Système immunitaire

Chacun des 8 singes verts d'Afrique utilisés subit environ quinze anesthésies, quinze prélèvements de sang, quatre ponctions de moelle osseuse et sept retraits chirurgicaux de ganglions lymphatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont d'abord infectés par le virus de l'immunodéficience simienne, l'espèce étant choisie parce qu'elle héberge naturellement ce virus sans développer le sida. Le porteur annonce comme effets possibles une perte de poids, des diarrhées, une baisse sévère des lymphocytes, des lésions cutanées, une anémie transitoire, des hématomes, et un stress lié à l'hébergement individuel des animaux qui présentent des symptômes. Tous seront tués en fin de projet pour accéder à l'ensemble de leurs organes lymphoïdes, les tissus prélevés étant ensuite "mis à disposition pour d'autres études".

Objectifs

Actuellement, il n'existe ni vaccin, ni traitement curatif contre le VIH. Pour avancer dans ce domaine, nous utilisons le singe vert africain (AGM) comme modèle. Ces singes, hôtes naturels d’un virus proche du VIH appelé SIV (virus de l'immunodéficience simien) ne développent pas le SIDA malgré une charge virale élevée. Cette résistance remarquable est due à leur capacité à éviter l’activation immunitaire chronique et à contrôler efficacement le virus dans les ganglions lymphatiques, des organes clés du système immunitaire. Un acteur essentiel de cette défense est un type de cellules immunitaires appelées cellules NK (Natural Killer pour tueuses naturelles), capables de reconnaître et de détruire rapidement les cellules infectées. Ces cellules jouent un rôle déterminant dans le contrôle du virus au tout début de l’infection. Nous pensons qu’une sous-population spéciale de cellules NK, dites adaptatives, acquiert directement cette capacité dans les ganglions lymphatiques. Nos recherches visent à comprendre comment ces cellules NK adaptatives se développent et agissent. Nous cherchons à : 1. Identifier les mécanismes qui rendent ces cellules si efficaces. 2. Étudier l’environnement des ganglions avant et après l’infection pour découvrir les signaux qui les activent. 3. Tester leur capacité antivirale en laboratoire. Ces recherches pourraient offrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur les singes verts africains vise à mieux comprendre comment certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, parviennent à contrôler l'infection par le virus SIV, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur les singes, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles parviennent à supprimer l'infection. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules chez les singes verts, qui ne développent pas de maladie malgré la présence du virus. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui rendent ces cellules NK particulièrement efficaces chez le singe vert pour éliminer les cellules infectées. Ces découvertes pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SIV (une fois, 5 min, tous les animaux) - Anesthésie des animaux (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection (peu attendu car les AGM sont les hôtes naturels du virus) : Perte de poids, diarrhée, baisse sévère des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où l’activité des NK pourrait être essentielle au contrôle du virus

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le primate est, pour toutes ses proximités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que le primate non humain. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est non-pathogène nous permet d'analyser et de comprendre, en absence de traitement les réponses cellulaires efficaces dans différents tissus en plus du sang, notamment les ganglions lymphatiques, l’intestin et la rate qui jouent un rôle essentiel dans l’infection SIV/VIH. L’analyse des interactions hôte/virus chez l’hôte naturel nous permet d’identifier les facteurs d’hôte qui pourraient aboutir à l’élimination des réservoirs viraux (et qui ne sont pas atteints par les traitements antirétroviraux actuels).

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique . Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe; les animaux chroniquement infectés seront hébergés en groupe sauf en cas de symptômes ou avis contraire des vétérinaires de l’installation: dans ce cas, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Les singes d'Afrique, comme le singe vert possèdent une protection naturelle unique contre le SIDA. Ces singes sont les porteurs naturels des virus de l'immunodéficience simiens (SIV), qui ont donné naissance au VIH chez l'humain. Ils ne développent jamais la maladie malgré la présence du virus en grandes quantités dans le sang. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier comment le système immunitaire peut se défendre efficacement contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Un infarctus du myocarde provoqué en trente minutes chez l'adulte et en quinze chez le souriceau d'un jour, une artère fémorale ligaturée ou excisée, un muscle lésé par une anse refroidie appliquée trois fois quinze secondes : 7 110 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne de toxine. Les échographies obligent à les transporter vers un second établissement, transport que le porteur compte lui-même parmi les sources de stress. Le projet vise à comprendre le rôle des cellules du microenvironnement musculaire dans la régénération, et le porteur justifie le choix de la souris par la disponibilité d'animaux génétiquement modifiés et par la consanguinité des lignées, qu'il présente comme un gage de reproductibilité et donc de réduction des effectifs.

Objectifs

Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs. Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies affectant le muscle squelettique et cardiaque, y compris les pathologies cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde, les myopathies et les blessures chroniques du muscle squelettique. Par ailleurs, le manque d’irrigation locale des membres inférieurs sont fréquentes dans différentes pathologies chroniques y compris le diabète. Malgré le succès de certains traitements, ces maladies chroniques restent encore aujourd’hui fréquentes et très peu soignables, elles ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de ces pathologies affectant le muscle et le traitement des patients.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux lésions musculaires. Notre étude permettra notamment de comprendre le rôle de certaines cellules dans la régénération ou les lésions chroniques des muscles. Ces avancées pourraient, à terme, permettre de développer de nouvelles thérapies pour réparer ou régnérer les muscles. Ceci pourrait concerner, par exemple, l’infarctus du myocarde, qui est la première cause de mortalité en France.

Procédures

- Infarctus du myocarde chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 30 minutes. Réalisé par EU1 - Infarctus du myocarde chez le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Échocardiographie chez la souris et le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes ainsi que le stress lié au transport vers le site n°2 pour l’échocardiographie. Réalisé par EU2 - Constriction puis excision d’un segment d’artère fémorale sur souris adulte anesthésiée = 15 minutes. Réalisé par EU1. - Ligature de l’artère fémorale chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Dans certaines expériences, injection de toxine: quotidien, 10 secondes. Réalisé par EU1 - Blessure localisée du muscle par anse refroidie (1x par souris) = 3x 15 secondes. Réalisé par EU1 - Ligature de l’artère fémorale et injection de toxine chez la souris adulte anesthésiée = 15minutes. Réalisé par EU1 - Chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement d’organes. Réalisé par EU1.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés aux procédures : inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers l'EU n°2 pour les échocardiographies. L’induction de l’anesthésie gazeuse pour la réalisation de l’échocardiographie est stressant pour l’animale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des organes.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement musculaire, y compris les cellules immunitaires, stromales et endothéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Un grand nombre de données de transcriptomiques étant déjà disponible pour la communauté scientifique, des analyses informatiques pilotes ont déjà été performées pour étayer nos hypothèses.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales et la mise en place de points limites spécifiques et précoces. Pour l’ensemble des procédures chirurgicales, une supplémentation hydrique par injection sera effectuée en pré et post opératoire. Une analgésie pré et post opératoire sera réalisée le cas échéant. Pour la procédure d’infarctus du myocarde, le maintien au chaud de la cage sera effectué sur les 48h per-opératoire. Un renforcement de l’enrichissement par de la litière douce (cellulose) et du gel hydrique sera apporté. Le transport des animaux vers le site numéro 2 pour les échocardiographies sera effectué par un transporteur agrée. Les animaux seront dans des boites de transport contenant des croquettes, de l’hydrogel et du coton (ainsi que de la litière).

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies musculaires, car des modèles sont bien établis et récapitulent les pathologies chez l’homme. Le choix de l'espèce murine nous permet également d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés cruciaux dans l’étude précise des cellules d’intérêt de ce projet. La consanguinité des modèles utilisés permet une reproductibilité des résultats et une réduction du nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 1 jour à 30 semaines, car nous étudierons ces pathologies chez le souriceau et à l’âge adulte.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de défenses efficaces au point qu'une contamination bactérienne ou virale les tuerait, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable. Elles sont 180, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. Chacune subit jusqu'à cinq injections, dix anesthésies à l'isoflurane, quatre séances d'imagerie de bioluminescence et jusqu'à cinq prises de sang à la mandibule sur animal vigile, l'injection intramusculaire étant couplée à des décharges électriques pour faire entrer un plasmide dans le muscle. L'objectif est de transformer ce muscle en ce que le porteur appelle une "usine de production" d'anticorps, preuve de concept dont il annonce les débouchés chez les espèces domestiques, contre l'arthrite ou le psoriasis.

Objectifs

Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace de l’anticorps. L'objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression d‘anticorps par les cellules musculaires 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles sécréteurs. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques. En bref, nous aurons une preuve de concept de l’utilisation de vecteurs ADN injectés dans les muscles des animaux, qui fonctionneront alors comme des « usines de production » d’anticorps dirigés contre des cibles. La niche d’utilisation de cette stratégie clinique concerne les maladies chroniques, dans notre cas, les maladies chroniques inflammatoires articulaires (ex : arthrite) et cutanées (ex : psoriasis ou pelade).

Bénéfices attendus

Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques et vétérinaires.

Procédures

Les souris de ce projet subiront au maximum : - 5 injections d’une durée total de 12 min (1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10min ; 4 IP pour l’imagerie, soit 2 min) - 10 anesthésies à l’isoflurane pour une durée totale de 70 minutes (5 rasages, soit 10min ; 1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10 min ; 4 imageries de bioluminescence, soit 50 minutes) - 2 à 5 prélèvements de sang sur souris vigile, soit 2 à 5min au total.

Impact sur les animaux

Les injections intramusculaires et l’application de courants électriques pour l’électroporation peuvent potentiellement induire des douleurs. Ils seront réalisés sous anesthésie générale. Une prise de sang au niveau submandibulaire sera également réalisée sur animaux vigiles dans les deux premières procédures. Les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition de signes de souffrance tel que la perte de poids, la modification de la physiologie ou du comportement (dont la locomotion suite à l’injection intramusculaire avec ou sans électroporation). Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.

Remplacement

Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont par nos collaborateurs par des études in vitro. L’étude de la production d’un anticorps ou d’une protéine recombinante par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a pas de méthode alternative que l’utilisation d’animaux vivants à l’heure actuelle.

Réduction

Nos protocoles expérimentaux ont été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en injectant des vecteurs exprimant des protéines bioluminescentes, qu’il est possible de suivre par imagerie de bioluminescence et par luminométrie. Le suivi par bioluminescence in vivo permettra de suivre l’expression de la luciférase au cours du temps sur un seul et même animal et d’éviter de multiplier les groupes. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Sur 5 ans, nous prévoyons l’utilisation au maximum de 180 souris qui seront réparties ainsi : - Mise en place des protocoles de transfert de vecteur ADN au sein de notre laboratoire : 40 souris - Étude du contrôle du système immunitaire : 40 souris - Étude des méthodes de transfert du vecteur ADN dans les cellules musculaires en utilisant soit différents polymères, soit différents produits de transfection : 100 souris.

Raffinement

La modalité d'imagerie mise en œuvre est non invasive et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les injections intramusculaires sont également effectuées sous anesthésie gazeuse. Le matériel stérile à usage unique adapté aux rongeurs, ce qui limite le risque d’infection et la douleur infligés au cours de l'expérimentation. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Elles seront 2 à 6 souris maximum par cage de 530 cm² selon leur poids. Ces cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…). Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance. Néanmoins, en cas de douleur observée en post injection du plasmide, une injection sous-cutanée d’un analgésique) sera effectuée. Une injection intramusculaire peut provoquer une douleur liée à un hématome. Pour les prises de sang, un crayon hémostatique sera appliqué à la fin du prélèvement afin d’arrêter le saignement.

Choix des espèces

Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. La souris est une espèce animale très largement employée dans la littérature pour ce genre d’étude de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire notre anticorps d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc adultes, entre 7 et 10 semaines au moment de l'arrivée des animaux et leur entrée dans le protocole.

Injectées à une ou deux reprises alors qu'elles sont éveillées, puis piquées cinq à six fois pour des prélèvements sanguins, 5 274 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole prévoit un dernier prélèvement sous anesthésie, et les injections d'anticorps peuvent faire chuter leur température centrale de deux à trois degrés pendant une demi-heure. L'objectif déclaré porte sur l'optimisation d'anticorps thérapeutiques et sur la "bioproduction" de différents formats, la seule répétition des prélèvements suffisant à faire classer l'ensemble en souffrance modérée. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que leur système immunitaire a été modifié de manière pérenne.

Objectifs

Nous cherchons à améliorer et à optimiser les anticorps thérapeutiques pour le traitement de diverses pathologies. Nous cherchons à améliorer la sélection d'anticorps innovants et d'optimiser la bioproduction de différents formats d'anticorps en comparant les choix possibles pour leur activité in vivo. Ceci sera étudié dans des souris humanisées pour des molécules affectants le rôle des anticorps pour une meilleure translation des résultats à l’homme.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à améliorer notre compréhension de la fonction effectrice d'anticorps à visée thérapeutique pour améliorer le traitement de diverses maladies humaines. La comparaison d’anticorps produits sous différents formats avec différentes modalités servira à mieux maîtriser leur développabilité dès les premières phases de développement et d'optimiser la bioproduction de formats d'anticorps.

Procédures

- Injections sous-cutanées, intradermique, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale et intranasale sur animaux vigiles : quelques secondes. 1-2 injections par animal. - Prélèvement sanguin sur souris vigiles : quelques secondes. 5-6 prélèvements par animal. - Prélèvement sanguin sur souris anesthésiés : quelques minutes. 1 prélèvement par animal.

Impact sur les animaux

Au cours de ces expériences, il n’est pas théoriquement envisagé de douleur ou effet indésirable majeur du fait de la nature des produits injectés (anticorps ou protéine). Les prélèvement répétés de sang représentent la nuisance principale dans ce projet. Il est également possible que les animaux présentent une légère irritation au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention suivi de l’introduction d’une aiguille. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La sévérité globale des procédures est considéré comme modérée uniquement du fait de la répétition des prélèvements sanguins au cours des protocoles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.

Réduction

Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.

Raffinement

Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux. Il n’est pas attendu d’effet secondaire délétère pour la santé des animaux. L'état général des animaux et le point d'injection seront surveillés quotidiennement. La procédure sera interrompue si des signes généraux sont observés. Une légère irritation peut survenir au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Si l’animal présente une posture prostrée, un poil hérissé ou une perte de poids de plus de 10-15% le raffinenement sera renforcé avec du gel hydrique ou une réhydratation sous cutanée pour prévenir/traiter les signes cliniques. Si l’animal présente une hypothermie prolongée de plus de 30 min suite à une injection ou un prélèvement, les cages pourront être chauffées avec des chaufrettes. Les soins adéquats à apporter à l'animal seront déterminés par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs. Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.

Pour étendre à trois autres types de dengue un candidat vaccin à ARN messager, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent deux à trois injections dans la peau du dos ou dans le muscle, à trois ou quatre semaines d'intervalle, avec trois prélèvements sanguins à la lancette. Le porteur indique que les gonflements aux points d'injection peuvent provoquer une boiterie, et prévoit une alimentation gélifiée pour faciliter la mastication après chaque prise de sang. Son calcul de réduction aboutit à 20 souris traitées et 20 témoins par expérience, répétée trois fois, soit 120 animaux, un chiffre que rien dans le résumé ne relie au millier demandé.

Objectifs

Il existe deux vaccins vivants atténués contre la dengue. Dengvaxia® est recommandé pour les 9-45 ans en zones endémiques ayant déjà été infectés, mais augmente le risque de dengue sévère chez les non-infectés, rendant son usage inadapté pour les voyageurs. Qdenga®, un est recommandé dès 4 ans, indépendamment d'une exposition antérieure, sans risque accru de cas sévères. Il a été montré chez des personnes asymptomatiques ou peu symptomatiques infectées par le virus de la dengue une activation de la réponse immunitaire adaptative (lymphocytes T notamment) corrélée à des taux d’anticorps anti-dengue circulant plus faibles que chez les patients symptomatiques. Cette activation des lymphocytes T permet chez les patients asymptomatiques de combattre l’infection virale sans activation forte et incontrôlée du système immunitaire. Un vaccin à ARN messager un type de dengue a été développé. Notre projet vise à étendre cette approche aux 3 autres types, via un vaccin ARN. Les cellules musculaires produiront alors des protéines virales, déclenchant une réponse immunitaire. Ce vaccin pourrait être utilisé seul ou avec d'autres, notamment chez les non-exposés à la dengue, les enfants de moins de 9 ans, et les voyageurs. Nous voulons grâce à cette étude : 1.Identifier et caractériser les lymphocytes T des souris vaccinées et évaluer la quantité ainsi que la qualité de leurs réponses, validant ainsi l'immunogénicité (la capacité de protéger) de notre nouvelle formulation. 2.Utiliser notre formulation seule ou en association avec des vaccins préexistants et comparer les protections ainsi induites. 3.Mesurer la production éventuelle d’anticorps si activation des lymphocytes B. 4.Mesurer la protection induite par notre nouvelle formulation contre les quatre différents sérotypes.

Bénéfices attendus

Un vaccin qui induit des réponses des cellules T contre la dengue peut offrir plusieurs avantages importants : Bénéfices du projet à court terme : Améliorer la formulation actuelle de notre candidat vaccin en élargissant la protection que nous avons vu contre un type du virus de la dengue aux 3 autres types. Combiner notre approche ciblant une activation de la réponse cellulaire uniquement avec des vaccins plus classiques activant réponses anticorps et cellulaire pourrait nous permettre d’étudier finement les bénéfices et/ou les inconvénients de chacune des approches et d’améliorer nos connaissances en immunologie fondamentale. Bénéfices du projet à long terme : On estime à 390 millions le nombre d’infections par le virus de la dengue chaque année, dont 96 millions se manifestent cliniquement. La moitié de la population humaine vit dans des régions menacées par ce virus. Deux vaccins sont aujourd’hui sur le marché mais présentent encore des limitations dans leur recommandation, ce qui permet d’envisager le développement d’autres types de vaccins, notamment grâce à la technologie à ARN messagers qui a largement prouvée son innocuité et sa rapidité de déploiement dans la lutte contre la pandémie de SARS-CoV-2. Un vaccin efficace contre le virus de la dengue pourrait réduire l'incidence de la maladie et des complications qui lui sont associées. Largement utilisé dans les zones endémiques, il permettrait de diminuer la transmission du virus et de protéger non seulement les sujets vaccinés mais aussi les sujets non vaccinés. .

Procédures

Immunisation : Les animaux seront vaccinés 2 à 3 fois par voie intradermique au niveau du dos ou par voie intramusculaire à des intervalles de 3 à 4 semaines. Prélèvement des échantillons sanguines : Au jour 0 et 7 jours après chaque immunisation, des échantillons de sang sont prélevés. Au total seront 3 prélèvements de quelques secondes par prélèvements seront réalisés sur chaque animal au cours des expériences.

Impact sur les animaux

Les vaccins à ARN messager ont été soumis à des essais cliniques rigoureux, montrant un bon profil de sécurité et une efficacité élevée. En outre, les réactions indésirables graves sont extrêmement rares, et la technologie a fait ses preuves en termes de sécurité et d'efficacité dans plusieurs vaccins approuvés. Mais, comme tous les vaccins les principaux effets secondaires attendus sur les souris peuvent être des gonflements locaux aux sites d’injections qui peuvent induire une boiterie, mais ils disparaissent en général rapidement et les souris retrouvent leur mobilité. Les prélèvements sanguins de faible volume nécessitent uniquement une contention simple et une ponction à l'aide d'une lancette au niveau de la veine, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Cette procédure peut entraîner une douleur de courte durée.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux immunisés et le contrôle seront mis à mort car il est nécessaire afin de récupérer des organes pour poursuivre leur étude ex vivo.

Remplacement

Pour développer ce candidat vaccin, nous avons sélectionné des séquences de peptides immunogènes en se basant sur notre expérience, sur la littérature et sur des outils informatiques. Pour explorer notre hypothèse et valider l’immunogénicité de nos constructions, nous souhaitons utiliser un modèle animal de souris car c’est le modèle de référence pour les études vaccinales précliniques. Pour se développer, la réponse immunitaire a besoin de multiples partenaires (types cellulaires différents) interagissant au sein de tissus différents (ganglions, rate, circulation sanguine), en suivant une chronologie très précise. La réponse immunitaire se mesure dans des temps relativement longs (jusqu’à deux-trois mois dans notre étude). Pour le moment aucun modèle alternatif n’arrive à reproduire la complexité du système immunitaire c’est pourquoi nous avons besoin d’utiliser des souris pour étudier notre candidat vaccin.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre moyen d'animaux utilisés pour les essais comparatifs d'un traitement ou d'un vaccin pour ce projet en examinant la littérature et en exécutant des tests statistiques. Par conséquent, nos groupes expérimentaux seront constitués de groupes de 20 souris (5 souris par sous groupe fois 4 conditions) tests et 20 souris témoins par expérience et chaque expérience sera répétée trois fois. Ces animaux ne peuvent pas être réutilisées car nous avons besoin de leurs organes lymphoïdes pour mener des expériences ex vivo.

Raffinement

Notre expérience précèdente a montré que l’administration de différents types de vaccins d’intérêts avec anesthésie n'entraîne pas de pathologie spécifique ni n'altèrent leur état de santé. Les immunisations seront effectuées sous anesthésie. Après l'injection, les animaux seront placés dans des boîtes préchauffées pour maintenir leur température et surveillés jusqu'à leur réveil complet. Si une boiterie est observée et persiste au-delà de 24 heures, des analgésiques seront administrés. L'alimentation sera adaptée à une texture gélifiée pour faciliter la mastication et la litière sera remplacée par un matériau plus doux. Après chaque prise de sang, l'alimentation des animaux sera adaptée pour faciliter leur mastication (à base de gel). Les animaux seront également réhydratés par une injection de solution saline physiologique afin de compenser le volume sanguin prélevé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence pour les études vaccinales précliniques. Pour se développer, la réponse immunitaire a besoin de multiples partenaires (types cellulaires différents) interagissant au sein de tissus différents (ganglions, rate, circulation sanguine), en suivant une chronologie très précise. La réponse immunitaire se mesure dans des temps relativement longs (jusqu’à deux-trois mois dans notre étude). Pour le moment aucun modèle alternatif n’arrive à reproduire la complexité du système immunitaire c’est pourquoi nous avons besoin d’utiliser des souris pour étudier notre candidat vaccin. La réponse immunitaire de la souris est suffisamment proche de la réponse immunitaire chez l’homme pour que les résultats soient transférables à l’humain. La taille réduite des souris permettrait d’immuniser des groupes statistiquement pertinents des deux genres (mâles et femelles). Les souris âgées de 6 à 16 semaines seront utilisées. Cet âge garantit que leur système immunitaire soit mature pour développer des réponses contre une immunisation.

Les souris utilisées sont dépourvues de système immunitaire fonctionnel, irradiées puis greffées avec des cellules humaines pour porter une immunité qui n'est pas la leur. 320 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent l'anticorps testé en intraveineuse, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse toutes les deux à trois semaines, puis tous les sept jours jusqu'à disparition de l'effet du produit. Le porteur présente ce modèle comme "une alternative solide à l'utilisation de primates en recherche préclinique", l'anticorps ne reconnaissant ni les cellules de rongeurs ni celles de primates.

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation de l’effet pharmacologique d'un anticorps monoclonal sur les réponses immunes humaines dans un modèle murin de souris immunodéficiente humanisée. Ce modèle murin consiste à injecter les traitements chez la souris immunodéficiente préalablement reconstituée avec des précurseurs humains. D’une façon très intéressante, ce modèle nous permettra de répondre à deux questions qui sont : combien de temps et où va l'anticorps dans le corps une fois injecté, et comment agit-il sur la cible ?

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Déterminer le potentiel thérapeutique de l’anticorps testé, - Suivre la cinétique de l'effet thérapeutique dans le temps, - Déterminer la dose efficace - Evaluer les caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de traitement.

Procédures

- Irradiation des souris vigiles dans une boîte spéciale (3min) ; - Injection des cellules humaines et traitement en intraveineuse sur animal vigile (5min/animal, une seule fois) ; - Sous anesthésie gazeuse, des prélèvements sanguins seront réalisés sur toutes les souris (10min/souris, toutes les 2-3 semaines avant injection des traitements, puis tous les 7 jours aprés injection des traitements jusqu'a la disparition de l'effet de l'anticorps) ; - Euthanasie sous anesthésie gazeuse (6min/animal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances qui ne concernent pas que la douleur sont présentes, on note : - Le stress de l’animal à cause des manipulations fréquentes pour l’irradiation et les prélèvements, ce stress peut affecter le comportement des souris. - Risques d’infections après irradiation, au site d’injection et de prélèvement - L'exposition répétée à des procédures expérimentales peut entraîner une diminution de l'activité, un changement dans les comportements sociaux ou alimentaires.

Devenir

À la fin des expériences, les animaux seront autopsiés afin d'effectuer des prélèvements d'organes/tissus, ce qui justifie la mise à mort des souris.

Remplacement

Vu la complexité du système immunitaire, les études préalablement réalisées ne peuvent pas remplacer les études sur les organismes vivants. Il est donc nécessaire de déterminer les caractéristiques pharmacologiques du candidat médicament dans un modèle proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Les caractéristiques pharmacologiques des candidats médicamenteux dans ce modèle seront analysées par le biais des tests statistiques. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; et de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus.

Raffinement

La saisine a été modifiée comme suit : Au début du protocole, les souris seront réparties par groupe de 5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement standard à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler une éventuelle douleur, une souffrance ou un mal-être. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Nous prévoyons une administration d’analgésique en sous cutané deux fois par jour pour tout animal souffrant. Ces injections seront débutées quand les souris commencent à manifester les premiers signes de souffrance (voussure de dos, légère inactivité, poils ébouriffés). A noter qu’en cas de manifestation des points limites ou en cas de souffrance non gérable par anti-douleur ; l’animal sera euthanasié. Les animaux atteignant les différents points limites ou tout signe montrant une souffrance physique caractéristique d’un mal-être, seront euthanasiés. La perte de poids sera calculée par rapport au poids initial à jour 0. Les conditions d’hébergement et de soins aux animaux seront les suivantes : les souris seront hébergées par groupe de 5 maximum dans des cages de type 2L disposées sur des portoirs ventilés ; un change de litière régulier (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé ; un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise aux rythmes jour / nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gants

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : * Elles présentent une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation. * L’anticorps ne peut être testé que dans un modèle de souris humanisé avec des cellules humaines car il ne reconnait pas les cellules de rongeurs (absence de cross-réactivité) ou de primates. Ces souris immuno-déficientes permettent l'acceptation d’une greffe de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Pour l’injection des cellules humaines, nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 5 semaines. C’est l’âge idéal décrits dans la littérature et de notre expérience pour injecter les cellules humaines. Pour l’injection des anticorps tests, les souris seront âgées de 18-20 semaines environ ; à cet âge-là, l’humanisation des souris est acceptable pour les pourcentages et les nombres des différentes populations cellulaires humaines répondants aux critères d’inclusion, elles ont également un poids relativement stable ce qui facilite leur manipulation, l’injection des anticorps, les prélèvements et l’évaluation physique (bien être).