Système immunitaire

Injectées d'une toxine bactérienne dans l'abdomen, prélevées de 20 microlitres de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, 144 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dernier jour, sous anesthésie profonde, la peau du crâne est ouverte pour observer la moelle osseuse au microscope à travers l'os, pendant trois heures. Le porteur anticipe pour cette étape un risque d'hypothermie, un dessèchement des yeux et une douleur liée à la durée de l'anesthésie, et attribue aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil une nuisance modérée. Toutes les souris sont tuées par prélèvement de 800 microlitres de sang à l'aorte abdominale ou à la suite de la chirurgie crânienne, gestes qu'il qualifie de terminaux.

Objectifs

Les plaquettes sanguines, qui jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements, sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau polyploÏde. Les processus de différenciation et de maturation vers la lignée mégacaryocytaire (mégacaryopoïèse) s’effectuent sous l’influence du microenvironnement médullaire, incluant notamment des macrophages qui ont pour rôle principal la phagocytose. Des observations récentes au laboratoire mettent en évidence l’existence, dans la moelle osseuse, des nombreuses interactions entre les mégacaryocytes et les macrophages et leur implication dans la mégacaryopoïèse et la production éventuelle de plaquettes. Les macrophages jouent un rôle essentiel dans l’initiation, le maintien et la résolution de l’inflammation. De plus, on sait que les conditions de stress telles que l’inflammation ont un impact significatif sur le phénotype et la fonction des macrophages. Ainsi, il sera intéressant d’étudier l’impact de l’inflammation sur l’interaction entre les macrophages et les mégacaryocytes dans le microenvironnement de la moelle osseuse avec un accent particulier sur son influence sur la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre l’impact de l’inflammation sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la maturation des mégacaryocytes et la formation des plaquettes notamment dans les maladies inflammatoires permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par des mégacaryocytes dans les conditions pathologiques, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements adaptés chez les patients avec l’inflammation systémique et risque de thrombose. Les données recueillies concernant l’effet induit par l’infection permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués à la fois dans le développement des maladies parodontales et leur implication dans la perturbation de l'homéostasie de la moelle osseuse et sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines ainsi que des pathologies associées par exemple thrombose afin de pouvoir, par la suite développer de nouvelles thérapeutiques. La mise en évidence de nouveaux mécanismes, notamment l’identification de nouveaux récepteurs et/ou molécules, permettra de mieux comprendre les interactions entre les maladies parodontales et les maladies générales, ces bactéries ayant été retrouvées, à distance au niveau d’organes tels que le foie, le cœur et les vaisseaux, et la moelle notamment. Les mécanismes impliqués semblent mettre en jeu une activation exacerbée, locale et à distance, de la réponse immune innée induisant une sécrétion amplifiée de médiateurs de l’inflammation aboutissant à la destruction tissulaire. L’amélioration des connaissances mécanistiques et moléculaires permettra à terme d’améliorer les stratégies de prise en charge des patients atteints de comorbidités et de développer de nouvelles approches pharmacologiques spécifiques.

Procédures

Les injections en IP se font en une fois et les prélèvements 20µL de sang à la queue se font sous anesthésie courte à l'isoflurane 2% de 10 minutes en début et en fin d'expérience. La dissection du crâne et l'immobilisation de l'animal sous le microscope se fait le dernier jour de l'expérience, sous anesthésie profonde. Injection en ip pour l'anesthésie profonde en 1x. Injection sc de l'analgésique : 1x Anesthésie gazeuse au masque 2% 10 minutes pour les étapes de prélèvements à la queue et 0.5% 3h pour l'observation au travers du crâne le dernier jour. Chirurgie crâniale : sous anesthésie profonde en ip pour 30 minutes. Le prélèvement de sang de 800µl à l'aorte abdominale sous anesthésie profonde est terminal. Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements de sang (seulement une fois) présentent un risque léger de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés au LPS (toxine bactérienne) ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie au travers du crâne de l'animal anesthésié, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales que ce soit par prélèvement à l'aorte abdominale ou suite à une chirurgie craniale.

Remplacement

Cette approche in vivo permettra de confirmer les résultats obtenus par l’approche in vitro ayant permis de mettre en évidence des preuves de concept et l’identification de nouveaux mécanismes moléculaires associant bactériémie et l’inflammation systémique car il n’est pas possible de reproduire de manière fidèle la complexité des interactions tissulaires et cellulaires de la moelle osseuse in vitro. Un modèle expérimental d’injection intra-péritonéale permettra de mimer la situation clinique observée à savoir la bactériémie associée avec l’inflammation systémique. Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie des mégacaryocytes et la production des cytokines, diffèrent fortement dans des mégacaryocytes en culture par rapport à ceux observés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit par l’emploi de méthodes statistiques adaptées. Les mécanismes seront dans un premier temps évalués in vitro dans des cultures cellulaires pour déterminer les cibles d’intérêt physiopathologiques et thérapeutiques. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris déterminé permettra d’obtenir des résultats statistiques solides. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Le raffinement se fera par une prise en compte du bien-être animal (enrichissement du milieu comprenant la mise à disposition de languettes de papier et d’un large tube en carton. Ce tube est utilisé comme refuge ou bien déchiqueté par les rongeurs comme substrat permettant, en complément des languettes de papier et de la litière, la composition d’un nid et soins quotidiens aux animaux) et par l’établissement de points limites permettant de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. Lors de la chirurgie pour les expériences intra vitales sous anesthésie une analgésie par injection sous cutanée de buprénorphine et de lidocaïne est apportée.- Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 4 est observé, la souris est mise à mort par inhalation progressive de CO2. Quand un score de 2 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Le prélèvement à l'aorte se fera sur des souris adultes sans distinction entre 8 et 35 semaines, il est connu que la moelle des souris plus agées change et présente plus de cellules graisseuses de type adypocyte interférent dans nos études. Par contre l’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière.

Jusqu'à 25 injections intracérébrales sur animal éveillé, une à deux neurochirurgies de 45 minutes, une à deux semaines en cage individuelle : 6 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Le régime hyperlipidique imposé peut doubler leur poids initial, et des jeûnes de 4 à 24 heures alternent avec des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur veut comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans la prise de poids, et présente la souris comme un bon modèle prédictif du contrôle de la prise alimentaire humaine. Les retombées thérapeutiques annoncées restent suspendues à l'hypothèse de départ, qu'il formule au conditionnel, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés, situés dans l’hypothalamus. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. L’hypothalamus réagit à la consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD), en déclenchant une neuroinflammation locale, qui correspond à une activation des cellules immunitaires hypothalamiques. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones hypothalamiques, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime HFD qui déclenche l’obésité. Ces connaissances permettront de mettre en place des stratégies pour mieux limiter l’inflammation, prévenir la prise de poids et les comorbidités associées à l’obésité. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux mutés génétiquement). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène (HFD). Nous réaliserons un suivi métabolique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques et comportementaux), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend huit procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans l’hypothalamus. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation des cellules immunitaires hypothalamiques afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 6496. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, entre 1 et 2 fois. Nombre d’animaux : 1712 (1 chirurgie) et 384 (2 chirurgies). 3) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min), répétée 2 fois (GTT) et 1 fois (ITT). Nombre d’animaux : 3648 (GTT) et 1248 (ITT). 4) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : entre 1 et 2 semaines en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 992 pour une semaine, 1392 pour deux semaines. 5) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : entre 14 (toutes les 24h) et 25 fois (tous les 4 jours). Nombre d’animaux : 384 pour le groupe « 14 fois », 864 pour le groupe « 25 fois ». 6) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1120. 7) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 2400.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires présentes dans une région du cerveau sur la régulation du poids, de la masse grasse et du taux de sucre dans le sang (glycémie). Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. Enfin, les modèles d’animaux génétiquement modifiés (pour tester nos hypothèses) sont largement développés chez la souris.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures primaires de cellules) afin de tester différentes hypothèses en amont. Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différentes tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat possible de dégradation du bien-être des animaux. 2) L’évaluation de la prise alimentaire individuelle nécessite parfois l’hébergement individuel des animaux. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres (maintien d’interactions olfactives, visuelles et sonores). L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que l’évaluation du maintien du bien-être animal. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée : anatomique, physiologique et comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, des mesures conservatoires et des critères d’arrêt de l’expérimentation seront rapidement mis en place, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, du comportement alimentaire et de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux modifiés génétiquement, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les effets cérébraux d’un régime hypercalorique est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neurochirurgie ainsi que de s’affranchir des effets de la croissance pubertaire.

Pour établir chez la souris ce que des études humaines ne font que suggérer, le rôle protecteur de certains lymphocytes T contre le cytomégalovirus, 568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées en fin d'expérience pour récupérer leurs lymphocytes. Elles reçoivent une à quatre infections virales dans le péritoine à raison d'une par semaine, certaines une injection de lymphocytes par voie intraveineuse, d'autres des anticorps, et cinq prélèvements de sang hebdomadaires sur 42 jours. Le porteur indique qu'après dix jours d'infection les souris peuvent présenter piloérection, dos arrondi, perte de poids et isolement, et qu'avec des souris immunodéficientes les points limites sont fixés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère de la mutation.

Objectifs

Notre projet a pour but une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre un herpès virus nommé Cytomégalovirus (CMV). Nous nous intéressons plus particulièrement au rôle de cellules immunitaires particulières ( lymphocytes T) dans ce contexte. Il comprend une étude chez la souris pour répondre à des questions innaccessibles chez l'Homme. L'étude chez la souris permet d'établir la preuve de l'implication de cellules ou facteurs immunitaires dans la protection antivirale en modélisant une thérapie cellulaire. le modèle murin d'infection par le MCMV est utilisé depuis 20 ans par notre équipe et bien maîtrisé.

Bénéfices attendus

L'objectif final est une prise en charge plus efficace des patients à risque (immunodéprimés), en évitant notamment l'utilisation de traitements anti-viraux à effets secondaires.

Procédures

Les animaux vigiles sont soumis à une ou 4 infections virales (1/semaine) en intrapéritonéal sur une durée de un mois. Un deuxième lot de souris sont anesthésiées et soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes à J0. Le lendement les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de virus. Les souris sont soumises à des prélèvements de sang une fois par semaine sous anesthésie courte pendant 42j (5 prélèvements). Un 3ème lot de souris reçoit deux injections intrapéritonéales (une de virus et une d'anticorps) à 24h ou 7 jours d'intervalle pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Après 10 jours suite à l'infection à CMV, les souris peuvent montrer des signes de souffrance classique tels que la piloérection, le dos arrondi, perte de poids et isolement s'accompagnant d'une augmentation des transaminases hépatiques et de la charge virale. 

Devenir

Les animaux sont tous infectés par du cytomégalovirus et sont donc mis à mort en fin d'expérience. Cette mise à mort est nécessaire pour récupérer les lymphocytes.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet. Le modèle murin de l'infection à CMV est largement utilisé car il récapitule ce qui est observé chez l'homme. L'utilisation de souris immunodéficientes permet de se rapprocher du contexte d'immunosuppression thérapeutique appliquée aux receveurs de greffes, et de tester l'impact d'une thérapie cellulaire par transfert adoptif. L'utilisation de souris et/ou l'injection d'anticorps permettent de conclure sur l'importance des facteurs étudiés dans la protection. Ces conclusions ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo qui ne permettent pas de modéliser la complexité d’un organisme pour l’étude du système immunitaire .

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est calculé pour obtenir des résultats statistiques interprétables et les expériences seront répétées à deux reprises. Par souci de réduction nous utilisons dans nos expériences aussi bien des souris mâles que des souris femelles.

Raffinement

1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Du fait de l'utilisation de souris immunodéficientes, les points limites sont adaptés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère. Les conditions d'hébergement permettent d'éviter les contaminations par des pathogènes opportunistes (portoirs ventilés, filtration entré et sortie) Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les prises de sang sous mandibulaires, les injections intraveineuses et sous-cutanées sont réalisées sur des animaux anesthésiés afin de réduire inconfort et douleur.

Choix des espèces

Le modèle d'infection par le CMV chez la souris est très bien étudié. Nous utilisons des souris adultes, entre 8 et 12 semaines d'age. Les CMV murins et humains ont un même tropisme et la réponse immunitaire anti-CMV chez la souris est très proche de celle de l'Homme. Cependant le suivi de cette réponse chez les patients ne donne qu'une réponse partielle puisqu'il ne peut se faire qu'au niveau du compartiment sanguin. L'étude chez la souris permet une étude spatio-temporelle de la dissémination du virus et de la réponse immunitaire. Le rôle protecteur des cellules/facteurs que nous étudions est suggéré chez l'homme par des études corrélatives mais impossible à prouver. Le transfert adoptif de sous-populations de cellules immunitaires chez des souris immunodéficientes est le seul moyen de tester leur caractère protecteur. L'utilisation de souris invalidées pour un facteur mis en évidence en amont par des études in vitro chez l'Homme est indispensable pour étudier l'importance de ce facteur dans la protection. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro.

Volume tumoral trop important, nécrose de la tumeur, perte de poids : les 20 souris de ce projet seront tuées à l'atteinte d'un de ces points limites. Elles reçoivent 54 injections et subissent sept prélèvements de sang sur animal vigile, pendant qu'une tumeur mammaire se développe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur cherche à établir qu'un type de cellules immunitaires participe à l'élimination précoce des cellules pré-cancéreuses. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles pour des immunothérapies préventives du cancer du sein, restent au conditionnel, quand la croissance de la tumeur et sa nécrose sont, elles, programmées.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer rchez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité liée à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). Le cancer du sein regroupe un ensemble d’entités pathologiques hétérogènes, et le sous-type appelé HER2 reste très agressif avec un bon nombre de patients qui ne répondent pas ou montrent une résistance au traitement de référence. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. La considération du microenvironnement dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une option prometteuse, et plus particulièrement le microenvironnement immunitaire. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire et dans la littérature scientifique mettent en évidence que les cellules immunitaires sont impliquées dans le développement tumoral précoce des tumeurs mammaires chez la souris et chez l’Homme. Notre projet de recherche a pour objectif de determiner qu'un type de cellules immunitaires joue un role dans l'élimination précoce des cellules pré-cancéreuses dans un modèle pré-clinique murin, pouvant aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des patients atteints de cancer du sein.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes impliqués dans la détection et l’élimination des cellules pré-tumorales, par les cellules du système immunitaire, devrait permettre de découvrir de nouvelle cibles thérapeutiques qui pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, des approches d’immunothérapies innovantes, visant à rétablir la reconnaissance précoce des cellules tumorales par le système immunitaire, représentent une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.

Procédures

Injections (54 injections, 2min par injection) Prélévement de sang sur animal vigil (7 prélèvements, 2min par prélèvement)

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, voire une douleur légère et locale. Les injections peuvent entrainer une douleur légère au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer une douleur locale légère.

Devenir

A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort car ils auront atteinte un point limite (par exemple volume tumoral trop important, nécrose de la tumeur,perte de poids...)

Remplacement

À notre connaissance, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et les cellules tumorales ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détection des cellules transformées par le système immunitaire.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé à minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 20 souris sera utilisé dans ce projet.

Raffinement

Certains gestes (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable, un anti douleur sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser les cellules immunitaires au cours du développement des tumeurs mammaires. Les animaux seront utilisés à 6 semaines, correspondant à l’age adulte des souris et à la maturité du système immunitaire.

Gavées chaque jour pendant quatre jours, puis injectées dans l'abdomen, puis saignées une ou deux fois à une semaine d'intervalle, 1 044 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît qu'un gavage peut faire passer le liquide dans la trachée ou les poumons et provoquer une détresse respiratoire. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs fluides et leurs tissus et poursuivre l'analyse hors de l'organisme. Il écrit que la souris permet d'obtenir assez de "matériel" pour ces analyses et conclut qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée.

Objectifs

Les cellules du système immunitaire inné appelées monocytes circulent dans le flux sanguin et peuvent infiltrer les tissus où elles se différencient en différentes sous-populations de cellules appelées macrophages. Ces différentes sous-populations de macrophages peuvent remplir différentes fonctions, en fonction de leur environnement local, telles que le nettoyage des cellules mortes. Le métabolisme des sucres peut jouer un rôle important dans les fonctions des monocytes et des macrophages. Les sucres peuvent notamment être utilisés pour modifier les protéines cellulaires et leurs fonctions. Différents types de sucres peuvent être attachés de différentes manières aux protéines et ainsi modifier leur fonction et celle des cellules dont ils font partis. Les résultats préliminaires suggèrent que ces modifications des sucres sur les protéines sont importantes pour la survie des macrophages. L'objectif du projet proposé est d'étudier l'effet de l'absence de deux enzymes différentes impliquées dans les modifications des sucres des protéines sur les fonctions des monocytes et des macrophages.

Bénéfices attendus

Presque aucune recherche n'a été effectuée pour étudier le rôle des sucres attachés aux protéines sur la fonction des monocytes et des macrophages. Les résultats préliminaires suggèrent que ces processus ont un impact sur la survie des macrophages. Ce projet permettra une première caractérisation du rôle de ces modifications de protéines par les sucres sur la fonction des monocytes et des macrophages. Une meilleure compréhension du rôle de ces processus dans la fonction des monocytes et des macrophages pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques qui impliquent les monocytes/macrophages dans un contexte de maladie.

Procédures

Au cours de ce projet les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : des gavages quotidiens pendant 4 jours (la durée de cet acte est de 20 secondes), une injection intrapéritonéale unique (environ 10 secondes), 1 ou 2 prélèvements de sang espacés d’une semaine (moins d'une minute par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des gavages répétés et lors d’un de ceux-ci une introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. Ils recevront également des injections intrapéritonéales et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection.Ces procédures peuvent être source de stress et les injections et prises de sang peuvent provoquer une légère douleur

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les fluides et tissus corporels en vue d'une analyse in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.

Remplacement

Pour répondre au besoin de remplacement, des études in vitro seront menées sur des lignées de cellules souches hématopoïétiques différenciées en macrophages au lieu de cellules primaires isolées d'animaux. Les données préliminaires qui constituent la base de ce projet ont été obtenues comme ça. Cependant, pour mieux comprendre le rôle des sucres attachés aux protéines sur la fonction des monocytes/macrophages, des études in vivo sont indispensables, car les études in vitro ne peuvent pas reproduire les interactions complexes entre les différents types de cellules présentes dans les différents organes.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons pour les élevages des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure . Les animaux seront hébergés dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage contiendra une tige en papier, un igloo et une brique de peuplier.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions le rôle de la voie de biosynthèse de l'hexosamine dans le recrutement des monocytes et leur différenciation en macrophages. Des modèles génétiques déficients en différents composants de la voie de biosynthèse de l'hexosamine dans différentes populations de monocytes/macrophages sont disponibles. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée Nous utiliserons des animaux jeunes adultes (entre 6 et 12 semaines d’âge) dans l’ensemble des procédures, de façon à étudier des organismes stables, qui ne sont ni en développement ni en sénescence.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.