté en première intention en cas d’effets indésirables pendant toute l’expérimentation. Puis les animaux seront suivis les 5 jours suivant chaque injection du vaccin avec notamment une prise la température rectale des animaux matin et soir, un suivi visuel au niveau du point d’injection et un relevé de toutes postures / comportement anormal (perte d’appétit, abattement, difficulté à baisser l’encolure). Les animaux seront hébergés en groupe en stabulation avec une alimentation 100 % fourrage durant les 5 jours suivant les injections de vaccin et au pâturage en groupe le reste du temps. Si un effet indésirable devait survenir, la prise en charge sera assurée par le vétérinaire et serait la suivante : - injection en urgence de cortico-stéroides et d’adrénaline en cas d’anaphylaxie (réaction quasi-immédiate avec difficulté cardio-respiratoire, sudation, douleur abdominale, tremblements…), - injection de corticoïdes, s’il s’agit d’une réaction de type allergique (démangeaison, chaleur au point d’inoculation, gonflement voire abcès), - des soins locaux seront réalisés en cas d’inflammation marquée, - et des anti-inflammatoires oraux seront administrés en cas de douleur. Les posologies appliquées seront celles recommandées par le vétérinaire. L’expérimentation serait alors arrêtée.
Choix des espèces
La peste équine est un virus d’importance sanitaire dans les populations équines. L’espèce cible pour ce candidat vaccin est donc le cheval. Pour cette étude, des animaux adultes seront inclus afin qu’ils aient un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps.
Le rôle des macrophages dans les défenses immunitaires dirigées contre le cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, des injections intrapéritonéales et intraveineuses de traitements, puis deux mesures de tumeur par semaine au pied à coulisse. Le porteur annonce une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, l'objectif restant de comprendre comment un type de macrophage récemment décrit participe aux défenses contre le cancer du sein. Sur le remplacement, il affirme que la complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires rend l'expérimentation animale "indispensable", après des modélisations informatiques et des cultures cellulaires menées en amont.
Objectifs
Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à se défendre. On en trouve en grande quantité dans les tumeurs. Notre équipe a découvert un nouveau type de macrophages dans les cancers du sein. Au début du cancer du sein, ces macrophages aident d'autres cellules de notre système de défense (les lymphocytes) à détruire les cellules cancéreuses. Mais si la tumeur continue de se développer, les macrophages peuvent arrêter de fonctionner correctement, ce qui rend nos défenses moins capable de combattre la tumeur. Nos buts sont : 1. Comprendre comment ces macrophages aident à combattre le cancer. 2. Étudier ce qui les empêche de bien fonctionner.
Bénéfices attendus
Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à combattre le cancer. Les scientifiques les voient comme des cibles importantes pour les traitements contre le cancer. Notre projet vise à comprendre comment ces cellules aident à lutter contre le cancer pour trouver de meilleurs traitements.
Procédures
1- biopsie de la queue (5 secondes/souris). 2- Injection sous-cutanée de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (5 secondes/souris). 3- Injection intrapéritoneale de différents traitements (5 secondes/souris). 4- Injection intraveineuse de différents traitements (5 secondes/souris). 5- Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse 2 fois par semaines (20 secondes/souris)
Impact sur les animaux
- biopsie au niveau de la queue induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - injection intrapéritonéale de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Injection intraveineuse de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Anesthésie générale lors de la greffe de tumeur entraînerant un léger stress de courte durée. - Injection sous-cutanée de tumeurs entraînerant une douleur légère de courte durée. - La croissance des tumeurs entraînerant une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque expériences pour analyser les tissus cancéreux et pour analyser les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à l'issue de leur période reproductive.
Remplacement
La complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires ne peut être modélisée de manière complète in vitro, rendant l’expérimentation animale indispensable. Toutefois, des modélisations informatiques et des cultures cellulaires ont été réalisées en amont afin de limiter autant que possible l’usage d’animaux.
Réduction
Nous utilisons des tests statistiques adaptés pour réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour mener à bien ce projet tout en assurant des résultats interprétables. Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques sur chaque animal permettant de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences.
Raffinement
Afin de minimiser l'impact des procédures sur le bien-être animal, nous anesthésions les souris dans tous les protocoles incluant des injections susceptibles de causer des douleurs. Nous réalisons une surveillance rapprochée des animaux et nous avons établis des points limites adaptés pour réduire leur souffrance. Des points limites intermédiaires sont aussi mis en place lorsque les animaux présentent des premiers signes de douleur ou de détresse: nous placerons si nécessaire de la nourriture gélifiée dans les cages. Enfin si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour la recherche en immunologie et en thérapeutique du cancer. Sa grande homologie avec l’humain permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes pour étudier un système immunitaire mature et une croissance tumorale adaptée.
Etude de l’influence de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Immobilité, prostration, apathie, ou perte de plus de 20 % du poids : ces signes déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 1 340 souris vont être utilisées, 528 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 812 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever poumons, tissu nasal, rate, iléon, caecum et côlon. Une colite leur est provoquée par un agent chimique dans l'eau de boisson ou par gavage de la bactérie Citrobacter rodentium, avec diarrhée, sang dans les selles et perte de poids, avant une infection par un virus respiratoire ou trois vaccinations à trois semaines d'intervalle. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur sera donné, le porteur indiquant que ces traitements perturberaient les réponses immunitaires qu'il mesure.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer l’influence de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire causée par l’infection de différentes souches de virus respiratoires ou la vaccination chez la souris. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont caractérisées par une inflammation chronique de la muqueuse intestinale. Les patients qui ont une inflammation intestinale ont une réponse immunitaire déréglée et il a été démontré qu’ils sont plus suceptibles de developper des infections par des virus respiratoires et qu’ils ont aussi plus de risque de présenter des complications après infection. Il est désomais bien établi qu’il existe une communication entre le système digestif et le système respiratoire. Notre objectif est de mieux comprendre l’influence d’une inflammation intestinale sur le developpement des réponses immunitaires après une infection pulmonaire à des virus respiratoires mais aussi après vaccination contre ces virus notamment ceux qui induisent la grippe ou la bronchiolite. Afin d’étudier les effets de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire, nous induirons une inflammation intestinale chez les souris, grâce à un agent chimique ou infectieux, qui modélisera une maladie inflammatoire chronique intestinale. Différents modèles d’inflammation intestinale seront testés car ils induisent des réponses différentes. Une fois l’inflammation intestinale établie, les souris seront infectées ou vaccinées et la réponse immunitaire muqueuse (nasale, pulmonaire, intestinale) et dans le sang sera ensuite évaluée.
Bénéfices attendus
La réponse immunitaire des patients atteints de maladies inflammatoires chronique de l’intestin est modifiée et les sujets sont plus susceptibles à des inflections notamment respiratoires et leur réponse à des vaccins peut aussi varier. Notre projet vise à étudier par quels mécanismes l’inflammation intestinale peut moduler la réponse immunitaire respiratoire. Nous regarderons l'immunité au niveau des muqueuses et dans le sang. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances dans ces maladies complexes et pourra permettre d’améliorer la prise en charge des patients et d’optimiser les thérapeutiques. Ces résultats seront également potentiellemnt applicables à des sujets présentant une inflammation intestinale induite par des infections entériques ou dans le cadre du syndrome de l’intestin irritable. Suite aux résultats obtenus dans ces expériences animales, nous pourrons envisager de confirmer les résultats lors d’une étude chez l'homme.
Procédures
L'inflammation intestinale sera générée soit par un agent chimique dans l’eau que les souris boiront, soit par gavage avec la bactérie Citrobacter rodentium. Pour le suivi de l'inflammation, des prélèvements de sang et de fèces seront réalisés pour doser des anticorps et différents marqueurs inflammatoires. Le prélèvement de sang au niveau de la joue dure 30 secondes. Pour le prélèvement de fécès, les souris seront isolées dans des boîtes individuelles. Le mouvement des souris qui y seront enfermées n’est pas entravé et l’isolement n’excèdera pas 20 minutes. Ces prélèvements seront fait trois fois lors de colite et infection ou sept fois lorsque les souris auront une colite puis une vaccination puis un challenge, avant chaque étape. Les souris seront soit infectées une fois par des virus respiratoires, soit elles seront vaccinées 3 fois à trois semaines d’intervalle. Pour ces gestes, les souris seront ansthésiées pour leur confort et éviter de fausses routes, le geste dure 30 secondes maximum. Suite à l'infection, nous euthanasierons les souris à plusieurs interavalles de temps (J1, J3, J7, J14 et J21). Dans certaines expériences clés, les souris vaccinées seront ensuite infectées afin de déterminer la protection induite par le vaccin. Avant la première immunisation, un jour avant chacune des autres immunisations et un jour avant la mise à mort, des prélèvements de fèces, sang et lavages vaginaux seront aussi effectués afin de mesurer les réponses anticorps dans ces prélèvements. Les prélèvements vaginaux seront effectués sur les souris femelles avec une pipette pour liquide visqueux pour doser les anticorps sécrétés au niveau des muqueuses. Lorsque l’on veut analyser la permabilité intestinale, les souris seront gavées avec un agent qui permet de visualiser la perméabilité de l'intestin, 4 heures avant la mise à mort. Ce geste sera réalisé une seule fois. Lorsque l’on veut analyser certaines cellules spécifiques de la mémoire immunitaire dans les organes, une injection intraveineuse avec un anticorps fluorescent sera réalisée 3-5 minutes avant la mise à mort. Cette injection se fera à l’aide d’un tunnel fixé à la paillasse. La queue sera légèrement chauffée avec une lampe rouge durant 2 minutes. Ensuite, la queue sera rapidement désinfectée et un petit volume de solution saline contenant l’anticorps sera injecté. Cette injection sera réalisée sur souris vigile.
Impact sur les animaux
Les souris pouront, lors de la colite, avoir une perte de poids par rapport au poids initial, une diarrhée, du sang dans les selles. Les animaux peuvent diminuer leur toilettage et leur activité ainsi que s'isoler et changer leur posture. En plus de ces paramètres, suite à l’infection par les virus respiratoires ou la vaccination, la température corporelle peut être augmentée. Après l’infection voire aussi la vaccination, les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus ou vaccin, une accélération du rythme respiratoire, une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus ou du vaccin. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever des organes (poumons, tissu nasal, rate, iléum, caecum, colon) et des fluides muqueux comme les lavages venant des poumons et nasaux. Ces prélévements permettront d’analyser les réponses immunitaires locales et systemiques.
Remplacement
L’étude du dialogue entre l’intestin, les poumons et le système immunitaire est complexe. Ces systèmes biologiques imposent le modèle animal pour valider les hypothèses; il n’existe pas aujourd’hui de modèle cellulaire récapitulant tous les paramètres du tube digestif, du système respiratoire et du système immunitaire.
Réduction
Le design des expériences sera optimisé afin de minimiser le nombre de souris utilisé dans les groupes contrôles. Lors de chaque expérience, nous inclurons donc le maximum de groupes expérimentaux pour un groupe contrôle, tout en se veillant que les expériences restent réalisables par les expérimentateurs. La répétition des expériences sera réalisée au maximum trois fois lorsque des réponses immunitaires significativement plus élevées seront observées dans le groupe experimental que dans le groupe contrôle. Nous aurons 5 animaux par groupe conformément à nos expériences précédentes au laboratoire; c'est le nombre minimal nécessaire pour avoir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement durant l’induction de l'inflammation intestinale, après infection ou vaccination. L’immobilité, la prostration, l’apathie, ainsi qu’une perte de poids de plus de 20% du poids seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Etant donné que l’on analyse des réponses inflammatoires, nous ne pouvons pas donner d’anti-douleurs ou anti-inflammatoires qui pourraient perturber les réponses immunitaires des souris. Nous surveillerons l'apparition des points limites et appliquerons la procédure approprié. Lors de l'infection et de la vaccination par voie nasale, les souris seront anesthésiées par kétamine-Xylazine.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour les interactions poumon-intestin. Les souris auront entre 7 semaines et 16 semaines car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire et intestinal complétement developpé et apres 16 semaines le système immunitaire est potentiellement modifié.
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules stellaires hépatiques dans les maladies chroniques du foie dont les maladies stéatosiques du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées pour ne plus produire la protéine CD44, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune passe jusqu'à 32 semaines sous régime gras ou reçoit jusqu'à 16 injections intrapéritonéales d'un agent qui provoque une fibrose du foie. Sous régime riche en graisses, glucides et cholestérol, les premières sont mises à jeun quatre heures puis gavées à la sonde rigide, avec un risque de passage du liquide dans les poumons et de détresse respiratoire, et reçoivent jusqu'à trois injections intrapéritonéales et plusieurs prises de sang à la queue. Le porteur annonce la validation d'une protéine qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" dans les maladies du foie liées à l'obésité. Pour justifier le choix de la souris, il avance sa "natalité importante" et le fait qu'elle permet d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée".
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose, en produisant de façon excessive du collagène. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.
Procédures
Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique).
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.