Système immunitaire

Tuées au sevrage si elles n'ont pas le bon génotype ou le bon sexe, tuées après deux mois sans portée si elles ont servi à la reproduction, tuées à vingt semaines pour les femelles et trente pour les mâles si elles attendaient un accouplement : le devenir des souris de cet élevage tient en trois motifs d'élimination. 3 360 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 320 d'entre elles restant en vie pour l'élevage. Chacune subit le prélèvement d'un fragment de queue de moins de deux millimètres pour génotypage, opéré en une dizaine de secondes sur animal éveillé, avec une seconde biopsie à l'oreille en cas d'échec. Le porteur indique que la méthode de génotypage sur poil, qui éviterait de couper la queue, "n'est pas encore disponible" dans son animalerie.

Objectifs

Ce projet explore la contribution de certaines cellules immunitaires dans une maladie pulmonaire chronique et mortelle pour laquelle il n'existe à ce jour aucun traitement curatif. Dans ce contexte, nous utiliserons des lignées de souris comme modèles d'étude: une lignée surexprimant ces cellules immunitaires, une lignée exprimant un faible nombre et une lignée dépourvue de ces cellules immunitaires. Ces 3 lignées ne développent pas spontanément de maladie, les modifications génétiques dont elles sont porteuses ne génèrent pas d’inconfort. Pour ce projet, nous avons tout d'abord besoin d’étudier l'ADN de ces souris (prélèvement d'un petit bout de leur queue) pour s'assurer de la présence de la mutation qui permet la diminution des cellules de défense avant de pouvoir réaliser des accouplements des souris ou de réaliser des expérimentations.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre, par la caractérisation génétique des animaux, l’optimisation de la gestion des élevages et la production d’animaux pour étudier le rôle de certaines cellules du système immunitaire dans le développement d'une maladie respiratoire sévère et incurable. Au-delà des aspects de recherche fondamentale, l’utilisation de ces lignées de souris pourraient nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de ce type maladie

Procédures

Un prélèvement unique d’un fragment de tissu au niveau de la queue (durée de 10 secondes sur animaux vigiles) sera réalisé. Dans les cas d’absence de matériel génétique (évènement extrêmement rare) au moment du génotypage une nouvelle biopsie unique sera réalisée au niveau de l'oreille (durée de 10 secondes sur animaux vigiles).

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue (moins de 2 mm) peut causer une brève douleur et un léger saignement qui sera monitoré et arrêté par une légère pression exercée localement. Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Chlorhexidine).

Devenir

Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées pour prélèvement d’organes post-mortem, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes ou le bon sexe seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).

Remplacement

Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des expériences in vitro et des co-cultures de cellules pulmonaires humaines et de cellules immunitaires. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d’un organe entier vivant dans le cas du développement de la maladie respiratoire étudiée. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires dans un modèle animal. Au vu de l’organisation de l’équipe et des expérimentations prévues, il est nécessaire d’avoir un marquage des animaux par tatouage aux phalanges et un prélèvement de queues pour génotypage, qui correspond à la technique validée au sein de l’équipe. La technique de génotypage par prélèvement de poil n'étant pas encore disponible dans notre animalerie.

Réduction

Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche de l'équipe. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris transgéniques (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. En effet, le nombre de couples en reproduction est monitoré au plus près afin de l’adapter en temps réel aux besoins expérimentaux. A cette fin, les animaux sont génotypés au moment du sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêts pour d'autres projets.

Raffinement

Le prélèvement de tissu au niveau de la queue sera réalisé selon une méthode éprouvée, précise et standardisée, ce qui limitera les effets indésirables tels que le stress et la douleur. L’absence se saignement sera surveillée dans les minutes qui suivent le prélèvement. Dans le cas contraire, une compression sera réalisée afin de favoriser la coagulation sanguine. De plus un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé afin de vérifier leur bien-être. Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Chlorhexidine).

Choix des espèces

L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles murins de la maladie pulmonaire étudiée sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques observés chez l’homme. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules immunitaires étudiées dans le projet sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. Les animaux seront identifiés et génotypés dès que le sexage est possible (5 à 10 jours). Cela permet de rapidement déterminer le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux. Les souris seront mises en accouplement à l’âge adulte (au moins 8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle, et au maximum à 15 semaines au début de l’accouplement.

Une partie des souris utilisées est immunodéprimée ou immunodéficiente par construction, donc sans défense face au moindre pathogène. 136 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réparties en trois protocoles de 24, 32 et 80 animaux. Elles reçoivent des injections d'immunoglobulines A pour reproduire une néphropathie rénale, des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis un traitement dilué dans l'eau de boisson pendant 8 à 22 semaines selon les groupes. Toutes sont tuées à la fin pour prélever les organes, alors que le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu, ni perte de poids ni douleur ni comportement anormal, y compris chez les souris immunodéficientes.

Objectifs

L’immunoglobuline A (IgA) est une molécule du système immunitaire qui peut à la fois protéger contre les infections et, dans certains cas, provoquer des maladies. Dans la néphropathie à dépôts mésangiaux d’IgA (NIgA), ces molécules s’accumulent dans les reins, causant des dommages progressifs pouvant mener à une insuffisance rénale grave. Même si des recherches ont été menées, les mécanismes exacts de cette maladie restent mal compris et il n’existe pas encore de modèle complet pour l’étudier. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre cette maladie en travaillant sur deux axes principaux : l’étude des caractéristiques des IgA responsables de ces dommages et l’identification des processus qui conduisent à leur production. Le premier objectif est d'explorer les propriétés des IgA qui favorisent leur dépôt dans les reins. Il est établi que les IgA impliquées sont modifiées par des sucres (glycosylées), mais cette seule caractéristique ne suffit pas à tout expliquer. La tendance des IgA à former des amas (polymérisation) est également considérée comme un facteur clé contribuant à leur dépôt. Pour valider cette hypothèse, des modèles murins passifs ou reproduisant la NIgA seront utilisés afin de déterminer si le blocage de cette polymérisation réduit les dépôts d'IgA dans les reins. Le second volet du projet vise à empêcher la production des IgA dysfonctionnelles. Des recherches récentes ont montré que certains globules blancs (les lymphocytes B) jouent un rôle important dans cette maladie. Nous proposons donc d’utiliser une molécule agissant contre ces cellules et ayant montré des effets positifs chez des patients atteints de NIgA. Nous testerons également une antibiothérapie pour réduire la stimulation de ces lymphocytes. Les deux traitements seront testés séparément et ensemble afin de déterminer leurs effets synergiques. En fin de compte, nous espérons que cette approche intégrée permettra de mieux comprendre les mécanismes de production des IgA impliquées dans la maladie et de développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces pour prévenir leur dépôt dans les reins.

Bénéfices attendus

La NIgA est une des maladies rénales les plus fréquentes chez l'adulte, et l'une des principales causes d'insuffisance rénale terminale. Cependant, les mécanismes de cette maladie restent mal compris, rendant les traitements actuels peu spécifiques. Bien que certaines études aient mis en lumière des mécanismes impliqués, elles n'ont pas encore permis de proposer des solutions thérapeutiques adéquates. Ce projet a pour objectif premier d'identifier les caractéristiques des IgA responsables de la maladie. Ces découvertes pourraient améliorer la compréhension de celle-ci et ouvrir la voie à de nouveaux traitements, comme le développement d'anticorps qui ciblent spécifiquement les IgA anormales, ou des thérapies ciblées (géniques) visant à corriger la production de ces molécules. En cohérence avec cet objectif, dans la deuxième partie du projet nous souhaitons réussir à cibler une population cellulaire à l’origine de la production de ces IgA. Par ces traitements, nous espérons mieux caractériser ces cellules mais aussi limiter la dégradation de la fonction rénale. En somme, ce projet pourrait, à terme, conduire à des avancées significatives à la fois dans la compréhension des mécanismes sous-jacents à la NIgA et dans le développement de traitements plus spécifiques et efficaces.

Procédures

Dans ce projet, trois procédures différentes ont été définies. Dans la première, les souris recevront 2 injections, une première de la molécule capable d'empêcher la polymérisation des IgA, puis une deuxième d'IgA afin de reproduire passivement la maladie. En parallèle, un prélèvement de sang sera réalisé avant toutes injections. La seconde procédure sera réalisable uniquement si la première donne des résultats convaincants. Concernant celle-ci, un groupe recevra la molécule dans l'eau de boisson pendant 8 semaines et l'autre de l'eau de boisson classique. Pendant ces 8 semaines, 4 prélèvements sanguins seront réalisés, c’est-à-dire une fois au début du traitement puis toutes les 2 semaines. Ils nous permettront de suivre l'évolution du taux d'IgA dans le sang des souris traitées par rapport aux contrôles. Enfin pour la troisième et dernière procédure, nous souhaitons tester des traitements sur différents groupes de souris. 4 groupe seront formés, pour que le premier reçoive de la molécule d’intérêt diluée dans l'eau de boisson pendant 22 semaines. Un autre, recevra une antibiothérapie aussi diluée dans l'eau de boisson pour une durée de 8 semaines. Le troisième recevra une combinaison des 2 traitements précédents. Le traitement par la molécule d’intérêt ainsi que l'antibiothérapie seront démarrés en simultané. Cependant l'antibiothérapie ne durera que 8 semaines alors que le traitement par la molécule sera prolongé jusqu'à 22 semaines. Le dernier groupe recevra de l'eau de boisson classique afin de servir de groupe témoin.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, tous les traitements testés ont déjà fait l’objet de publications scientifiques. Pour chacun d’eux, aucun effet indésirable comme la perte de poids, la douleur, le stress ou des comportements anormaux n’ont été notifiés. Malgré le fait que les modèles utilisés dans ce projet soient immunodéprimés ou immunodéficients, aucun autre effet indésirable ou secondaire ne devrait être observé. En effet, ces modèles sont élevés dans des conditions particulières ne laissant pas leur phénotype dommageable s’exprimer en l’absence de contact avec des pathogènes. Concernant l’étape du projet utilisant le modèle murin passif de NIgA, ces souris seront manipulées plusieurs fois en peu de temps. Cela pourrait provoquer une léger stress. Néanmoins, l’expérimentation étant de courte durée, celui-ci ne se manifestera pas ou sera de courte durée. Enfin, dans ce projet, des prélèvements sanguins vont être réalisés. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés, et la douleur au réveil de ceux-ci ne sera que de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de chacune des procédures (24 + 32 + 80 = 136) seront euthanasiés à la fin de celles-ci. Le but étant d'étudier les effets des différents traitements qui leur auront été administrés de manière approfondies.

Remplacement

La néphropathie à IgA est une maladie complexe qui résulte de l'interaction de plusieurs facteurs. Les études réalisées en laboratoire sur des cellules isolées (modèles in vitro) sont utiles pour examiner certains aspects de la maladie, mais ne peuvent pas reproduire la complexité des interactions du corps humain. Par exemple, elles ne permettent pas d'observer comment les tissus et les cellules interagissent, comment le système immunitaire réagit, ou comment la maladie progresse au fil du temps. De plus, ces modèles en laboratoire ne permettent pas d'évaluer les effets des traitements de manière globale, ce qui est essentiel pour des maladies comme la NIgA. C'est pourquoi l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie et développer des traitements efficaces.

Réduction

Les manipulations seront réalisées de façon indifférente sur des mâles et des femelles, permettant ainsi une réduction du nombre d'animaux générés dans l'élevage. À la fin de l'expérimentation, les souris sont euthanasiées et tous les organes d'intérêt seront prélevés, maximisant ainsi les données obtenues par animal. Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires par groupe, nous nous basons sur des études précédentes publiées dans la littérature scientifique sur la NIgA. Ces études indiquent qu'un échantillon de 8 animaux par groupe est généralement suffisant pour détecter des différences statistiquement significatives avec une puissance adéquate. Pour l’analyse des expériences, nous utiliserons des tests statistiques adaptés. Cette approche rigoureuse garantit que le nombre d'animaux utilisés est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Le nombre d’animaux par cage sera contrôlé pour nos expérimentations afin d’éviter le surpeuplement. De plus, une surveillance quotidienne de l’état général des animaux sera effectuée par du personnel qualifié. Des points limites seront établis et adaptés aux procédures mises en place, incluant des critères d'évaluation spécifiques pour identifier rapidement tout signe de détresse ou de souffrance. Toutes les précautions d’usage seront mises en œuvre en termes d’anesthésie et d'analgésie afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus adapté pour ce projet pour plusieurs raisons. Tout d'abord, le fonctionnement des reins chez la souris est similaire à celui de l'homme. Elles possèdent des structures rénales et des mécanismes de filtration proches de ceux des humains, ce qui est essentiel pour étudier des maladies rénales comme la NIgA. De plus, la majorité des modèles expérimentaux de NIgA actuellement disponibles sont murins. Ces modèles ont été bien caractérisés et validés, ce qui nous permet de bénéficier d'une base de données robuste et d'une littérature scientifique étendue. Les souris génétiquement modifiées, offrent des outils puissants pour disséquer les mécanismes sous-jacents de la maladie. Enfin, les souris présentent également l'avantage qu'elles ont un temps de génération court, sont faciles à manipuler et à maintenir. Tous les animaux seront utilisés à des âges soigneusement sélectionnés pour garantir la réalisation optimale des analyses nécessaires au bon déroulement du projet. Pour les souris immunodéficientes, nous opterons pour un spectre assez large d'âge compris entre 2 et 6 mois, car celui-ci n’aura pas d’incidence majeure sur la procédure ou les résultats obtenus. Leur âge ne constituera pas un facteur critique. En revanche, pour les souris des deux modèles reproduisant la NIgA, nous commencerons leur utilisation 4 semaines après leur naissance, au moment du sevrage. Ainsi, elles auront atteint une maturité physiologique adéquate pour des expérimentations fiables. Ce choix est essentiel, car il nous permettra d'analyser l'effet des traitements à mesure que la maladie évolue naturellement chez les souris. En synchronisant l’administration des thérapies avec l'évolution de la maladie, nous espérons mieux comprendre l'impact des interventions à différents stades de développement, et en particulier si les traitements peuvent ralentir, stabiliser ou inverser les dépôts d'IgA et les lésions rénales. Cela garantira également que les comparaisons entre les groupes traités et non traités soient réalisées dans des conditions de progression de la maladie aussi homogènes que possible. Ainsi, la planification de l'âge des souris à utiliser dans chaque phase expérimentale a été pensée pour maximiser la pertinence des observations tout en tenant compte des spécificités de chaque modèle.

5 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, pour une seule intervention chacune, une injection dans l'abdomen, parfois deux à vingt-quatre heures d'intervalle. Les femelles gestantes reçoivent le produit destiné à perturber ou à marquer la production des cellules sanguines de leurs embryons, dont le système immunitaire est ensuite analysé jusqu'à l'âge adulte. Le porteur qualifie la douleur de légère et de courte durée, et signale l'isolement des mâles reproducteurs comme un autre effet indésirable. L'effectif découle du nombre de portées nécessaires, et le porteur annonce une méthode de traçage cellulaire qui devrait le diviser par deux à moyen terme.

Objectifs

Il a été démontré que les perturbations de l'environnement maternel peuvent entraîner des changements durables dans les cellules au cours du développement, contribuant au développement de maladies à l'âge adulte. La plupart des perturbations pendant la grossesse (mutations génétiques, infections, diète) provoquent de l’inflammation chez la mère qui peut passer la barrière placentaire et perturber l’embryon en cours de développement. L’objectif général de ce projet est donc de mieux comprendre (1) les mécanismes contrôlant la mise en place du système sanguin et immunitaire au cours du développement embryonnaire et (2) leur réponse suite à des perturbations pendant la grossesse. Notre projet vise donc à la fois à approfondir les connaissances fondamentales sur le développement du système immunitaire pendant la vie fœtale et à appliquer ces connaissances à des questions d’ordre médicale en utilisant la souris comme modèle pour l’analyse de pathologies humaines d’origine génétique ou infectieuse. A ce jour, comment l’inflammation de la mère affecte le système immunitaire en cours de construction de l’embryon et quelle sont les conséquences à long terme, c’est à dire dans la vie adulte, sont méconnues. L’objectif du projet est de répondre à 3 principales questions : + Comment sont produites l’ensemble des cellules sanguines de l’embryon ? + Pourquoi certaines mutations génétiques perturbent l’hématopoïèse de l’enfant et beaucoup moins celle de l’adulte ? + Comment une infection virale en cours de gestation peut perturber le fonctionnement du système de production des cellules sanguines adulte et sur quelle période ?

Bénéfices attendus

Grace à ce projet, nos approfondirons nos connaissances sur la mise en place du système hématopoïétique de l’embryon. En particulier, nous mettrons en évidence comment des infections pendant la grossesse, telles que les infections virales chez la femme enceinte, perturbent la production de cellules immunitaires à court et long terme au cours de la vie post-natale. De plus, une partie importante du projet présente une orientation plus médicale. Il s’agit en particulier de l’étude de maladies génétiques touchant la petite enfance. Ce projet nous permettra d’identifier les cellules à l’origine de certaines maladies pédiatriques dans des modèles murins adaptés. Une meilleure compréhension de ces pathologies pourra bénéficier, à long terme, à des domaines plus appliqués de la recherche médicale, particulièrement dans le domaine de la pédiatrie. .

Procédures

La seule intervention prévue sur les animaux est une injection intrapéritonéale de produits. Les animaux vigiles seront pris en main quelques secondes pour l’injection intra-abdominale. Celle-ci sera généralement unique. Si deux injections sont nécessaires, elles auront lieu å un intervalle d’au moins 24h.

Impact sur les animaux

Les injections de petit volume requièrent une contention manuelle et l’introduction d’une aiguille en intra-abdominale. Une seule procédure requerra deux injections distantes d’au moins 24 heures. Réalisée selon les bonnes pratiques vétérinaires, ces gestes provoquent chez les animaux une douleur légère et de courte durée.

Devenir

Tous les animaux soumis à une procédure seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyser leur système immunitaire dans différents organes et ils ne pourront donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

A ce jour, il n’y a aucune alternative non animale disponible pour étudier le développement des fœtus à partir du deuxième trimestre de gestation chez les Mammifères. Comprendre comment se construit le système immunitaire in utero nécessite d’étudier des interactions multiples entre organes et types cellulaires au cours de tout le processus de gestation. Ceci ne peut donc pas être reproduit dans des modèles in vitro de type organoïdes. De plus, pour comprendre comment des perturbations au cours de la grossesse impactent la santé des individus, nos études nécessitent l’étude d’organismes entiers.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique. Pour affiner cette estimation, nous disposons de l’aide et des recommandations d’un service de biostatistique qui nous guide pour calculer au plus juste l’effectif nécessaire à chaque type d’expérience afin d’éviter une utilisation excessive d’animaux ou, à l’inverse, une sous-estimation de ce nombre qui entrainerait l’obtention de résultats ininterprétables. De plus, nous mettons en place dans ce projet une nouvelle approche de traçage cellulaire permettant de combiner le marquage et suivi de deux populations distinctes dans un même individu. Ceci permettra, à moyen et long terme, de réduire de moitié les animaux nécessaires. En effet, actuellement deux cohortes indépendantes utilisant chacune un seul système de marquage sont nécessaires et grâce à notre nouvelle approche une seule permettra de combiner les deux.

Raffinement

Les seules interventions pouvant provoquer une gêne physique sont les injections intra-abdominales. Pour limiter les nuisances au maximum, ces injections seront réalisées par du personnel formé à cette procédure. Les seringues seront à usage unique. Les injections seront réalisées dans une pièce isolée de façon à ne pas provoquer de stress sur le reste des animaux. Un autre effet indésirable sur le bien-être animal est la solitude des mâles reproducteurs. De façon à limiter les effets néfastes de cet isolement, les femelles seront laissées aussi longtemps que possible avec les mâles. De plus, l’enrichissement des cages sera maximalisé selon les recommandations du service du bien-être animal de notre animalerie. Enfin, les animaux ne seront pas conservés isolés sur une longue période, mais plutôt de façon épisodique au moment du renouvellement des accouplements.

Choix des espèces

• Les souris sont des petits Mammifères qui partagent de nombreuses similarités avec l’homme. • La souris est l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants sur le développement in utero des mammifères. • Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche • Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. • Relativement facilement consanguines, ce qui permet une meilleure homogénéité dans nos populations. • De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier l’hématopoïèse. • Des modèles de maladies humaines, à la prévention ou à la thérapie desquelles nous souhaitons tout particulièrement contribuer, ont été développés chez les souris de laboratoire (exemple : Mutations génétiques). Le but général de ce projet est d’étudier les perturbations de la production des cellules sanguines au cours du développement embryonnaire précoce et d’analyser leurs conséquences sur le système immunitaire tout au long de la gestation et, ensuite, chez le nouveau-né et au cours de la vie adulte. La production des cellules sanguines commence, chez la souris entre le 8ème (E7,5) et le 9ème (E8.5) jour de gestation, sur une durée totale de 19-20 jours. De ce fait, les injections faites aux femelles gestantes pour perturber la production des cellules sanguines ou pour marquer génétiquement les cellules concernées, seront faites essentiellement entre le 9ème et 10ème jour (E8,5 à E9,5) et les embryons seront analysés à intervalles réguliers (E9,5 à E18,5 = veille de la naissance). Pour l’analyse des conséquences sur le système immunitaire après la naissance, les stades choisis seront P2 (2ème jour après la naissance), P15 (15ème jour après la naissance) et P42 (6 semaines après la naissance). Ces stades ont été choisis car ils représentent des stades clés du développement post-natal chez la souris : un stade juste après la naissance (P2), un stade avant le sevrage (P15) et un stade adulte post-puberté (P42).

Issues de lignées sélectionnées sur leur réponse immunitaire depuis 1994, 4 200 poules et coqs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une prise de sang, à la veine alaire ou au sinus occipital, pour établir son pedigree, puis une seconde en fin de cycle de reproduction. Deux cents d'entre eux reçoivent en plus une injection de phytohémagglutinine sous la peau de l'aile, dont l'épaississement est mesuré au comparateur digital pendant 24 heures, la sélection reposant sur l'ampleur de cette inflammation. Aucun modèle alternatif n'existe selon le porteur, qui prévoit de replacer les reproducteurs vivants à l'âge de réforme, de les vendre "dans la mesure du possible", ou de les tuer.

Objectifs

Ce projet présente les différentes opérations réalisées pour renouveler et entretenir les lignées de poules sélectionnées sur leur réponse immunitaire et une lignée témoin. Elles sont toujours actuellement soumises à un processus de sélection. Les lignées réponses immunitaires ont été initiées en 1994 pour servir de matériel unique à l’identification des mécanismes et des gènes impliqués dans les réponses immunitaires. C'est un matériel expérimental original pour appréhender les relations complexes entre caractères de santé et leur contrôle génétique. Elles ont été utilisées pour des tests de résistance à des maladies, croisées avec d'autres lignées, analysées pour des recherches de signatures de sélection. Ce projet porte sur l’élevage des jeunes et adultes de ces modèle animaux uniques.

Bénéfices attendus

L’étude de ces lignées permettra à terme de mieux comprendre (court/moyen terme) l’origine du niveau de réponses immunitaires et de faciliter la mise au point d’approches efficaces de lutte se basant sur la modulation de la sélection génétique, en complément des méthodes prophylactiques, déjà existantes, en identifiant des marqueurs génétiques ou microbiens qui pourront être utilisés en sélection ou bien pour mettre au point une modulation du microbiote intestinal par l’alimentation ou les pratiques d’élevage. Ces approches permettront de limiter la propagation des maladies en élevage et donc de limiter de nombre de troupeaux abattus, et de réduire la contamination humaine via l’ingestion de produits aviaires contaminés (viande, œufs).

Procédures

Une prise de sang, à la veine alaire ou au sinus occipital, sera effectuée entre 2 et 18 semaines d'âge pour pouvoir génotyper les animaux et ainsi déterminer leur pedigree. Une seconde prise de sang sera réalisée en fin de cycle de reproduction pour évaluer la réponse vaccinale. L’intervention a une durée inférieure à une minute. Pour les 200 animaux d'une des lignées , la sélection est basée sur le niveau de réponse immunitaire par réponse inflammatoire de sensibilité dermique retardée, en utilisant la réponse sur la variation d’épaisseur à l'aide d'un comparateur digital sur 24h de la membrane alaire suite à une injection de phytohémagglutinine par voie sous-cutanée (ou intra-dermique). Cette injection est réalisée à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les prises de sang alaires et l'injection de phytohémagglutinine (PHA) pourront être une source de stress, en raison de la contention nécessaire et de la piqûre. Les prises de sang peuvent éventuellement engendrer des hématomes.

Devenir

Nous utilisons ici nos individus pour permettre la production d'une descendance. Arrivés à l'âge de réforme, les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de les replacer en vif ou de les valoriser pour leur viande qui est tout à fait consommable.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de maintenir 3 lignées dont l’étude permet la compréhension des rôles combinés des réponses immunitaires chez la poule. Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle alternatif permettant de remplir ces objectifs.

Réduction

Les effectifs de reproducteurs utilisés permettent en théorie de gérer la consanguinité déjà très élevée de nos populations. Par calcul, les tailles efficaces des populations devraient être plus importantes, cependant la variabilité génétique de notre caractère est peu renseignée. L'objectif des maintiens des populations est de disposer d'animaux.

Raffinement

Les poules et les coqs hébergés en groupe bénéficient d’un milieu enrichi, notamment par des perchoirs et de la proximité avec leurs congénères, permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les animaux feront l’objet de surveillance classique et toute manifestation de détresse ou de maladie prise en considération pour envisager le retrait des animaux (mise à l'infirmerie) ou leur euthanasie si besoin. Dès l'éclosion, les animaux sont élevés en groupe au sol puis en cages collectives à partir de 18 semaines. Les cages collectives hébergeant les poules et les coqs seront équipées de divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques et des bandelettes de tissu pour stimuler le jeu. Un isoloir sera également présent à une extrémité des cages pour offrir aux animaux un espace de cachette. Pour prévenir le picage, des répulsifs antipicage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision, destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite), a été développé et sera fourni aux animaliers en charge du suivi des animaux. Raffinement de la procédure : Cas de la prise de sang au sinus occipital : afin de réduire le risque de lésions cérébrales pouvant être associé à la réalisation d'un prélèvement de sang au sinus occipital, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille afin d'éviter toute possibilité d'enfoncer l'aiguille trop profondément. La facilité de visualisation de ce site d'injection évite l'arrachage de plumes douloureux pour les animaux. Un point de compression de 30-60s sera effectué pour limiter également la formation d'un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour une prise de sang afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital auront reçu une formation spécifique à ce geste et seront des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Cas de la prise de sang effectuée à la veine alaire : un point de compression sera effectué et deux expérimentateurs seront mobilisés.

Choix des espèces

Le projet vise la compréhension de la réponse immunitaire chez l’animal, la complexité du déterminisme de ce critère nécessite une approche globale (voies physiologiques impliqués, leurs régulations et interactions) et ne peut donc être abordée que par une approche sur les animaux. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 9 moins, moment auquel ils seront mis en reproduction pour produire les poussins de la génération suivante. Lorsque leurs descendants auront 15 jours d’âge, ces reproducteurs mâles et femelles sont vendus dans la mesure du possible ou euthanasiés.