Système immunitaire

Une injection de composant bactérien, deux prélèvements de sang à la joue sans anesthésie et une prise de température rectale toutes les deux heures, le tout en six heures : 648 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à vérifier chez l'animal vivant des mécanismes régulateurs de l'inflammation repérés en culture cellulaire, en comparant des souris génétiquement invalidées à des témoins. Toutes sont tuées, le porteur indiquant que l'injection rend leur survie difficile au-delà de six heures et que les prélèvements les affaiblissent. La souris est retenue parce qu'elle est l'animal le plus utilisé en immunologie et que les lignées modifiées sont déjà disponibles.

Objectifs

La réponse inflammatoire est bénéfique pour l'organisme humain car elle le protège efficacement contre les infections et favorise également la réparation des tissus lésés. Cependant, lorsque l'inflammation devient excessive, elle peut devenir délétère et causer des syndromes auto-inflammatoires. L'inflammation est déclenchée par des senseurs de pathogènes ou de stress, notamment au sein des plateformes de signalisation qui contrôlent la sécrétion de composants dans notre sang. Ces composants indiquent à notre système immunitaire de réagir à quelque chose de nocif, comme une infection. Les mécanismes de régulation ainsi que l'activation de la voie de l'inflammation restent peu compris. De nouveaux mécanismes régulateurs de l'inflammation ont été découverts grâce à des approches in vitro. Le projet vise donc à valider l'importance de ces régulateurs in vivo. Pour cela, nous testerons la réponse inflammatoire de souris génétiquement invalidées pour ces mécanismes régulateurs. L'inflammation sera déclenchée par l'injection d'un composant bactérien connu pour induire une inflammation systémique chez la souris, caractérisée par des symptômes précoces tels que l'abaissement de la température et l'élévation des signaux d'alarme déclenchant les mécanismes de défense de l'organisme contre les infections. Ce projet vise donc à comparer ces deux paramètres entre des souris témoins (sauvages) et des souris invalidées pour les mécanismes régulateurs de l'inflammation, 4 à 6 heures après l'injection du composant bactérien. Au cours de ce projet, nous allons étudier plus précisément le rôle respectif des différents composants de cette voie inflammatoire en utilisant des souris génétiquement modifiées capables ou non d'activer cette voie. En résumé, le projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires régulant l'inflammation. Cette recherche pourrait avoir des implications importantes pour la compréhension et le traitement des maladies inflammatoires chez les humains.

Bénéfices attendus

Une inflammation excessive et dérégulée est associée à des syndromes auto-inflammatoires, entraînant des symptômes qui altèrent la qualité de vie des patients. L'activation d'une voie spécifique de l'inflammation pourrait contribuer à ce phénomène. Les souris souffrant d'une infection sévère présentent une activation de cette voie. L'injection d'un composant bactérien est largement utilisée dans la recherche pour induire une inflammation en formant des complexes protéiques appelés inflammasomes. Jusqu'à présent, les mécanismes de régulation et d'activation de cette voie inflammatoire restent mal compris. Des ligneées des souris chez lesquelles certains régulateurs spécifiques de cette voie inflammatoire ont été désactivés ont été générées afin d'étudier l'impact de ces régulateurs dans la régulation de cette voie chez la souris après une infection sévère. En plus de ces souris, des modèles de souris présentant une fonction inflammatoire dérégulée ont également été créés. En étudiant spécifiquement le rôle de différents composants de cette voie inflammatoire, nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de prévenir une inflammation excessive. En résumé, notre projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents à l'inflammation excessive, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des stratégies de traitement pour les maladies inflammatoires.

Procédures

Le projet repose sur un modèle d'infections chez la souris, impliquant l'injection d'un composant bactérien sur des animaux éveillés. Cette injection, réalisée sur une durée de 10 secondes, est effectuée une seule fois au début de la procédure sur 648 animaux. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sans anesthésie pour prelever petite quantité de sang sur une durée de 10 secondes sur 648 animaux. Un seul prélèvement sur 648 animaux sur une durée de 20 secondes seront realises sous anesthésie générale à la fin de l'expérience.

Impact sur les animaux

Lors de l'injection, il peut y avoir une douleur au point d'injection ainsi qu'une réduction de l'activité et de la mobilité des animaux. De plus, il existe un risque d'hypothermie consécutive à l'injection de substance bactérienne pendant les premières heures. Les prélèvements de sang au niveau de la joue peut induire du stress chez les animaux. En outre, les prises de température rectale peuvent également causer du stress chez les animaux.

Devenir

Tout les animaux utilisés dans procédure seront mis à mort selon une méthode réglementaire. Les souris seront euthanasiées après la procédure, car l'injection de LPS provoque un état inflammatoire chez les souris, rendant difficile leur survie au-delà de 6 heures. De plus, le sang est prélevé à plusieurs reprises pendant la procédure, ce qui affaiblit les souris.

Remplacement

Un modèle basé uniquement sur des cellules isolées ou l'utilisation d'outils informatiques ne pourrait pas refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire face aux infections sévères, ni les interactions entre les différentes cellules immunitaires. Une étude menée sur un animal entier est donc indispensable à des fins exploratoires, et nous utiliserons un modèle d'infection largement validé dans d'autres études.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été effectué afin de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, plusieurs analyses utilisant diverses techniques seront effectuées sur les prélèvements, ce qui permettra de minimiser le nombre de souris utilisées. L'utilisation à la fois de mâles et de femelles permet ainsi de limiter la perte d'animaux.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été optimisées pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. Leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans toutes les procédures en termes de conditions d'élevage. Il y a un suivi des souris sur 6 heures, la prise de température toutes les 2 heures, l'utilisation de la grille d'évaluation du comportement des souris. La surveillance raprochée des animaux nous permettra d'identifier précocement tout changement physique (blessure) ou comportemental, qui sont des signes de stress. Des points limites bien définis permettent de limiter la souffrance animale au minimum.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie, avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement. Des modèles génétiquement modifiés sont d'ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.

La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".

Objectifs

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.

Bénéfices attendus

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Selon le score de douleur atteint et sa persistance, les souris reçoivent un analgésique ou sont tuées. 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante une sonde thermique dans l'abdomen, puis pour une partie d'entre elles un objet métallique de un centimètre sur un sous la peau du flanc, que des champs magnétiques échauffent de deux à trois degrés pour reproduire une fièvre ou une inflammation locale. L'effectif de 880 est présenté comme le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans qu'aucun calcul ne soit donné.

Objectifs

La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.

Procédures

Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.

Réduction

Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),

Les souris reçoivent trois injections de vaccin en cinq semaines, selon les procédures dans l'abdomen, sous la peau, dans le derme, dans un muscle, par le nez ou par le vagin, et subissent six prises de sang entre la semaine qui précède la première injection et la cinquième semaine. 3 444 souris, dont des lignées génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester 18 vaccins contre le SARS-CoV-2, le virus Nipah, l'hépatite B, Chlamydia trachomatis, la coqueluche ou la tuberculose. Le porteur parle pourtant d'une nuisance légère au moment de chaque injection et de chaque prise de sang, et affirme que la réponse immunitaire est "sans conséquence sur l'animal". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour analyser leur moelle osseuse, leur rate, leurs ganglions et les tissus par lesquels entrent les pathogènes.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les plateformes vaccinales que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces plateformes vaccinales. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront des injections de vaccins par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 3 injections de vaccin (nuissance légère au moment de l'injection) et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers (nuissance légère au moment du prélèment). La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les plateformes vaccinales utilisées dans ce projet ont déjà été évaluées dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos plateformes vaccinales. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agi ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre, impliquant tous les groupes des six procédures, est estimé à 3444 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).

1 560 souris vont être élevées puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever leurs organes lymphoïdes. Une partie reçoit un produit inducteur par voie intrapéritonéale, une injection par jour pendant trois jours espacées de deux jours, geste qui dure une vingtaine de secondes. Les souris privées en permanence de la protéine étudiée développent des lymphomes T à partir de dix semaines : le porteur prévoit de les tuer à neuf semaines, avant que le "phénotype dommageable" ne s'exprime. Il affirme que ces souris sont "indispensables" parce qu'elles seules fournissent des lymphocytes T naïfs dans leur état naturel, qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit à ce jour.

Objectifs

Notre équipe étudie une protéine essentielle pour le développement des cellules sanguines et le fonctionnement des lymphocytes B et T. Nos recherches montrent qu'elle joue un rôle clé dans l’activation et la spécialisation des lymphocytes T, mais ses mécanismes d’action restent à élucider. L’objectif de ce projet est de déterminer comment cette protéine contrôle la génération et la maintenance des lymphocytes T inflammatoires. Nous élèverons des souris n'ayant plus cette protéine soit de manière chronique et spécifique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Ces souris sont indispensables car elles seules permettent d’obtenir des cellules T « naïves » dans leur état naturel, qui sont les cellules dont nous avons besoin pour étudier leur destin inflammatoire et que nous ne pouvons remplacer par un modèle alternatif. Ce projet pourra ouvrir de nouvelles perspectives pour mieux comprendre et traiter les maladies immunitaires. Après mise à mort, les organes lymphoïdes seront récupérés et des expériences in vitro seront réalisées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes qui contrôlent l'activation et la polarisation des lymphocytes B et T, acteurs principaux de la réponse immunitaire adaptative jouant un rôle crucial dans le développement de cancers et pathologies auto-immunes et inflammatoires. Cela permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Procédures

Les injections du produit permettant la suppression de nos protéines se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours, à 2 jours d'intervalle. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant plus la protéine d'intérêt peuvent développer des lymphomes T à partir de 10 semaines, ce qui peut rester asymptomatique mais dans certains cas pourrait conduire à une perte de poids, une prostration. Les animaux seront alors mises à mort à l'âge de 9 semaines pour ne pas atteindre un phénotype dommageable. L'injection de tamoxifène par voie intrapéritonéale ne prendra que quelques secondes. Une infection pourrait se développer au niveau du site d'injection du tamoxifène, ce qui pourrait entraîner une douleur. Ce site sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin.

Devenir

mise à mort et prélèvement d'organes

Remplacement

Nous travaillons sur le devenir des cellules T naïves, qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le seul but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des cellules T naïves in vitro. Les souris présentant une absence chronique de notre protéine ont un phénotype dommageable et seront observées quotidiennement selon la règlementation. Les souris ne possédant plus notre protéine après injection d'un produit, ne possèdent pas de phénotype dommageable car elles seront utilisées rapidement après induction. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Selon les expériences menées in vitro, un test statistique de Mann-Whitney sera effectuée pour comparer les groupes.

Raffinement

Les animaux seront utilisés avant qu'aucun problème de santé potentiel ne se développe. Les zootechniciens surveilleront les souris quotidiennement selon la procédure règlementaire afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration, en s’assurant de ne jamais atteindre un point limite. Les animaux seront élevés en groupe dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Lors de l’injection du produit entraînant la disparition de notre protéine d'interêt, le risque d’infection dans la zone d’intérêt sera pris en considération.

Choix des espèces

Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement (souris- knock-out, transgéniques), ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l’étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des maladies auto-immunes, ce qui est l’objet de notre recherche. Les souris ayant une absence chronique de la protéine d'interêt, sont susceptibles de développer des lymphomes à partir de 10 semaines. Dans ce cas, les expériences seront effectuées sur des animaux adultes sevrés et âgées entre 4 et 9 semaines afin d’isoler les cellules T naïves sans prendre le risque d'une présence de lymphome. Pour la lignée de souris inductibles, nous induirons la délétion d’Ikaros après injection d'un produit. En utilisant ce protocole d’induction, les souris n’auront pas le temps de développer de lymphomes au moment où les organes lymphoides seront récupérés. Le nombre de cellules T naïves diminue avec l'âge. cependant, nous savons qu'un nombre suffisant de cellules T naïves peut être récupéré dans les organes lymphoïdes secondaires jusqu'à l'âge d'environ 20 semaines. Pour notre étude, nous pourrons donc induire la suppression de nos protéines et récupérer les organes pour les études in vitro sur des animaux entre 4 et 15 semaines.

8 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau et, par chirurgie, dans le colon et dans le foie, puis jusqu'à trois traitements, deux vaccins, douze injections de substrat et treize anesthésies gazeuses, avec prélèvements de sang et de fèces. Le porteur attend de ces modèles qu'ils éclairent le rôle de lymphocytes intestinaux dont il a déjà breveté l'"énorme potentiel clinique", les retombées pour les patients restant au conditionnel. Il écrit par ailleurs qu'"en général, aucun signe de souffrance des animaux n'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs".

Objectifs

Notre projet vise à améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, souvent incurable. Nous cherchons à développer de nouvelles thérapies, en particulier des immunothérapies. Pour cela, nous voulons mieux comprendre l’immunité développée dans les tumeurs primitives, situées au niveau du colon, ainsi que dans les tumeurs secondaires (les métastases), principalement situées au niveau du foie dans ce type de cancer. Nos travaux précédents, ainsi que ceux d’autres groupes, ont démontré que l’immunité mise en place spécifiquement dans l’intestin, jouait un rôle déterminant dans le devenir des tumeurs aussi bien localement dans le colon qu’à distance, dans les métastases hépatiques ou dans d’autres localisations métastatiques. La réponse immunitaire, développée localement dans l’intestin, est très particulière et comprend notamment des lymphocytes intestinaux spécifiques (cellules immunitaires « tueuses » de tumeurs), qui ont des propriétés et des caractéristiques différentes des lymphocytes localisés dans les autres organes. Dans les modèles murins, ces lymphocytes intestinaux spécifiques ont la capacité, après avoir été activés par les tumeurs de colon, de sortir de l’intestin, migrer dans l’organisme et aller infiltrer et éliminer des tumeurs « extra-intestinales » localisées par exemple dans le foie ou sous la peau. Ainsi, pour étudier ces lymphoyctes intestinaux spécifiques, leurs voies d’activation dans l’intestin, leurs « super-propriétés » anti-tumorales, leurs migrations dans l’organisme, nous devons reproduire la maladie dans sa complexité multi-tumorale chez l’animal, avec des tumeurs primitives localisées dans l’intestin (dans le colon) et des métastases à distance. A terme, étudier ces cellules « tueuses » de l’intestin, nous permettra d’exploiter i) leur potentiel à représenter chez le patient un marqueur biologique (biomarqueur) traduisant la réponse aux thérapies ou ii) leur potentiel à représenter une cible thérapeutique, par exemple pour le développement d’un vaccin.

Bénéfices attendus

Dans le but d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, nous utilisons dans ce projet des modèles précliniques afin d’étudier en détail les lymphocytes intestinaux spécifiques "cellules immunitaires tueuses de tumeurs" chez la souris. Nous avons montré que ces cellules sont particulièrement performantes pour éliminer les tumeurs primitives de colon mais aussi leurs métastases (tumeurs secondaires à distance). Nous avons récemment publié des travaux scientifiques dans lesquels nous avions déjà utilisé ces modèles précliniques, ainsi que des cohortes de patients. Nous avons également breveté l’énorme potentiel clinique derrière l’exploitation de ces cellules antitumorales mais beaucoup reste à faire et plusieurs bénéfices sur la prise en charge des patients peuvent decouler de notre projet. Nous pensons que ces lymphocytes spécifiques, provenant de l’intestin, pourraient être augmentés dans la circulation sanguine lors d’un cancer colorectal métastatique, chez les patients avec un bon pronostic. Ainsi, ces cellules pourraient être utilisées comme biomarqueur d’une bonne réponse des patients aux immunothérapies. De plus, nous pensons que ces cellules intestinales ont des meilleures capacités anti-tumorales comparées à des lymphocytes non intestinaux. Il serait potentiellement possible, à l’avenir, de les exploiter pour le développement de vaccins anti-cancer colorectal métastatique chez la souris, puis chez l’homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à: 1) des procédures d'implantation de cellules tumorales par voie sous-cutanée mais aussi par chirurgie au niveau du colon et du foie (1 seule fois par animal et dure 5 min par animal) 2) des procédures d'injection intra-péritonéale d’anesthésiant (1 fois à l'implantation du cancer, 2 min par animal), de substrat ( 12 fois par animal, sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal à chaque mesure lors du suivi d’imagerie), de traitements (3 fois par animal, elle dure 2 min par animal) 3) une procédure d'administration sous-cutanée de vaccin (2 fois par animal, elle prendra 5 min par animal) 4) un prélèvement sanguin dans la veine maxillaire qui dure 2 minutes par animal 5) des prélèvements de fécès sur animal vigile, 6 fois max par animal, qui dure entre 5 sec et 2 min. L’anesthésie par voie gaseuse sera effectuée 13 fois par animal (12 fois pour le suivi biolum, 1 fois pour l’euthanasie).

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Des mesures seront effectuées, des tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés post-mortem. Ces organes comprennent: tumeurs, sang, organes lymphoides secondaires (ganglions lymphatiques, rate), organes sains en bordure de tumeurs (poumons, muqueuse orale, peau). Ces organes ainsi que les cellules immunitaires extraites seront analysés par des approches de protéomique et de transcriptomique.

Remplacement

Notre projet a pour but de comprendre comment l’immunité localement développée dans l’intestin, en particulier par des tumeurs intestinales lors d’un cancer colorectal métastatique, peut impacter l’organisme entier. Pour cela, nous avons absolument besoin d’utiliser un organisme entier, afin d’explorer une immunité locale, intégrant tous les composants cellulaires et la complexité de tumeurs localisées dans le colon et dans d’autres organes (le foie, la peau). Les tumeurs doivent se développer dans leur organe d’origine, afin de développer une architecture, une vascularisation, un réseau cellulaire au plus proche de la réalité d’un organisme. Par ailleurs, nous travaillons sur la migration des cellules immunitaires entre les orgranes ou entre les tumeurs (du colon vers le foie, du colon vers la peau). Pour cela, nous devons travailler sur un système vasculaire et lymphatique complet, tel que l’on peut retrouver uniquement dans un organisme entier. Les études déjà réalisées ex vivo ou in vitro (par exemple dans des organoïdes ou des flasques de culture) ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement des tumeurs et de reproduire sa constitution globale, son évolution complète, sa vascularisation et ainsi que le réseau vasculaire élaboré reliant plusieurs tumeurs dans l’organisme, tels qu’ils ont lieu in vivo. Ainsi, nous ne pouvons pas Remplacer le modèle animal in vivo.

Réduction

Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous limitons nos expériences au nombre de 2 (et non 3 comme classiquement fait dans la littérature) car au vu du nombre d’animaux inclus dans chaque groupe, cela suffit pour obtenir des statistiques solides sur nos expériences. Nous concevons également nos expériences afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, en prélevant en fin d’expérience un nombre important d’organes et de compartiments chez l’animal, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Toutes les mises au point sur l’utilisation de ces modèles précliniques ont déjà été validée dans nos précédentes études, de façon la plus rigoureuse et solide possible (dose de cellules à implanter, fenêtre de traitements et de prélèvements). Ainsi, nos protocoles expérimentaux sont verouillés et suivis à la lettre, afin que chaque expérience réalisée dans ce projet soit reproductible et comparables aux autres et que des animaux ne soient pas injectés en vain.

Raffinement

Pour optimiser le Raffinement, notre long recul (>18 ans) sur ces modèles permettra d'évaluer précisément l’apparition de souffrance. Moins de 15% des animaux développeront un cancer au delà du 14eme jour. Un suivi quotidien permettra d’anticiper et d'euthanasier immédiatement les animaux en cas d’apparition de douleur ou de stress. Aucun animal ne sera maintenu en souffrance, ils seront euthanasiés en anticipation du point limite. Toutes les procédures seront réalisées sous narcolepsie. Notre expérience nous permet de réaliser des gestes rapides et précis pour les implantations, diminuant ainsi le temps de manipulation des animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et co-analgésique myorelaxant. Les animaux seront opérés sur des tapis chauffants, jusqu’à leur réveil pour éviter l’hypothermie. Le risque d’hypoventilation sera diminué par oxygénation des animaux opérés. Du gel occulaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. De plus, lors des chirurgies, nous veillerons à bien refermer la membrane péritonéale et la peau séparément afin de ne pas entrainer des adhérences et réduire la douleur post-opératoire. Après intervention, les animaux seront remis en cages, sous surveillance, et les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien vigiles, afin d’éviter que la ventilation du rack ne provoque une hypothermie chez les souris. En général, aucun signe de souffrance des animaux n 'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs. Cependant, si des signes de douleur ou stress venaient à apparaitre rapidement en post-opératoire (4 ou 5 jours), cela serait exceptionnel et inhabituel et la décision d’euthanasier les animaux serait immédiatement prise. Cela conduirait à l'exclusion de ces animaux de nos expériences. Les conditions d’hébergement suivront les recommandations de la directive européenne en vigueur. Les souris recevront une alimentation enrichie ainsi que des granulés alimentaires déposés dans les cages afin de limiter le redressement pour se nourrir. Du papier absorbant, des lanières de papier kraft, des rouleaux de carton seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, réduire l’ennui, et leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Ces produits d'enrichissement contribuent à diminuer le stress et facilitent la thermorégulation des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées dans le domaine de l’onco-immunologie car: -d’apres la litérature scientifique, le système immunitaire murin, proche de celui de l’Homme est pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo. -la biodisponibilité. Les souris adultes seront utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.

Injectées de cellules tumorales puis irradiées localement à faible dose sous anesthésie générale, 1 765 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour analyse des organes. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections de traitement, deux gavages et une ponction sanguine. Le projet cherche à comprendre pourquoi seuls 10 à 30 % des patients répondent à l'association radiothérapie-immunothérapie, à partir d'une observation faite sur des malades dont l'intestin avait été irradié par erreur. Le porteur écrit que cette irradiation "n'induit pas de nuisance" et range la croissance des tumeurs greffées sous une "gêne locale modérée".

Objectifs

Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.

Bénéfices attendus

L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.

Procédures

Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. La croissance des tumeurs peut entraîner une gêne locale modérée. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire légère de courte durée due à la préhension et au geste lui même.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.