Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation de souris et de rats génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 2000
52 000 souris et rats nouveau-nés vont être utilisés pour un génotypage, chacun pour une minute de prélèvement au maximum, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souriceaux jusqu'à douze jours et les ratons jusqu'à sept jours sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes, tenus en contention et amputés d'un fragment de queue sur animal vigile, la mère restant dans sa cage couvercle fermé pour l'isoler des vocalisations de ses petits. Au-delà de ces âges, le prélèvement se fait à l'oreille sous anesthésie, que le porteur juge "moins délabrant" qu'une amputation de la queue. Les animaux au génotype voulu partent vers d'autres projets ou deviennent géniteurs, les autres sont "prioritairement réutilisés pour la formation ou le prélèvement de tissus ou d'organes post-mortem", ou tués dans le cadre de la gestion des élevages.
Objectifs
Les animaux génétiquement altérés produits sont destinés à être utilisés dans les projets scientifiques car ils représentent des modèles pertinents pour aborder les questions scientifiques posées au sein de ces projets dans des domaines variés comme les neurosciences , la chronobiologie, la cancérologie, le système immunitaire, la nociception/ douleur, le métabolisme, les fonctions physiologiques comme la reproduction..Les rats et souris génétiquement altérés doivent être identifiés de manière unique afin de pouvoir associer à chaque numéro un génotype spécifique. Cette identification est réalisée par tatouage des doigts des nouveaux-nés et le génotypage par une méthode invasive de prélèvement tissulaire : biopsie de queue ou d'oreille. Ces prélèvements tissulaires fournissent un matériel biologique permettant de génotyper chaque animal de manière fiable et reproductible, quelles que soient les techniques d’extraction et d’amplification du matériel génétique. L'objectif de ce projet est donc de pouvoir prélever du tissu (queue et oreille) pour caractériser génétiquement les animaux produits.
Bénéfices attendus
La caractérisation fiable du génotype des animaux génétiquement altérés est nécessaire afin de produire les animaux au génotype d'intérêt pertinent pour les projets de recherche, qui seront en utilisation continue si ces projets de recherche nécessite une DAP"expérimentale", tout en limitant au minimum le nombre d’animaux de génotype non conforme.
Procédures
Les animaux sont soumis à un prélèvement tissulaire (queue) d'une durée d'une minute maximum réalisée sur animal vigil avant 7j maximum chez le rat et 12j maximum chez la souris. Au-delà de ces âges les animaux seront prélevés sous anesthésie et la biopsie sera réalisé à l'oreille (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
La procédure de prélèvement tissulaire nécessite une séparation de la mère (maximum 10 minutes) et une contention douce, génératrices de stress et d'une douleur légère de courte durée. Le prélèvement tissulaire en lui-même dure moins d’une minute par animal. L’anesthésie à l’isoflurane en cas de prélèvement sur un animal âgé de plus de 7 jours (rats) ou 12 jours (souris) entraîne aussi un stress léger et passager, elle durera 3 à 4 minutes par animal.
Devenir
Les animaux identifiés et génotypés dont le génotype est considéré d'intérêt seront alors utilisés dans les projets de recherche auxquels ils sont destinés et inclus dans une DAP si ces projets en requiert une. Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés comme géniteurs pour assurer le maitien des colonies. Parmi les animaux qui ne seront pas utilisés dans les projets de recherche ou pour maintenir les colonies, ils seront prioritairement réutilisés pour la formation ou le prélèvement de tissus ou d' organes post-mortem ou sinon ils seront mis à mort dans le cadre de la gestion des élevages.
Remplacement
La stratégie de remplacement est envisagée dans les projets autorisés utilisant les animaux génétiquement modifiés élevés dans nos locaux. Dans ces projets, la nécessité d'utiliser l'animal pour atteindre les objectifs des projets ainsi que la pertinence des lignées génétiquement modifiées choisies a été précisée. Les animaux inclus dans cette demande sont donc considérés comme indispensables pour la réalisation des projets autorisés et ne peuvent être remplacés.
Réduction
Le nombre d’animaux génétiquement modifiés produits pour utilisation dans les projets autorisés est calculé au plus près des besoins. Le nombre d’animaux non utilisés et de génotype non conforme est suivi par la SBEA afin de repérer les colonies où la gestion peut être optimisée. Les animaux surnuméraires ou de génotype non conforme peuvent être utilisés pour les formations, les prélèvements de tissus ,ou d'organe post-mortem . Les lignées qui ne sont plus utilisées sont cryoconservées ou éliminées.
Raffinement
Afin de réduire le nombre de manipulations et de séparations des nouveau-nés de leur mère, l'identification et la biopsie de queue sont effectuées en même temps. Les souriceaux ou ratons sont placés dans un bac propre et leur mère laissée dans sa cage, couvercle fermé pour l’isoler des vocalisations des petits et donc limiter le stress de séparation. La procédure de prélèvement est très rapide, moins d’1 minute par animal lorsque l’opérateur est expérimenté, et ne provoque pas ou très peu de saignement (chez le rat notamment). La portée est rendue à la mère à l’issue du prélèvement de tous les nouveau-nés (ou en 2 temps pour les portées de plus 12 animaux) et il est vérifié le jour suivant lors du suivi quotidien si tous les petits sont bien dans le nid. Le cannibalisme maternel après biopsie chez le nouveau-né est très rare. Pour limiter ce comportement lorsque les nouveau-nés doivent être prélevés avant 6 jours chez la souris ou 3 jours chez le rat, l’opérateur frottera ses mains dans la litière de la cage afin de limiter le dépôt d’odeurs étrangères sur les petits. Tout prélèvement pour génotypage réalisé sur un animal de plus de 7 jours chez le rat et 12 jours chez la souris sera mis en œuvre sous anesthésie à l’isoflurane et intéressera un prélèvement du bord de l'oreille. Ce prélèvement n’induit pas de saignement et est considéré comme moins délabrant qu’une caudectomie. Néanmoins ce prélèvement n'est pas possible sur des animaux plus jeunes (oreilles plaquées contre le crâne). Enfin, le génotypage précoce permet de supprimer les nouveau-nés qui ne seront pas utilisés dans la semaine précédant le sevrage et ainsi de soulager la mère allaitante, parfois déjà gestante. De plus, l'établissement utilisateur en lien avec sa SBEA met au point la méthode de génotypage sur poils et chaque fois que cette méthode aura été validée et sera reproductible elle remplacera sur la durée du projet la biopsie de queue et d'oreille.
Choix des espèces
Les modifications génétiques portées par les souris et rats élevés permettent d’identifier des populations cellulaires spécifiques dans le système nerveux central, sont impliquées dans les rythmes biologiques, dans des pathologies neurodégénératives, du système immunitaire, d’ordre métabolique, la régulation de la douleur, les sécrétions neuroendocrines. Aucune autre espèce de mammifères ne peut ainsi être modifiée génétiquement. Les souris seront identifiées et biopsiées vigiles le plus souvent entre 6 et 8 jours et jusqu’à 12 jours maximum, et les ratons entre 3 et 4 jours, 7 jours maximum. Au-delà de ces âges maximum, les animaux seront anesthésiés Une intervention à un âge plus précoce s’accompagne d’un risque accru de cannibalisme. Néanmoins dans les cas exceptionnels où les nouveau-nés seraient utilisés avant l’âge de 6 jours chez la souris, ou 3 jours chez le rat, la biospie de queue sera réalisée à partir de l’âge de 2 jours chez la souris ou 1 jour chez le rat. La connaissance précoce du génotype est nécessaire pour les projets utilisant des nouveau-nés et permet de sélectionner au plus tard au sevrage les animaux à conserver.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins (Modification 2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes infectées par des parasites du paludisme, et chez certaines une goutte de sang est prélevée au bout de la queue jusqu'à chaque jour pendant 20 jours consécutifs. Le parasite leur est injecté dans le coussinet plantaire, dans la veine ou dans la peau de l'oreille, ou transmis par des piqûres de moustiques infectés. D'autres actes s'ajoutent pour une partie d'entre elles : une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour une imagerie du foie suivie de la mise à mort sans réveil, ou une chirurgie avec réveil pour implanter un anneau en titane dans l'abdomen, retirer la rate ou greffer de la peau humaine. Toutes sont tuées avant la phase symptomatique, et le travail porte d'abord sur les interactions entre parasite et hôte, le vaccin préérythrocytaire restant ce que le porteur désigne comme son "but ultime".
Objectifs
L’ajout de 204 animaux nécessite une 2eme demande de modification. Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de cette phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou de nouvelles approches vaccinales et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de Plasmodium falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements de sang au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera le maximum par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental. Le rongeur anesthésié pourra être exposé à des injections intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, ou intraveineuse, ainsi que à de micro-injection dans la peau et à de piqûre des moustiques. Toutes ces procédures sont classifiées comme étant de sévérité légère. Pour l’imagerie intravitale du foie à court terme sans réveil, la souris anesthésiée sera soumise à une laparotomie avant la séance d’imagerie. Pendant la séance d'imagerie la souris sera maintenue constamment anesthésiée jusqu'à sa mise à mort à la fin de l'expérience. Pour l’imagerie intravitale à long terme du foie, de la rate, ou de la peau humaine greffée, l'intervention chirurgicale pour l'implantation d'un anneau d'imagerie ou de la greffe sera réalisée sur des souris anesthésiées. Des analgésiques seront utilisés pendant l’opération et les soins post-opératoires. Pendant la séance d'imagerie les souris seront maintenues constamment anesthésiées. Les procédures impliquant un acte chirurgical avec réveil sont classifiées comme étant de sévérité modérée.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les reutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité etique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide du logiciel SHADE qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont gérées par l'utilisation d’anesthésiques et antalgiques.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Analyse des défaillances immunitaires dans un nouveau modèle de rats mutants
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est irradiée neuf minutes aux rayons X puis reçoit en intraveineuse la moelle osseuse prélevée sur les autres, et la moitié subit un prélèvement de sang derrière l'orbite de l'œil. Une lignée porte la mutation humaine du syndrome de DAVID, une maladie rare associant immunodéficience sévère et auto-immunité, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". Il écrit que les études in vitro ont "largement validé" l'effet de cette mutation sur les lymphocytes, puis conclut que le recours aux rats reste "indispensable".
Objectifs
Des mutations sur le gène étudié ont été identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID, maladie autosomique rare associant des syndromes d'immunodéficience sévère et d'autoimmunité, ainsi que des déficits de certaines hormones hypophysaires. Nous disposons au laboratoire d'un modèle rat porteur d'une des mutations identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID. L'objectif est d'utiliser ce modèle pour analyser l'impact de cette mutation dans la fonction et la différenciation des lymphocytes, dans les phénomènes auto-immuns sévères et dans les mécanismes de "tolérance centrale thymique", mécanismes qui permettent à ces lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer si la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (cellules spécialisées qui se trouvent dans la moelle osseuse, l'organe responsable de la production de toutes les cellules sanguines : globules rouges, globules blancs, et plaquettes) serait susceptible de réduire la sensibilité aux infections récurrentes et de réduire les symptômes d'autoimmunité chez les patients porteurs de cette mutation dans le gène étudié.
Procédures
- 1 irradiation de 9 min aux rayons X (la moitié des animaux du projet) - une injection en intraveineuse de cellules de la moelle osseuse d'animaux donneurs. Les animaux seront ensuite placés sous lampe chauffante et surveillés jusqu’à leur réveil (la moitié des animaux). - Un prélèvement de sang derrière l'orbite de l'œil sous anesthésie et analgésie locale (gel ophtalmique) (la moitié des animaux). En cas d’atteintes de points limites avant la fin de la procédure, les animaux seraient mis à mort pour abréger leur souffrance.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement 1. légère douleur liée à l'injection de cellules de la moelle osseuse ; 2. douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un stress lié au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l’œil.
Devenir
Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélèvements de tissus post-mortem.
Remplacement
Des études "in vitro" ont largement validé l'impact de la mutation du gène étudié dans la fonction et la différenciation des lymphocytes. Néanmoins, ces études in vitro ne sont pas suffisantes pour répondre au défaut de "tolérance centrale thymique" (mécanismes qui permettent aux lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même) à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez les patients atteints du syndrome de DAVID. Des études chez l'animal en utilisant ce modèle de rats génétiquement altéré sont donc indispensables.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Quatre-vingt rats maximum ont été estimés pour réaliser ce projet. Ce chiffre pourra être revu à la baisse, pour: - les donneurs de moelle osseuse si la quantité de cellules obtenues est bien au-delà de la quantité nécessaire. Le surplus de cellules sera congelé pour être utilisé dans une autre expérience. - le nombre d'expériences indépendante pourra être réduit à 3 si les résultats sont fiables et assez reproductibles pour en tirer des conclusions solides.
Raffinement
Les animaux seront surveillés à chaque étape critique de la procédure: - suite à l'irradiation des animaux aux rayons X, - suite à l'injection de cellules de la moelle osseuse - suite au prélèvement de sang. Si un signe clinique sévère est observé et/ou un point limite atteint, l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement. Si un animal présente des signes de faiblesse mais sans atteintes de points limites, il pourra faire l'objet d'un isolement temporaire pour éviter tout comportement agressif de ses congénères. Les animaux à phénotype dommageable seront suivis comme les autres : suivi de poids, surveillance de prostration éventuelle.
Choix des espèces
Les rats sont de bons modèles d'étude de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, …). De plus, le modèle rat a été choisi car nous disposons de 2 lignées de rats génétiquement modifiés pour ce projet: - une lignée de rats exprimant constitutivement une protéine fluorescente verte, utilisée comme donneurs de moelle osseuse - une lignée de rats porteurs de la mutation d'intérêt dans le gène étudié, utilisée comme receveurs de moelle osseuse. Nous utilisons cette lignée à phénotype dommageable parce que ces animaux sont porteurs d’une mutation dans le gène étudié, comme celle présente chez les patients atteints du syndrome de DAVID, et qui est à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez ces patients. Les rats utilisés auront entre 6 et 7 semaines.
Efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses d’origine adipocytaire sur des modèles murins de sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
174 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection sous la peau cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés leur font développer une fibrose de la peau et des poumons, et quarante d'entre elles subissent en plus une biopsie cutanée au punch dans le bas du dos. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et peau. Le bénéfice avancé reste conditionnel, valider un jour une thérapie cellulaire chez les personnes atteintes de sclérodermie systémique, quand la fibrose infligée aux souris est immédiate et le porteur affirme qu'observer l'"animal entier" est "indispensable".
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs). 40 souris auront en plus une biopsie cutanée qui sera réalisé en bas du dos à l'aide d'un punch.
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires. Il n'est pas attendu d'effets négatifs pour les souris suite à la réalisation de la biopsie cutanée ; en effet, comme le diamètre du punch est réduit au minimum (4 mm) et que nous faisons un pont de suture, la cicatrisation est rapide.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)
Remplacement
Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades. Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, les effets thérapeutiques précoces (préventifs) et tardifs (curatifs) des d'ASCs dans le modèle de souris sclérodermiques induit par injection d'HOCl seront évaluées dans la même procédure (N°4).
Raffinement
Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes
Expression de peptides antimicrobiens dans un modèle de sepsis avec infection à une bactérie antibioresistante
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Les souris dont la perte de poids atteint 20 % pourront recevoir une médication, et la mortalité figure parmi les effets attendus du protocole. 865 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles sont immunodéprimées par une injection dans l'abdomen, infectées quatre jours par une bactérie résistante aux antibiotiques placée dans leur eau de boisson, traitées par antibiotique, puis saignées par ponction dans le cœur sous anesthésie le jour de leur mise à mort. Le porteur annonce des diarrhées et du sang dans les selles, et met en avant des bénéfices sanitaires, économiques et environnementaux d'une technologie qui reste à ce stade un concept.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est une menace sanitaire croissante considérée par les organismes internationaux comme l’une des principales priorités de santé mondiale. En 2019, elle a été attribuée à 1,27 million de décès dans le monde. Nous introduisons un nouveau concept pour lutter contre la résistance aux antibiotiques : la technologie des inducteurs de peptides antimicrobiens. Basée sur des molécules qui stimulent le système immunitaite, la technologie visera à booster sélectivement l’expression des gènes de défense de l’organisme produisant les peptides antimicrobiens (AMP). Cette technologie permettra d'introduire une nouvelle approche pour lutter efficacement contre la résistance aux antibiotiques et les maladies infectieuses : ainsi, plutôt que de cibler directement un pathogène avec des antimicrobiens exogènes avec le risque de développement de résistance, notre technologie favorisera une réponse naturelle du corps humain à travers ses propres défenses. Cela aura l'avantage de réduire la pression de sélection sur les bactéries et le risque de favoriser la résistance.
Bénéfices attendus
Les effets positifs de la technologie des inducteurs d’AMP pourraient être considérables pour notre économie, notre environnement et notre société, en ce qui concerne plusieurs aspects : Améliorer la santé publique, en aidant à contrôler la propagation de la résistance aux antibiotiques, ce qui pourrait réduire le nombre de maladies liées aux infections. Réduire la charge de morbidité due aux infections par des agents pathogènes résistants aux antibiotiques. Réduire les coûts de santé associés aux infections résistantes aux antibiotiques. Réduire la quantité d'antibiotiques utilisés, ce qui pourrait réduire la pollution, les impacts négatifs sur l'environnement,et aider à maintenir des écosystèmes sains
Procédures
Les animaux seront traités aux antibiotiques par voie intrapéritonéale (1 fois par jour (1 min par souris) pendant 4 jours) ou dans l'eau de boisson pendant 4 jours. L'infection sera réalisée par inoculation de la bactérie dans l'eau de boisson (pendant 4 jours). Immunossupression par administration intrapéritonéale ( 1 injection, 1 minute). Prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie 1 fois ( 5 minutes le jour de la mise à mort)
Impact sur les animaux
Perte de poids, présence de diarrhée et de sang dans les féces, mortalité
Devenir
Mise à mort de tous animaux afin de prélever les organes post mortem pour analyses
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires et d'organoïdes humains, ceci afin de tester leur inocuité et leur mécanisme d'action. Le principe de remplacement n'est cependant pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduisent pas l'ecosystème complexe au cours de l'infection et par conséquent ne permettent pas l'obtention de tous les résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, les molécules à tester auront d'abord été validées in vitro afin de ne tester que des molécules ayant un potentiel thérapeutique et les durées et fréquences d'administrations auront également été optimisées grâce à cela, permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. De plus un maximum de prélèvements et de résultats seront réalisés sur chaque animaux afin de réduire le nombre d'expérimentations et donc d'animaux nécessaires.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton purs ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé tout les jours en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechnicien afin de contrôler le poids, la présence de diarrhée, la température des animaux. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur: • altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), • vocalisation, tremblements …, • une perte de poids élevé (mais
Choix des espèces
La souris est une espèce pertinente dans notre modèle: infection gastrointestinale suivi de sepsis. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 12 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature.
Etude du rôle de deux récepteurs impliqués dans la pathogénèse de la sclérose en plaques dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent quatre injections sous anesthésie, deux sur les flancs et deux par voie intraveineuse, qui déclenchent une inflammation du cerveau et une paralysie progressive partant de la queue et des pattes arrière. Des nodules et des lésions cutanées peuvent apparaître aux points d'injection. Le porteur prévoit six répétitions de l'expérience parce que, lors d'une étude antérieure, seules 60 % des souris avaient développé la maladie, ce qui porte à 240 le nombre d'animaux pour tester deux récepteurs.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, (la SEP est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans). La SEP touche aujourd'hui 120 000 personnes en France, dont 700 enfants. Trois mille nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année. La sclérose en plaques est une maladie du système nerveux central, résultant d’une attaque incontrôlée du système immunitaire contre la gaine de myéline qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine, essentielle à la transmission des signaux nerveux est détruite, provoquant l'apparition de symptômes tels que des troubles moteurs, des perturbations visuelles, une faiblesse musculaire ou des engourdissements. Les traitements disponibles permettent de réduire la fréquence des poussées, mais restent incapables de ralentir l'évolution de la maladie. Les causes exactes de cette pathologie demeurent mal comprises, et ses mécanismes restent encore largement à élucider. Toutefois, un processus inflammatoire joue un rôle central, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires qui contribuent activement à la démyélinisation. Notre projet se concentre sur l’étude de deux récepteurs impliqués dans le processus inflammatoire de la maladie. Nous prévoyons de développer un modèle de sclérose en plaques chez des souris dépourvues de l’un de ces deux récepteurs. L’objectif est d’évaluer un éventuel effet bénéfique de leur blocage dans le traitement de la sclérose en plaque, en ouvrant la voie à des approches thérapeutiques innovantes ciblant ces mécanismes inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle de deux récepteurs en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour moduler l’inflammation liée à l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires dans la sclérose en plaque. Ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette maladie.
Procédures
Les animaux subiront 4 injections au total : 1administration sur chacun des flancs de l’animal et 2 injections intraveineuses. Toutes les injections ne dépassent pas une minute par animal et sont effectuées sous anesthésie générale gazeuse.
Impact sur les animaux
L’induction de la sclérose en plaque provoque une inflammation cérébrale caractéristique des maladies inflammatoires démyélinisantes du système nerveux central. Les nuisances attendues incluent une paralysie progressive, débutant par la queue et les pattes arrière, entrainant une diminution des déplacements. Les animaux peuvent développer des nodules visibles au niveau des sites de l’injection sur les flancs. Ces zones peuvent également présenter des lésions cutanées, conséquence possible des injections. L’injection intra-veineuse peut entrainer un léger saignement et éventuellement un hématome. L'anesthésie générale gazeuse peut entrainer une hypothermie ainsi qu’un arrêt cardio-respiratoire.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. Différents organes seront prélevés après l’euthanasie pour des études biologiques et histologiques complémentaires.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent ni d’observer les signes cliniques de la sclérose en plaque, ni de reproduire les mécanismes immunitaires et neurologiques impliqués dans cette pathologie. Par ailleurs, les cultures cellulaires, en raison de leur connectivité limitée, ne peuvent restituer toutes les propriétés complexes du système nerveux central. Il est aussi impossible à l’heure actuelle de suivre les conséquences physiques de la sclérose en plaques sur des modèles in vitro.
Réduction
Nous utiliserons dans ce projet le nombre minimum d’animaux permettant de garantir utilisés tout en garantissant des résultats scientifiquement et des données statistiquement fiables. Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé sur la base de nos précédentes expériences. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe expérimental est requis pour atteindre les objectifs scientifiques définis dans ce projet. En raison de la variabilité importante dans le développement de la pathologie (avec des niveaux d’inflammation différents au sein d’un même lot), les expériences devront etre conduites 6 fois. Lors d’une étude antérieure portant sur la sclérose en plaque, seuls 60 pourcents des animaux ont développé la maladie, ce qui nous a conduits à planifier six répétitions. Cependant, si un nombre de répétitions inférieur permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous n’effectuerons pas l’ensemble des six répétitions prévues. Au total 240 souris seront utilisées dans cette étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées avec enrichissement. Le nombre de souris par cage est limité à 5 individus adultes. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-etre. La gravité des symptômes observés sera évaluée à l’aide d’une grille d’évaluation clinique adaptée. Dans le cadre de ce projet, une surveillance quotidienne stricte est mise en place afin de garantir le bien-etre des animaux. Les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale gazeuse pour les injections intraveineuses et sous-cutanées. En cas de mobilité réduite des animaux suite au développement de la maladie induite, nous mettons à disposition un gel hydratant et nutritif dans les cages pour aider à l’alimentation.
Choix des espèces
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie. Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la sclérose en plaque. De plus, il existe des souris génétiquement modifiées pour les récepteurs étudiés dans ce projet, qui sont impliqués dans le processus inflammatoire de la maladie. Nous utiliserons des souris âgées entre 2 et 4 mois. Cet âge correspond à une phase où le système immunitaire et vasculaire des souris est pleinement mature, ce qui les rend aptes à développer la pathologie.
Réponses adaptatives à l’exercice et horloge circadienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Quinze jours d'acclimatation en cage chronobiologique, dix à quinze jours d'habituation au tapis roulant, puis un test d'endurance pouvant durer quatre-vingt-dix minutes, avec jusqu'à cinquante stimulations électriques pour forcer la course. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après le test, une scarification de la veine de la queue permet de doser le lactate et le sucre dans le sang, et l'entraînement se poursuit à raison de trois séances de vingt à quarante-cinq minutes par semaine. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, sauf jusqu'à quarante souris qui refuseraient de courir et seraient alors basculées vers d'autres procédures en cours.
Objectifs
Ce projet explore le rôle d’une protéine influencée par l’horloge biologique qui joue un rôle clé dans la gestion des sucres et des graisses, ainsi que dans le bon fonctionnement des muscles. Pour mieux comprendre son impact, les chercheurs ont développé un modèle animal dans lequel cette protéine est absente spécifiquement dans les muscles. Bien que cette absence ne provoque pas de changement visible au repos, les premières analyses suggèrent qu’elle pourrait affecter la capacité du corps à s’adapter à l’effort. Les chercheurs examineront comment les muscles de ces souris réagissent à un effort ponctuel à différents moments de la journée, comment ils s’adaptent à un entraînement prolongé et quelles sont les conséquences sur l’équilibre énergétique et inflammatoire du corps. Les résultats pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes régulant l’endurance musculaire et ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la santé et du sport. Nous ne disposons pas de modèle de remplacement, cependant le raffinement et la réduction sont particulièrement appliqués. En outre, les procédures sont réalisées durant la phase de veille (donc d'activité) de la souris. A chaque étape du protocole, la règle des 3Rs sera appliquée.
Bénéfices attendus
Ce projet, pleinement justifié d’un point de vue scientifique et conforme à la règle des 3Rs, vise à explorer le rôle d’un gène impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que dans la physiologie du muscle squelettique. Son objectif est d’approfondir l’influence de ce gène, dont l’expression fluctue au cours de la journée et est stimulée par l’exercice physique, sur la fonction musculaire et la coordination des réponses métaboliques et immunitaires à l’effort, soulignant ainsi l'importance du rythme circadien dans ces mécanismes. À court terme, nous pourrons évaluer son impact sur l’endurance, la récupération et l’adaptation musculaire à l’exercice, renforçant ainsi notre compréhension des interactions entre l’horloge biologique, l’activité physique et le métabolisme. L’étude tiendra également compte de l’influence du moment de la journée sur la physiologie de l’exercice. Sur la base des résultats obtenus, nous élargirons l’analyse aux voies de régulation et aux processus métaboliques et immuno-métaboliques les plus affectés par l’inactivation de ce gène dans le muscle squelettique. Par ailleurs, nous examinerons comment le désalignement du rythme circadien perturbe le métabolisme et comment l’exercice musculaire pourrait contribuer à sa régulation. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à une optimisation des recommandations en matière d’activité physique, de nutrition et de gestion du rythme circadien, avec des implications majeures pour la santé et la performance physique.
Procédures
Les souris devront réaliser un test de performance physique d'endurance dont la durée peut atteindre 90 minutes selon leurs capacités. La stimulation à la course durant ce test peut nécessiter l'utilisation de la stimulation électrique et dans ce cas, la souris peut recevoir au maximum 50 stimulations électriques à intensité faible induisant un léger picotement. En pratique le recours à la stimulation n'est pas souvent utile lorsque la souris se trouve dans sa phase de veille (active) lors du protocole d'exercice. Une scarification sur la veine de la queue pour prélever une microgoutte de sang, pour doser à l'aide d'une bandelette la lactatémie et la glycémie post-exercice, sera réalisée. Elle peut génèrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de l'acte (
Impact sur les animaux
Il y a peu d’effets indésirables dans ce projet. Avec les systèmes de cycles inversés dans les cages de chronobiologie, nous avons pu observer une forte activité des souris durant la nuit. Le test de performance physique d’endurance et l’entrainement des souris seront effectués pendant la phase active nocturne des souris ce qui limite considérablement le stress lié aux procédures et le recours à un système de stimulation électrique (les souris courent la plupart du temps spontanément après habituation). L’intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir, s’il le faut lors du test d’endurance uniquement, sera la plus faible possible. Elle est désagréable mais n’induit pas de douleur. Elle ne sera pas forcément utilisée et ne le sera pas du tout lors de l'entrainement et l'habituation des souris. En effet, les souris courent spontanément, sans contrainte et sans s'arrêter, alors qu'elles en ont la possibilité. Une nuisance pourrait être lié au fait de les confiner pour une durée maximum de 90 minutes sur un couloir de course (la largeur de 7 cm est suffisante pour que la souris coure sans se retourner ou se dévier latéralement ; la longueur de 50 cm permet d'avoir une distance suffisante pour éviter tout stress dû à un espace trop restreint et la hauteur des parois latérales de 15 cm minimise l’effet de confinement). Le fait qu'elles soient habituées à cette situation et qu'elles courent durant la procédure de manière volontaire ainsi que leur comportement, nous laisse penser que cette nuisance est minime. Une légère scarification sur la veine de la queue pourrait être considérée comme une nuisance. Elle est effectuée pour prélever une microgoutte de sang pour doser, à l'aide d'une bandelette, la lactatémie et la glycémie post-exercice et pourrait engendrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de la scarification sans autre effet indésirable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes. Les animaux pouvant être réutilisés dans le cadre d'autres procédures en cours, sont ceux qui pourraient refuser de courir à l'issue de la période d'habituation au tapis roulant et qui ne seraient pas inclus dans les procédures. Cela peut concerner au maximum 40 souris pour l'intégralité des 2 procédures.
Remplacement
Nous utilisons des cultures de cellules musculaires et des traitements imitant les effets métaboliques de l'exercice pour étudier leurs réactions. D'autres types de cellules, comme des cellules graisseuses et immunitaires, sont également analysées après exposition aux substances libérées par les cellules musculaires traitées. Dans le cadre d’un projet de recherche, nous collaborons avec des équipes spécialisées pour examiner les fibres musculaires et développer un modèle mathématique du fonctionnement des muscles. Ces méthodes permettent de réduire l’utilisation d’animaux. Cependant, elles ne reproduisent pas les effets réels de l'exercice et de l'entraînement physique sur un organisme entier. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux reste nécessaire pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été défini de manière à utiliser le minimum nécessaire pour détecter une différence statistiquement significative avec une puissance minimale de 80 %, tout en tenant compte d’une marge de 20 % de souris potentiellement exclues de l’étude (souris non coureuses). Ainsi, 10 animaux par groupe sont requis pour la procédure 1 (exercice) et 12 pour la procédure 2 (entraînement). Afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et ainsi respecter le principe de réduction de la règle des 3R, nous avons optimisé l’organisation des expériences. Pour éviter de multiplier les manipulations, certaines analyses seront réalisées sur des souris sauvages au cours de la procédure 1. Cela permettra d’évaluer la faisabilité des protocoles et d’effectuer des mesures métaboliques (consommation d’oxygène) ou immunitaires (cytométrie en flux) nécessitant un traitement immédiat des échantillons après prélèvement. Des tests statistiques seront appliqués pour analyser nos résultats.
Raffinement
Pour assurer le raffinement de l’expérimentation et garantir le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place. Tout d'abord, les procédures seront effectuées lors de la phase active de la souris et en lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes veille-sommeil des souris. Les souris seront préalablement acclimatées et de manière progressive durant 15 jours aux cages chronobiologiques. L'environnement dans la cage est enrichi. De plus, les souris seront progressivement habituées à l’exercice sur tapis roulant pendant 10-15 jours afin de limiter leur stress et favoriser l'exercice volontaire sur tapis. Nous limiterons par ces biais le recours à la stimulation électrique qui peut être stressant pour la souris. Les souris seront surveillées quotidiennement par les animaliers et régulièrement par les expérimentateurs pour détecter rapidement tout signe de souffrance et y remédier. Enfin nous utiliserons la méthode "en cup" pour prendre une souris, une technique de manipulation douce et non stressante, qui consiste à soulever l'animal en formant une coupe avec les mains plutôt qu'en le saisissant par la queue. Pour éviter tout stress inutile, les souris destinées à l’euthanasie seront placées dans une salle séparée et les manipulations post-euthanasie se dérouleront dans une autre pièce. Nous veillerons à ce qu’aucune souris ne soit isolée dans sa cage lors des procédures.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice sur la santé, car son métabolisme et son système immunitaire sont proches de ceux de l’humain. La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène-cible peuvent être générés. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses immuno-métaboliques des tissus prélevés. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques en question, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. Les souris utilisées auront entre 2 et 6 mois, car c'est à cet âge que des études précédentes ont montré une baisse d’endurance.
Fonction des cellules immunitaires natural killer dans les exacerbations de l’asthme allergique induites par des virus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris dont l'état se dégrade sans répondre aux mesures prévues sont tuées avant le terme du protocole. 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un allergène sur une narine sous anesthésie, quatre fois en douze jours ou vingt fois en cinq semaines, puis une infection par un virus du rhume, et pour certains groupes une mesure quotidienne de la respiration dans un système clos pendant cinq à neuf jours, après inhalation d'une molécule qui contracte les bronches. Toutes sont tuées, les poumons devant être prélevés à deux moments, au pic de l'exacerbation asthmatique et en fin d'expérience.
Objectifs
L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins, et peuvent conduire à l’hospitalisation voire entraîner le décés des patients. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, virus qui provoquent un rhume chez les individus sains sans autre conséquence. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui conduisent aux exacerbations viro-induites des asthmatiques. Les cellules natural killer (NK) sont une sous-famille de globules blancs. Ce sont des cellules immunitaires impliquées dans la réponse précoce contre les virus, qui sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leurs rôles dans les exacerbations de l’asthme induites par les virus sont largement méconnus. Des études in vitro ont montré que la fonction des cellules NK humaines dirigée contre les rhinovirus était diminuée chez des patients atteints d’asthme sévère. L’objectif de ce travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation de l’asthme induite par un rhinovirus chez la souris, afin de caractériser les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions et de tester des thérapeutiques capables de restaurer leurs fonctions.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle de cellules immunitaires particulières (les cellules natural killer) dans l’asthme et ses exacerbations induites par les virus. Mieux comprendre cette maladie est essentiel pour proposer de nouvelles thérapeutiques. En effet, certains patients et surtout les plus sévères échappent aux traitements actuels. A court terme, ce projet permettra de proposer et d’évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme chez l’adulte.
Procédures
Les animaux recevront sous anesthésie une petite goutte d’un allergène (molécule vis-à-vis de laquelle on peut être allergique) déposée sur une narine. L’allergène sera donné 4 fois en 12 jours, ou 20 fois en 5 semaines, selon le modèle. Les souris seront infectées avec un virus du rhume 1 seule fois, de la même manière : une goutte sur une narine, sous anesthésie. Certains groupes recevront en plus 1 injection unique en intraveineuse avec un traitement, sous anesthésie. Enfin, dans certains groupes, la respiration sera mesurée sur animaux vigiles se déplaçant librement dans un système clos (1 fois par jour pendant 5 à 9 jours).
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole sur les animaux sont : • L’anesthésie peut provoquer un stress, une hypothermie, et un risque faible d’arrêt cardiorespiratoire • L‘injection d’anesthésique peut entraîner une courte douleur (moins de 5 minutes) • L’infection avec un virus du rhume peut entrainer des symptomes viraux, inférieurs à ceux de la grippe • La mesure de la respiration peut être source de stress pour les animaux qui peuvent se déplacer librement mais sur une surface réduite. • Certaines mesures de la respiration doivent se faire après avoir respiré une molécule nébulisée induisant une contraction des bronches. Chez les animaux non asthmatiques, il ne se passe rien. Les animaux asthmatiques en exacerbation pourraient présenter des difficultés respiratoires.
Devenir
Afin de caractériser l’inflammation au niveau des poumons pour confirmer l’exacerbation de l’asthme, et évaluer l’effet des traitements, nous devons récupérer les poumons à 2 temps de l’expérience : au moment de l’exacerbation et à la fin de l’expérience. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de l’ensemble des animaux du projet. L’étude cellulaire et moléculaire du poumon est indispensable pour mieux comprendre les mécanimes de l’exacerbation de l’asthme induite par les virus, et evaluer l’effet et l’efficacité des traitements testés.
Remplacement
Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, et orienter le choix des molécules ciblées par la thérapeutique.
Réduction
Les effectifs sont ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous effectuons une étude pilote afin d’obtenir des données préliminaires solides et de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires en utilisant un outil informatique. Les nombres d’animaux présentés sont donc des nombres maximaux, et sont susceptibles d’être revus à la baisse.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Elles seront anesthésiées avant chaque administration (allergène, virus, traitement) et le jour de la mise à mort. Un test de reflexe des extrémités sera effectué pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Une fiche d’observation sera remplie quotidiennement afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocément possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.
Choix des espèces
Les modèles animaux souris sont des modèles de base pour étudier le système immunitaire, et reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreux anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines au début des protocoles) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet. En outre, notre projet est focalisé sur l’asthme de l’adulte et ses exacerbations.
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 600
Chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre mois de traitement, deux injections par jour, et un inducteur d'inflammation dans l'eau de boisson une semaine sur deux, jusqu'à quatre fois. 1 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 400 autres dans des procédures légères, tous tués à l'issue. Ils développent une inflammation intestinale reproduisant la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, avec perte de poids, douleurs abdominales et diarrhée. Le mode d'administration, la fréquence et la durée des candidats médicaments dépendent de "la demande du sponsor", ces molécules étant celles de clients du laboratoire.
Objectifs
Plus de 3 millions de personnes sont atteintes d'une maladie inflammatoire chronique intestinale en Europe, rendant toujours nécessaire le développement de médicaments plus efficaces et mieux tolérées. Lors des poussées inflammatoires, ces maladies se caractérisent le plus souvent par des douleurs abdominales, des diarrhées fréquentes, parfois sanglantes, ou encore une atteinte de la région anale (fissure, abcès). Ces symptômes font peser sur la maladie un certain tabou, rendant la vie des patients qui en souffrent particulièrement difficile. L’objectif du projet est donc de faire la preuve de concept pharmacologique de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale induite chez le rongeur. Ces composés chimiques vont induire une inflammation de la paroi intestinale et reproduire les symptômes rencontrés chez des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.
Bénéfices attendus
Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques intestinales. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour à terme mieux prendre en charge les patients et les traiter de façon durable.
Procédures
1) Dans le cadre de ce projet, la maladie sera induite soit par prise hydrique avec un inducteur d'inflammation intestinale pendant une période de 7 jours au maximum pour le modèle aigu ou en alternance de périodes où les animaux reçoivent l'inducteur pendant la première semaine puis de l’eau la seconde et ceci jusqu’à quatre fois pour le modèle chronique. Soit par délivrance dans le rectum (environ 20 secondes hors temps d'anesthésie) pour le modèle avec le 2ème inducteur. 2) Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor ((intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) pour une durée totale de traitement de 4 mois maximum). 3) Tout au long de l'étude, les animaux seront attentivement suivis à l’aide d'une pesée quotidienne et d’un score clinique. 4) La perméabilité intestinale pourra être évaluée une fois au cours de l'étude. Pour cela, après 2 heures de mise à jeun, les animaux recevront un composé fluorescent par gavage (30 secondes). 4 heures après l'administration du composé, un prélèvement de sang sera effectué (durée : 1 min maximum), puis les animaux auront de nouveau accès à la nourriture. 5) D'autres prélèvements de sang pourront être effectués tout au long de la procédure (5 prélèvements maximum sur toute la durée du protocle avec 1minute maximum pour chacun chacun et en respectant un teps de récupération nécessaire entre 2 prélèvements).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sur ce modèle animal sont une perte de poids, des douleurs abdominales associées à de la diarrhée, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injections (intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) et peuvent engendrer un stress de même que la mise à jeun (2h). Pour pallier à cela, les cages seront enrichies et les animaux seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs. Les aiguilles et les sondes de gavage seront adaptés au poids des animaux et au mode d’administration employé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il n'est pas envisageable d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles animaux pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique, avant de passer aux essais cliniques chez l'Homme. L'utilisation des rats et des souris semble pertinent de par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent.
Réduction
Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. Lorsque cela est possible, les composés de nos clients seront screenés sur culture cellulaire ou organe isolé en complément des tests sur les animaux. Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les rongeurs seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées: Tous les animaux bénéficient d’un logement, d’un environnement, d’une alimentation, d’un apport en eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Les conditions d’environnement et les paramètres d’ambiance dans lesquels les animaux sont utilisés font l’objet de vérifications quotidiennes. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Tous les animaux disposeront d’un espace suffisant présentant une complexité adéquate pour leur permettre d’exprimer un large répertoire de comportements normaux. Les normes d'hébergement appliquées prenent en compte le nombre, le poids des animaux et la dimension de la cage. Leur environnement sera enrichi (igloo, petite buchette, neslet pour les souris et tunnel, grande buchette, neslet pour les rats) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Il n'est pas prévu d'administrer de molécule autre que celle du client. Il n'y a donc pas de possibilité́ de réaliser un traitement anti-inflammatoire ou anti-douloureux sans compromettre les résultats de l'étude car le but du modèle est d'étudier l'effet de nouveaux composés sur le développement des maladies intestinales inflammatoires dont l'inflammation est une composante majeure. Ainsi, un traitement anti-inflammatoire ou analgésique pourrait interférer avec le composé testé et biaiser le score établi pour caractériser la maladie ainsi que les paramètres mesurés (masure de la production de cytokines inflammatoires, recrutement de cellules immunitaires…). En effet, ces composés utilisent les mêmes voies de signalisation que celles des composés clients à tester. Les animaux seront tout de même pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement après l'induction de la maladie et jusqu'à l'euthanasie par les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (grilles de score spéifiques permettant de définir les points limites).
Choix des espèces
D'une part, l’utilisation de modèles animaux dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin est très largement documentée dans la littérature scientifique. D'autre part, l'utilisation de rats et de souris se justifie par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), lorsque toutes leurs fonctions biologiques sont matures, afin d’obtenir des paramètres d’induction de la maladie reproductibles.
Déterminer l’origine des cellules de Langherans de la langue
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Huit minutes d'irradiation quasi totale sous anesthésie, puis une injection de moelle osseuse derrière l'œil : 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 96 d'entre elles en gravité sévère. Les souriceaux donneurs, âgés de 7 à 10 jours, ont le bout de la queue coupé pour le génotypage, un geste que le porteur décrit comme peu ou pas douloureux à cet âge. Les receveuses reçoivent ensuite du tamoxifène par sonde gastrique, des injections dans l'abdomen alors qu'elles sont conscientes, et un prélèvement de sang sous la mâchoire. L'effectif a été fixé "en utilisant un calculateur en ligne", sans autre précision.
Objectifs
La candidose est une infection fréquente de la langue causée par un champignon naturellement présent dans notre corps. Ce champignon, habituellement inoffensif, peut devenir problématique dans certaines situations, comme chez les bébés, les personnes âgées ou celles dont le système immunitaire est affaibli.Nos recherches montrent qu’un type de cellules immunitaires présentes dans la langue, appelées cellules protectrices, joue un rôle essentiel pour lutter contre cette infection. Ces cellules ont besoin d’une molécule spécifique pour survivre et rester dans les tissus. Dans un modèle de souris où cette molécule est absente, ces cellules immunitaires disparaissent presque complètement.Cependant, après une infection par ce champignon, nous avons observé que le nombre de champignons dans la langue augmente dans un premier temps, avant de diminuer. Cette baisse coïncide avec l’apparition de nouvelles cellules protectrices, même sans la molécule habituellement nécessaire à leur survie. Nous ne savons pas encore d’où proviennent ces nouvelles cellules ni quelle autre molécule pourrait les aider à rester actives dans le tissu. Nous avons également observé qu’en présence de cette molécule, les cellules protectrices sont plus nombreuses après une infection. Cela soulève des questions sur les mécanismes à l’œuvre en fonction de la présence ou non de cette molécule. Ce projet vise à : Identifier la molécule et les cellules responsables de la production ou du maintien des cellules protectrices dans les tissus infectés. Comprendre d’où proviennent les nouvelles cellules protectrices recrutées après l’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre comment le corps produit certaines cellules immunitaires, essentielles pour se défendre contre les infections. En étudiant l'origine des cellules protectrices après une infection causée par un champignon normalement inoffensif, les chercheurs espèrent découvrir comment ces cellules se régénèrent dans les tissus. Le projet vise également à comprendre comment, même en l’absence d’une molécule clé, l’organisme parvient à réduire la quantité de champignons. Ces découvertes pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches pour lutter contre les infections fongiques, particulièrement chez les personnes ayant un système immunitaire affaibli. Enfin, en approfondissant nos connaissances sur le rôle des cellules immunitaires dans la protection et la santé des tissus, ce projet pourrait contribuer au développement de traitements pour des maladies auto-immunes ou inflammatoires..
Procédures
Les souris donneuses subiront un prélèvement de la partie terminale de la queue (appelé prélèvement caudal) pour permettre le génotypage. Cette intervention, qui dure environ 1 minute, sera réalisée sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours. Les souris receveuses subiront, sous anesthésie chimique, une irradiation quasi-totale pendant 8 minutes afin d'éliminer leur moelle osseuse. Ensuite, elles recevront une injection de moelle osseuse provenant des souris donneuses. Cette injection, d’une durée d’environ 1 minute, sera effectuée par voie oculaire, c'est-à-dire via une injection dans la zone située derrière l'œil, ce qui permet un accès rapide au système sanguin. L'anesthésie chimique sera administrée par injection intrapéritonéale, ce qui signifie que la substance anesthésique sera injectée directement dans la cavité abdominale des souris conscientes. Cette injection prend environ 1 minute par souris. Certaines souris receveuses seront traitées avec du tamoxifène, une molécule qui permet de moduler l'expression génétique. Ce traitement sera administré par nourriture forcée (c'est-à-dire directement dans l'estomac à l'aide d'une sonde) en moins de 10 secondes par intervention, réalisée deux fois à 7 jours d'intervalle. D'autres souris recevront une injection intrapéritonéale, d'une durée d’environ 1 minute, également sur animaux conscients, pour l’administration d'une molécule permettant de mesurer les cellules en prolifération avant leur euthanasie. Enfin, toutes les souris receveuses subiront un prélèvement sanguin de courte durée (environ 1 minute par souris) au niveau du sinus submandibulaire, une zone située sous la mâchoire, qui permet un accès rapide et efficace aux vaisseaux sanguins pour effectuer la collecte de sang.
Impact sur les animaux
- Prélèvement de la queue : Une petite partie de la queue sera coupée sur les souris 10 jours après leur naissance. À cet âge, la douleur ressentie est très faible ou inexistante car les nerfs de la queue ne sont pas encore complètement développés. - Nourriture forcée : une molécule sera administré par voie orale à l'aide d'une petite seringue, ce qui peut causer un léger inconfort et stress pendant environ 10 secondes. - Anesthésie : Les souris seront endormies avant l'irradiation pour pouvoir protéger leur tête avec un bouclier en plomb. - Irradiation : Les souris recevront une irradiation partielle de leur corps, sauf la tête, pour affaiblir leur système immunitaire sans endommager certaines cellules spécifiques de la langue. Cela peut causer plusieurs effets secondaires chez les souris. Elle provoque une suppression immunitaire, rendant les animaux vulnérables aux infections. Cette procédure peut également entrainer une réduction des globules rouges et des plaquettes. Les souris sont plus sensibles aux infections opportunistes en raison de leur système immunitaire affaibli. - Transplantation de moelle osseuse : Les souris recevront une greffe de moelle osseuse par une injection dans une veine située derrière l'œil.
Devenir
À la fin des procédures, les animaux sont mis à mort et les organes prélevés post mortem pour analyse .
Remplacement
L'utilisation du modèle animal est indispensable ici, car il n'est pas possible de reproduire la complexité des interactions entre les différents types de cellules immunitaires, telles que les cellules qui protègent l'organisme contre les infections, et notre champignon naturellement présent dans le corps (appelé commensal), au niveau de la langue, dans des modèles en laboratoire. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaires pour notre étude en utilisant un calculateur en ligne, en prenant en compte des critères scientifiques importants comme la précision des résultats, le niveau de confiance et la différence attendue entre les groupes étudiés. Pour analyser les données, nous utiliserons des tests statistiques adaptés qui ne supposent pas que les données suivent une distribution particulière.
Raffinement
Notre animalerie suit des normes strictes pour minimiser les risques d'infection et assurer le bien-être des animaux. Les souris sont logées dans des cages conformes aux directives européennes, avec suffisamment d'espace pour se déplacer et exprimer leurs comportements naturels. Chaque cage contient des matériaux pour que les souris puissent construire des nids, et les conditions de température, d'humidité et de lumière sont soigneusement contrôlées. Lors de certaines procédures, les souris sont anesthésiées pour éviter toute douleur, et nous prenons plusieurs précautions pour leur confort, comme l'utilisation de coussins chauffants et de gel pour les yeux. Nous utilisons une souche de champignons qui ne cause pas d’infections graves aux souris, et nous surveillons de près leur état de santé pour intervenir rapidement si nécessaire. Pour minimiser le stress, les injections sont faites par des professionnels expérimentés. En cas de faiblesse immunitaire temporaire due aux traitements, un antibiotique est ajouté à l'eau de boisson des souris pour les protéger. Nous nous engageons à respecter le bien-être animal tout au long de l'étude.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation, et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal pour l’étude du système immunitaire. De plus, le modèle murin est un modèle de choix grâce à l'existence de souris génétiquement modifiées. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit à partir de 6 semaines, car c'est à ce stade que leur système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel. Cela garantit des résultats pertinents et reproductibles pour les études portant sur les réponses immunitaires, qui pourraient différer chez des animaux en cours de développement.
Impact d’un régime pauvre en magnésium sur les globules blancs
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Savoir si un régime privé de magnésium modifie la circulation des globules blancs chez des souris porteuses d'une mutation humaine rare : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, de la moelle osseuse, de la rate, du thymus et des ganglions. Elles reçoivent pendant tout le protocole une nourriture sans magnésium ou une nourriture témoin, et subissent cinq prises de sang sans anesthésie, maintenues à la main une trentaine de secondes. La mutation qu'elles portent reproduit le syndrome WHIM, caractérisé chez les patients par un taux extrêmement faible de globules blancs. Le porteur affirme pourtant que cette modification génétique est sans effet sur le bien-être des souris.
Objectifs
Une famille de molécules présentes à la surface des cellules du système de défense de l'organisme sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires : migration, survie, différenciation. C'est le cas des molécules CXCL12 et CXCR4. La liaison entre ces deux molécules induit un signal qui va notamment induire la migration des globules blancs. Des mutations dans le gène qui permet la production de CXCR4 provoquent le Syndrome WHIM (SW), une pathologie rare caractérisée par un taux extrêmement faible de globules blancs dans le sang. Afin de mieux comprendre cette maladie et les implications du couple CXCR4/CXCL12, un modèle de souris porteur d'une mutation de CXCR4 identifiée chez les patients a été généré. Il a été montré que CXCR4 et CXCL12 contrôlent la production des globules blancs dans la moelle osseuse ainsi que leur mouvement entre la moelle osseuse, le sang et les autres organes. De plus le magnésium est connu pour réguler le trafic cellulaire. Le but de ce projet est donc d’évaluer si un régime pauvre en magnésium impacte le trafic cellulaire dans le contexte de la mutation de CXCR4.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer si une modification du régime alimentaire peut améliorer les défauts causés par une mutation de CXCR4 et en particulier le nombre de globules blancs dans le sang. Cela pourrait avoir un effet direct et bénéfique sur la prise en charge des patients SW.
Procédures
A partir de jour 0, les souris recevront une alimentation contrôle ou une alimentation sans magnésium (croquettes à volonté). Une fois par semaine pendant toute la durée du protocole, la nourriture sera pesée pour s'assurer que l'apport calorique est suffisant. A plusieurs jours d'intervalle, les souris seront pesées et du sang sera prélevé sans anesthésie (cinq prélèvements). Le geste durera environ 30 secondes. Les animaux seront observés dans les 10 minutes après le prélèvement sanguin (avant leur remise en place dans la pièce d'hébergement) pour s'assurer de leur bien-être (absence de saignement, mobilité normale).
Impact sur les animaux
Le prélèvement sanguin nécessite que la souris soit manuellement maintenue pendant quelques secondes ce qui peut être source d’inconfort pour l’animal. Aucun geste n’est répétitif. Il n’y pas d’effet sur le bien-être de la souris du fait de la modification génétique. Les données de la littérature scientifique n’ont pas rapporté d’effet indésirable des régimes pauvres en magnésium.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. Des organes (sang, moelle osseuse, rate, thymus, ganglions lymphatiques) seront prélevés et analysés après euthanasie.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la génération des globules blancs et le trafic cellulaire entre les organes, à l’heure actuelle, ne peuvent être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Sur la base de notre expérience de l’analyse de ce modèle nous avons optimisé la taille des groupes afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de réduire la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé afin de vérifier leur bien-être. Une évaluation plus approfondie sera réalisée tous les jours les 3 premiers jours puis une fois par semaine si aucune perte de poids ni changement n’est observé. Les critères sont notés. Lorsqu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés, pouvant être l'euthanasie anticipée de la souris.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. Ce modèle étant de mieux en mieux connu du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, le modèle génétiquement modifié pour notre molécule d’intérêt existe et reproduit la pathologie humaine, l’utilisation du modèle murin est donc légitime et pourrait permettre une transposition à l’homme. Nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Toutes les expériences sont réalisées sur des souris adultes, car la pathologie apparaît chez l'Homme adulte.
Identification de facteurs de transcription impliqués dans la réparation de la peau après blessure
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est génétiquement modifiée pour que leurs macrophages soient privés des deux molécules étudiées. 1 104 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacune reçoit une plaie chirurgicale sur le dos entre les omoplates, puis est rendormie deux fois par semaine pendant trois semaines pour l'observation de la cicatrisation et le changement de pansement. Elles sont mises à mort à la fin du suivi, leurs tissus servant aux analyses post mortem qui closent le projet.
Objectifs
Une meilleure compréhension des mécanismes permettant la réparation de la peau est un enjeu de santé publique. L'avancée de nos connaissances dans ce domaine pourrait permettre l’amélioration du traitement d’épisodes cliniques aiguës (brûlure, choc mécanique, …) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance de ces processus, les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire sont encore mal connus. Des données de la littérature montrent que certaines cellules de l’immunité synthétisent des molécules bénéfiques pour la cicatrisation, en particulier des cellules appelées macrophages . En utilisant un modèle in vitro, nous avons identifié deux molécules, des facteurs de transcription, qui régulent la production par les macrophages d’une partie des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. Les facteurs de transcription sont des molécules qui contrôlent généralement l'expression d'un grand nombre de gènes. Nous faisons donc l'hypothèse qu'à travers une étude plus poussée de ces deux facteurs de transcription dans les macrophages lors de la réparation cutanée, nous pourrons identifier de nouvelles molécules impliquées et ainsi faire progresser significativement notre compréhension globale des mécanismes de la réparation tissulaire. Le projet comporte deux objectifs : 1- déterminer si les résultats obtenus in vitro sont valides dans une situation de réparation tissulaire physiologique à l’échelle d’un organisme entier, 2- identifier de nouveaux acteurs moléculaires de la cicatrisation qui interagissent dans les macrophages avec les facteurs de transcription déjà identifiés. Pour atteindre ces objectifs, il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de cicatrisation cutanée. Ce modèle reproduit les étapes de cicatrisation tissulaire observée chez l’homme, et nous permet d'étudier le rôle de nos molécules d'intérêt dans un environnement complexe plus représentatif d’une situation physiologique. Nous comparerons des souris normales et des souris qui ne possèdent pas ces molécules dans les macrophages. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de réparation tissulaire.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la réparation des tissus après une lésion. En particulier, ces résultats permettront d’identifier de nouvelles molécules contrôlant la fonction des macrophages au cours de la réparation tissulaire. Ces nouvelles molécules pourront être étudiées plus en détails dans de futurs projets, contribuant à l’avancée des connaissances scientifiques. De plus, il est établi que les macrophages jouent un rôle central dans les pathologies inflammatoires quand leur fonction de réparation est altérée, par exemple dans les ulcères, les plaies chroniques des patients diabétiques, et les fibroses (accumulation de tissu fibreux pathologique). De plus, cette fonction de réparation est également diminuée chez les sujets âgés, sans que l’on en comprenne les mécanismes. Mieux connaître les acteurs moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire dans les macrophages permettra ainsi de formuler de nouvelles hypothèses sur les causes du dysfonctionnement des macrophages dans des conditions pathologiques. Les nouvelles molécules identifiées dans ce projet pourront ainsi représenter de nouveaux candidats pour des approches thérapeutiques afin d’améliorer la régénération tissulaire et d’empêcher la fibrose dans les pathologies inflammatoires chroniques.
Procédures
Dans notre modèle, nous créons une petite blessure sur la peau des souris, et nous observons ensuite la cicatrisation au cours du temps, en prenant soin de protéger la plaie par des pansements. Pour cela, chaque animal sera anesthésié le temps de la procédure (environ 10 min), puis sera anesthésié à nouveau afin d'observer la cicatrisation et de changer le pansement (environ 3 min à chaque fois, 2 fois par semaine, pour une durée maximale de 3 semaines) .
Impact sur les animaux
Les animaux, sous anesthésie, subiront une chirurgie légère afin de créer une petite blessure sur la peau au niveau du dos entre les omoplates. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide), risque d'hypothermie (modérée et rapide) et douleur liée à une blessure cutanée (modérée et de courte durée). Dans de rares cas, il est également possible que la plaie puisse s'infecter. Les nuisances attendues dans ce cas sont : douleurs liées à une infection (modérée et de courte durée).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des données de la littérature montrent que les macrophages, chez l’Homme comme chez la souris, produisent des molécules bénéfiques pour la réparation tissulaire. Nos données obtenues in vitro dans des modèles de culture cellulaire montrent que nos molécules d'intérêt régulent l’expression d’une partie de ces molécules bénéfiques. Nous souhaitons donc maintenant confirmer nos résultats dans un modèle in vivo. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La peau est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier les macrophages. Ainsi, les macrophages de la peau ont certainement des propriétés différentes de celles de tout autre organe. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro à ce jour malgré l’existence de modèles de peau ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires nécessaires pour la cicatrisation cutanée. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d’outils statistiques, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 12 (4 animaux par expérience, expériences répétées 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Dans notre expérience préalable de ce modèle de cicatrisation, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans la cicatrisation de la peau.
Raffinement
Dans le cadre de ce modèle de blessure cutanée, un analgésique est administré aux animaux lors de la chirurgie. Les animaux sont surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins post-opératoires spécifiques seront mis en place si nécessaire (par exemple en cas de douleur ou d'infection de la plaie). Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés (telles que des souris transgéniques déficientes pour notre molécule d’intérêt ou des techniques d’analyse d’expression de gènes), ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux