Système immunitaire

Les souris de ce projet développent une maladie auto-immune, spontanément pour certaines lignées ou après induction, avec perte de poids, gonflement des ganglions et inflammation de la peau ou des articulations. 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leur sang et leurs organes. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant huit à douze semaines, une irradiation du corps entier sur animal vigile, et jusqu'à sept prélèvements sanguins mensuels. Les anticorps testés disposent déjà d'une autorisation de mise sur le marché chez l'être humain contre certains cancers du sang, ce qui permet au porteur d'annoncer une translation "extrêmement rapide" tout en qualifiant ces données murines d'"incontournables".

Objectifs

Les maladies auto-immunes (MAI) systémiques sont des maladies rares caractérisées par l’attaque du système immunitaire sur son hôte, responsable de douleurs et de lésion d’organe altérant significativement la qualité de vie des malades. Les traitements actuels reposent sur des immunosuppresseurs qui permettent d’améliorer les symptômes sans toutefois assurer de guérison, au prix d’une augmentation du risque infectieux et de maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral). De nouveaux traitements pourraient révolutionner la prise en charge des MAI. Parmis eux, de nouvelle thérapie permettant cibler les cellules responsables de la production d’anticorps pathogènes sont particulièrement interessantes. Il s’agit d’approches utilisant thérapie cellulaire par reprogrammation des globules blanc . Ces approchent semblent efficaces dans plusieurs maladies auto-immunes chez la souris et chez l’homme. Toutefois, il s’agit d’une technique couteuse, difficile à mettre en place, et qui pourrait être responsable de complications graves à long terme (cancer du sang). Ainsi, les anticorps thérapeutiques pourraient remplacer les CAR-T cells mais leur efficacité dans les maladies auto-immune n’a pas été étudiée. En outre, des traitements ciblant les interactions entre les plaquettes sanguines et cellules immunitaires, pourraient améliorer les symptômes tout en diminuant le risque cardiovasculaire et sans favoriser les infections. Ainsi, ces nouvelles thérapies pourraient répondre à des besoins urgents dans la prise en charge des patients atteints de maladie auto-immunes. Objectif global : identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies auto-immunes (MAI).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’apporter des données pré-cliniques solides visant à promouvoir l’utilisation de nouvelles thérapies à anticorps chez les patients atteints de maladies auto-immunes systémique sévère. Ces traitements ont déjà une Autorisation de Mise sur le Marché chez l’Homme dans d’autres maladies (pour traiter certains cancers du sang). De ce fait, si ce projet est concluant, la translation des résultats (évaluation de ces traitements) chez l’Homme pourra être extremement rapide, avec un bénéfice attendu majeur chez les patients atteints de maladie auto-immunes.

Procédures

→ Deux injections sous anesthésie, Durée de deux fois cinq minute comprenant l’anesthésie ou deux injections par semaine pendant 8 à 12 semaine durant 1 minute chacune → Une irradiation corps entier chez un animal vigile pour une durée de moins de trois minutes. → Un prélèvements sanguin sous anesthésie générale une fois pa rmois jusqu’à la fin de l’expérimentation (7 prélèvements maximum).

Impact sur les animaux

Le projet utilise des modèles souris spontanés ou induits caractérisés par le développement progressif d’une maladie autoimmune, responsable d’une perte de poids et d’un développement de ganglions. Les animaux subiront : > Stress due aux manipulations de la souris. > Inflammation de la peau ou des articulations due à la maladie auto-immune. > Douleur transitoire aigue et de courte durée suite aux injections de traitement et aux prélèvements

Devenir

A la fin de l'expérimentations, les animaux seront mis à mort dans l’objectif d’étudier l’impact des traitements sur la maladie auto-immune (étude du sang et des organes).

Remplacement

Les nouvelles stratégies thérapeutiques testées ici ont déjà été testées in vitro et on démontré leur efficacité sur leur mécanisme d'action. L'objectif du projet est d'étudier l'impact de ces traitement à l'échelle de l'organisme et notamment au sein des tissus affectés par la maladie auto-immune. Ces données pré-cliniques sont les dernières à acquérir avant d'envisager un traitement de patients atteints de maladie auto-immune, elles sont donc incontournables.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été déterminée en amont. Le nombre de souris nécessaire a été calculé à l’aide d’outil mathématiques pour chaque question posée afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes et fiables.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements de leur environnement permettant d’améliorer le confort des souris (papier kraft, dome, tunnels). L’état de santé des animaux sera examiné de façon hebdomadaire. Des points limites ont été définis afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques. Les injections et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour diminuer l’inconfort. Une analgésie sera mise en place lorsque nécessaire. Les souris seront acclimatées pendant minimum 7 jours à l’utilisation pour réduire le stress des manipulations. Une habituation des animaux à leur manipulation sera faite préalablement au début de l’expérimentation.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 2 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 à 18 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent, selon la lignée étudiée).

La moitié des souris utilisées est immunodéprimée, dépourvue de lymphocytes T et B matures, ce qui garantit selon le porteur une prise tumorale dans 100 % des cas. 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une injection sous-cutanée de cellules de corticosurrénalome puis une injection de lymphocytes modifiés par voie rétro-orbitaire, avant six mesures de tumeur au pied à coulisse ou huit échographies avec rasage des flancs. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer une douleur modérée et des métastases, et compte l'usage de souris immunodéprimées parmi ses mesures de réduction du nombre d'animaux.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien (CCS), est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases au diagnostic. Le mauvais pronostic du CCS peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients de CCS à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence que la protéine CD276 est surexprimée dans les CCS de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’utiliser des lymphocytes T modifiés génétiquement (cellules CAR [Chimeric Antigenic Receptor]-T) dans le but de reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. Ces expériences seront réalisées sur un modèle simple (souris immunodéficientes) pour la preuve de concept puis dans un modèle plus complexe de souris génétiquement modifiées reproduisant les deux altérations génétiques les plus fréquemment retrouvées chez les patients porteurs des CCS agressifs.

Bénéfices attendus

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer agressif et de mauvais pronostic, dû au manque de thérapies efficaces. La réalisation de ce projet nous permettra d’évaluer le potentiel antitumoral de lymphocytes T modifiés génétiquement pour reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. L’objectif de ces expériences est de développer une nouvelle approche thérapeutique qui permettra à terme, d’améliorer le traitement et la survie des patients.

Procédures

- Procédure 1, sur les 24 souris : Rasage sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection sous-cutanée des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection intra-veineuse des cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs au pieds à coulisse. Durée 1min, 6 fois - Procédure 2, sur les 24 souris: Injection intra-veineuse des cellules cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs par échographie sous anesthésie gazeuse + rasage des flancs. Durée 30min, 8 fois.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1, l’injection sous-cutanée des cellules dérivées de corticosurrénalome murin, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur légère et de courte durée au site d’implantation. La mesure des tumeurs au pied à coulisse n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger dû à la contention de l’animal. L’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. Enfin la croissance tumorale peut engendrer une douleur/gène modérée. Dans la procédure 2, l’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. L’échographie, réalisée sous anesthésie gazeuse, n’engendre pas de douleur mais peut induire un stress léger. Le modèle murin de CCS avancé utilisé présente un développement tumoral et éventuellement des métastases.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer les nouvelles approches de traitement des corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro. Ainsi les premiers tests de spécificité et d’efficacité des cellules CAR-T CD276 seront réalisés sur une lignée de cellules dérivées d’un CCS métastatique, dans des conditions de culture optimales. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des expériences de cytométrie en flux et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. En procédure 1, l’utilisation de souris immunodéficiente permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure. Cette procédure nous permettra de vérifier que les cellules CAR-T survivent, prolifèrent et s’attaquent bien aux tumeurs le tout dans d’un modèle plus rapide et à effets indésirables moins important qu’un génotype créant des tumeurs agressives. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’établissement de notre preuve de concept. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Plus précisément, les souris immunodéficientes seront hébergées dans une zone dédiée aux animaux immunodéficients avec armoire ventilée, couvercle de cage filtrant, litière autoclavée et eau filtrée. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de batons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 individus (sauf indication contraire) pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.

Choix des espèces

Choix des espèces : Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Pour la procédure 1 nous utiliserons une souche de souris immunodéprimée, caractérisée par une absence de production de lymphocytes T et B matures. L’utilisation de cette souche permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure ce qui in fine permet de résuire le nombre d’animaux utilisés. La lignée murine utilisée pour la procédure 2 est un modèle préclinique murin pertinant de corticosurrénalome métastatique reposant sur l’invalidation surrénalienne de deux gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients portant les corticosurrénalomes les plus agressifs. Stades de développement : Pour la procédure 1 nous injecterons les cellules dérivées d’un CCS métastatique murin dans les souris à l’âge de 6 semaines, âge où le système immunitaire est mature, puis les cellules CAR-T 7 jours plus tard. La croissance tumorale sera suivie pendant 14 jours supplémentaires soit un âge final de 9 semaines au moment de l’euthanasie. Pour la procédure 2, nous avons montré que notre modèle préclinique murin développe des corticosurrénalomes agressifs à partir de 4 mois et que la dissémination métastatique est évidente à 6 mois. Nous effectuerons donc le traitement avec les cellules CAR-T à 4 mois et effectuerons le suivi longitudinal de la progression tumorale par échographe jusqu’à 6 mois.

Pour savoir si des cellules sanguines mutées aggravent les lésions cérébrales après un accident vasculaire cérébral, 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux irradiations de la patte arrière espacées de 17 heures, puis une greffe de moelle osseuse par injection, un gavage de cinq jours pour activer la mutation, et des prises de sang répétées pendant deux mois. Le porteur décrit une perte de poids courante après l'irradiation et la greffe, une baisse d'activité et une réduction des interactions avec les autres souris. Aucune n'est tuée sur place au terme de ces procédures, toutes doivent être exportées vers des collaborateurs allemands qui leur infligeront les accidents vasculaires cérébraux.

Objectifs

Ce projet vise à explorer le lien possible entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et l'hématopoïèse dite clonale, une condition liée à l'âge où les cellules souches hématopoïétiques (à l’origine de toutes les cellules du sang) subissent des mutations et prolifèrent de manière déséquilibrée. Les personnes atteintes d'hématopoïèse clonale présentent un risque accru de développer des tumeurs, des AVC ou des crises cardiaques. Il reste cependant incertain que ces cellules sanguines mutées pénètrent dans le cerveau et y causent des dégâts après un accident vasculaire cérébral. Chaque année, environ 12 millions de nouveaux cas d'AVC sont recensés dans le monde, avec, au total, environ 103 millions de survivants qui doivent vivre avec les séquelles de cette affection. Dans une étude récente, 41 % des patients ayant subi un premier AVC présentaient des mutations dans leurs cellules souches hématopoïétiques, augmentant leur risque de subir un deuxième AVC ou d'autres événements vasculaires dans les trois ans suivants. Pour examiner cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour le gène appelé TET2 codant pour une enzyme importante pour la stabilité de l’hématopoïèse. Nous transplanterons la moelle osseuse de ces souris dans des souris receveuses localement irradiées sur le membre postérieur au préalable afin d’étudier la progression de l’hématopoïèse clonale à partir du site d’implantation du greffon comme pour modéliser le départ d’une hématopoïèse clonale chez l’Homme. Ces souris seront ensuite envoyées à nos collaborateurs en Allemagne pour modéliser l'AVC dont les conséquences seront graduées par gravité en fonction de la proportion de cellules clonales TET2. Les études sur les souris nous permettront de mieux comprendre les mécanismes des lésions cérébrales post-AVC, notamment l'impact des traitements sur la motricité fine, la démarche, l'équilibre, et la restauration des fonctions motrices, ainsi que sur la possibilité de traiter l'inflammation cardiaque. L'objectif global de ce projet est donc de déterminer si l'hématopoïèse clonale contribue à la gravité des AVC et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels significatifs pour la compréhension et le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des conditions liées à l'hématopoïèse clonale. 1. Amélioration de la compréhension des AVC: En explorant les liens entre l'hématopoïèse clonale et les AVC, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’aggravation des conséquences post-AVC et comment ceci est influencé par la présence de mutations sur un gène connu comme responsable de dérégulations de l’hématopoïèse (TET2). 2. Développement de nouveaux traitements: La recherche sur les souris génétiquement modifiées pour ce gène TET2 permettra d'évaluer l'impact des mutations sur les lésions cérébrales après un AVC. Ces études peuvent révéler si la taille du clone muté aggrave les conséquences de l'AVC, ce qui ouvrirait la voie à de nouveaux traitements ciblés, notamment des thérapies anti-inflammatoires adaptées aux patients présentant une proportion importante de cellules mutées pour le gène TET2.. 3. Amélioration de la prise en charge des patients: Pour les patients atteints d'hématopoïèse clonale, comprendre le rôle des cellules mutées dans les tissus cérébraux après un AVC peut améliorer les stratégies de traitement. Par exemple, en mesurant la taille des clones mutés, les médecins pourraient mieux orienter les traitements pour réduire l'inflammation et améliorer la récupération des fonctions motrices et cognitives après un AVC. 4. Contributions à la recherche sur le cancer: Étant donné que la mutation de TET2 est également courante dans les cancers de la moelle osseuse, ce projet pourrait avoir des implications pour la recherche oncologique. Les découvertes faites ici pourraient aider à développer des traitements qui ciblent non seulement les AVC mais aussi les cancers liés à ces mutations génétiques.

Procédures

Dans ce projet, nous réaliserons plusieurs interventions sur des souris pour comprendre les effets de certaines cellules sur les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Les souris seront d'abord endormies (15min) avec une injection pour les préparer à une procédure. Elles recevront ensuite deux courtes doses d’irradiation (5min) , espacées de 17 heures, pour préparer leur moelle osseuse à recevoir la greffe de nouvelles cellules. Après chaque dose de rayons, les souris seront réveillées. Deux heures après la deuxième irradiation, les souris seront brièvement endormies pour que nous puissions injecter (30 secondes par injection) les nouvelles cellules mutées pour le gène TET2. Cette méthode permet de s'assurer que ces cellules atteignent bien leur destination et commencent à se développer correctement dans la moelle osseuse des souris. Deux mois après cette intervention, nous donnerons un médicament par gavage (1 minute) aux souris pendant cinq jours pour activer la mutation de ces nouvelles cellules TET2. Nous surveillerons ensuite les souris pendant deux mois supplémentaires pour vérifier que ces cellules se développent comme prévu. Pendant cette période, nous prélèverons régulièrement de petites quantités de sang pour suivre l'évolution des cellules et vérifier l'état de santé général des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour comprendre les effets de certaines cellules mutées sur les AVC pourraient éprouver divers désagréments et effets secondaires. Les procédures que les souris subiront, comme l'irradiation et la greffe de moelle osseuse, peuvent provoquer des douleurs temporaires et un stress. L'irradiation peut entraîner une gêne temporaire dans la zone traitée. De plus, le traitement avec un médicament peut aussi causer des douleurs passagères, et le fait de donner ce médicament aux souris peut les stresser. Après l'irradiation et la greffe, il est courant que les souris perdent un peu de poids en réaction à ces procédures. Cette perte de poids est généralement temporaire, mais nous devons surveiller les souris de près pour nous assurer qu'elles restent en bonne santé. Les souris pourraient également être moins actives et bouger moins que d'habitude pendant un certain temps après ces interventions. Elles pourraient réduire leurs activités quotidiennes, explorer moins leur environnement et interagir moins avec les autres souris. Il existe aussi des risques de complications, comme des infections ou des réactions du système immunitaire, bien que ces problèmes soient rares si les procédures sont bien contrôlées. En résumé, les souris pourraient ressentir des douleurs, du stress, une perte de poids et une diminution de leur activité pendant un certain temps en raison des interventions nécessaires pour cette étude. Nous veillerons à surveiller attentivement leur bien-être tout au long du processus.

Devenir

Tous les animaux sont prévus pour être exportés en Allemagne à nos collaborateurs pour les expériences d’AVC dans le cadre du projet européen.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre le lien entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et un phénomène complexe appelé hématopoïèse clonale. Il explore comment certaines cellules sanguines, qui ont subi des mutations, interagissent avec le cerveau lors d'un AVC. A ce jour, les méthodes sans animaux ne peuvent pas reproduire ces interactions complexes. Les cultures cellulaires et les organoïdes (mini-organes cultivés en laboratoire) ne parviennent pas à imiter toutes les interactions entre les différentes parties du corps. Elles ne peuvent donc pas nous donner une vue complète des effets de l'hématopoïèse clonale sur les AVC. Les simulations informatiques et les modèles mathématiques peuvent aider à comprendre certains aspects de cette recherche. Toutefois, ces outils dépendent de données préexistantes et ne peuvent pas prédire de manière fiable les interactions biologiques complexes qui se produisent dans un organisme vivant. Par conséquent, ils ne sont pas suffisants pour répondre à nos questions de recherche. Pour vraiment comprendre comment l'hématopoïèse clonale influence la progression et les conséquences des AVC, nous devons observer ces processus dans un organisme entier. Les souris TET2 présentent des mutations génétiques spécifiques et sont essentielles pour cette étude. Elles nous permettent de modéliser les mutations et de voir leurs effets sur l'ensemble du corps, y compris le cerveau. Ces modèles animaux nous offrent une vue intégrée des interactions entre les cellules sanguines mutées et les tissus cérébraux touchés par un AVC. Cette compréhension est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. En résumé, bien que nous ayons envisagé des alternatives non animales, elles ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, tout en garantissant des résultats fiables et pertinents. D'abord, nous avons effectué des expériences préliminaires pour déterminer combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Ces expériences nous ont aidés à établir des sous-groupes d'au moins 8 à 10 souris, ce qui est crucial pour assurer la validité des résultats. Pour chaque condition expérimentale, nous avons besoin d'un minimum de 60 souris. Cela inclut 30 souris greffées avec des cellules souches mutantes TET2 et 30 avec des cellules souches non mutantes, réparties en trois sous-groupes en fonction de la réponse biologique observée. Pour réduire encore le nombre d'animaux, nous avons optimisé nos protocoles expérimentaux. Cela signifie que nous avons standardisé les procédures pour maximiser les données obtenues sur chaque souris. Nous suivons chaque animal à plusieurs moments clés au cours de l'étude. Cette approche longitudinale permet d'obtenir plus d'informations de chaque souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. Nous avons aussi pris en compte la variabilité biologique inhérente à ce type d'étude, ce qui signifie que nous avons ajusté nos chiffres pour compenser les éventuelles variations biologiques. Ces mesures permettront de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans cette recherche.

Raffinement

Pour minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales de ce projet, nous mettrons en place plusieurs mesure, basées sur les meilleures pratiques en matière de soin et d’éthique animale. Les animaux seront surveillés de manière régulière, surtout après les interventions critiques telles que l'irradiation et la transplantation de moelle osseuse. Des observations fréquentes seront réalisées pour détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de comportement anormal ou des aspects tels que la perte de poids, l’inactivité, les signes de douleur et d’autres indicateurs de bien-être. Immédiatement après les interventions, les animaux bénéficieront de soins post-opératoires complets. Cela inclut la mise en place de conditions environnementales optimales (température, humidité, nourriture et eau) pour favoriser une récupération rapide et confortable. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale pour minimiser la douleur et le stress. Les paramètres vitaux des animaux seront surveillés tout au long de l’anesthésie pour s’assurer qu’ils restent dans des plages sécuritaires. Les cages des souris seront enrichies pour fournir un environnement stimulant et réduire le stress. Cela inclut l’ajout de matériaux de nidification et de cachettes (tube carton) pour favoriser une activité physique et mentale. Un environnement enrichi contribue au bien-être général des animaux et à leur récupération post-intervention. Des points limites ont été définis pour limiter ou arrêter la douleur et une analgésie sera mise en place si nécessaire

Choix des espèces

Pour ce projet, nous avons choisi d'utiliser des souris adultes consanguines. Ces souris sont les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées dans les études sur le système hématopoïétique car leur consanguinité permet d’éviter les rejets lorsqu’on les greffe entre-elles et de limiter les variabilités expérimentales. Elles ont la particularité de pouvoir exprimer deux protéines distinctes , ce qui permet de reconnaître le greffon de l’hôte greffé. Les souris TET2 expriment le CD45.1 et sont greffées dans des souris CD45.2, ce qui permet de les suivre dans l’organisme. Nous utilisons également des lignées spéciales de souris TET2 qui portent des mutations génétiques spécifiques muettes que l’on rend fonctionnelles après la transplantation, grâce à un traitement avec un médicament appelé tamoxifène. Cela nous permettra d’étudier comment ces mutations affectent les cellules sanguines de l’hôte et leur interaction avec le cerveau. Les souris que nous utiliserons pour les greffes et les expériences seront toutes des adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix d'âge est crucial car les processus biologiques que nous étudions, tels que l'hématopoïèse (la formation des cellules sanguines), sont plus stables et prévisibles chez les souris adultes. De plus, étant donné que nos expériences peuvent durer 2 à 3 mois, il est important que les souris ne soient pas trop âgées, afin d'assurer que les résultats soient cohérents et fiables.

Une plaie nécrosée, purulente ou suintante déclenche la mise à mort immédiate, tout comme une perte de plus de 20 % du poids maintenue trois jours ou une hypothermie persistante. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis elles reçoivent une à deux administrations par jour pendant seize jours, avec des mesures d'épaisseur de peau tous les deux jours et une prise de sang hebdomadaire. Les molécules testées appartiennent à des clients de l'établissement, dont le porteur écrit ne pas connaître la composition, et le choix de la souris tient notamment à ses "faibles coûts", à sa croissance rapide et à sa facilité de transport.

Objectifs

La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.

Procédures

Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).

Impact sur les animaux

L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.

Remplacement

L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'excipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.

Les souris de cette lignée portent une mutation qui les prive d'une partie de leurs défenses immunitaires et vaut à certaines une maladie proche du lupus humain, avec insuffisance rénale, dermite, dépilation, plaies et douleurs articulaires. 895 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec une croissance ralentie et une mortalité qui augmente à partir de six mois. Les souriceaux sont prélevés à l'oreille pour être génotypés, puis chaque animal subit trois à huit prélèvements de sang et d'urine, sans anesthésie, le porteur estimant les gestes assez rapides pour s'en passer. Les souris destinées aux expériences sont tuées pour le prélèvement des organes, celles qui atteignent un point limite le sont également, et les reproducteurs restent en vie pour entretenir la lignée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions des lymphocytes (cellules incluses dans les globules blancs et impliquées dans la réponse du système immunitaire) ce qui conduit à induire un déficit immunitaire (baisse de la fonction d’une partie au moins des cellules du système immunitaire) chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris portant cette mutation ainsi que l’identification de la mutation par analyse génétique pour identifier les animaux.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire. Un prélèvement tissulaire et plusieurs prélèvements sanguins et urinaires (prélèvements sanguins et urinaires mensuels avec un total de 3 ou 8 selon les groupes) pour seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire à phénotype dommageable avec une croissance moins importante et une mortalité accrue à partir de l’âge de 6 mois. Les souriceaux seront prélevés à l’oreille pour le génotypage, et un prélèvement sanguin sera réalisé sur chaque animal adulte utilisé dans les expériences, juste avant la mise à mort. Ces gestes peuvent générer de la douleur, cependant les gestes réalisés sont des gestes de base, rapides (moins de 2 minute par geste), pour lesquels nous sommes expérimentés, donc ils ne nécessitent pas d'anesthésie. De plus les animaux sont habitués à la contention réalisés pendant ces gestes, ce qui réduit leur stress. Une partie des animaux est susceptible de développer une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale. De plus, les animaux peuvent développer un gonflement des ganlgions associé à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous la peau du crâne par semaine pendant quatre semaines, passe des tests cognitifs, puis subit une ponction du liquide céphalo-rachidien avant d'être tué par exsanguination. Une partie du protocole porte sur des souriceaux de sept jours, que la manipulation expose au rejet par leur mère, à la mort par hypothermie ou au cannibalisme, effets que le porteur qualifie de rares et sporadiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne capture la complexité d'un "organisme entier" et écarte la drosophile, C. elegans et le poisson zèbre, dont la barrière cérébrale diffère trop de celle des mammifères.

Objectifs

Récemment, certaines zones barrières du cerveau, ont été identifiées comme des interfaces de communication active entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières. De plus, des découvertes récentes ont identifié des canaux ouverts dans l'os du crâne, les cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse peuvent accéder au cerveau en cas de maladie ou d'infection, tandis qu'en bonne santé elles atteignent le cerveau et de là libèrent des facteurs solubles qui peuvent façonner le cerveau à distance. Les troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont considérés comme neurodéveloppementaux. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, certains traitements existent, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent unanimement que la dérégulation du système immunitaire est au centre de la pathologie. Les signaux inflammatoires dans le cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer devraient donc influencer l’activité de la moelle osseuse. En effet, des travaux antérieurs et préliminaires ont montré que le processus de production de cellules immunitaires et d’autres propriétés du tissu de la moelle osseuse sont altérés dans la maladie d’Alzheimer, mais il n’est pas certain que cela soit vrai pour la moelle osseuse crânienne. De plus, nous savons que les signaux immunitaires dérivés de la moelle osseuse via le cerveau peuvent influencer l’activité cérébrale chez les adultes, mais on comprend moins bien si ces signaux contribuent au développement du cerveau. Notre objectif est d’étudier comment la moelle osseuse crânienne est altérée dans la maladie d’Alzheimer et au cours du développement, et si des changements dans dans la moelle osseuse pourraient modifier le développement cérébral ou la progression de la trajectoire de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra d’identifier des facteurs produits par la moelle osseuse du crâne et potentiellement impliqués dans la modulation du développement et du fonctionnement du cerveau dans les cerveaux sains et atteints de la Maladie d’Alzheimer (MA). À court terme, cette étude fournira des connaissances fondamentales sur un nouveau canal de communication cerveau-immunité. Explorer les frontières cérébrales dans cette direction est très important car l’accès des médicaments courants au cerveau est souvent altéré, car de nombreux médicaments ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique. Ces dernières années, nous avons observé d’énormes progrès dans le développement de médicaments pour les maladies cardiovasculaires, les maladies immunologiques et le cancer, mais peu de progrès ont été réalisés en neurologie, en partie à cause de cet obstacle. Par conséquent, la compréhension des voies alternatives vers le cerveau est un défi majeur en neurologie. Plus précisément, à long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de nouvelles approches pharmacologiques qui réguleraient cette voie de communication cerveau-immunité pour lutter contre la Maladie d’Alzheimer (MA) ou prévenir le risque d’autisme.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse, une fois par semaine pendant 4 semaines. Ensuite, les souris seront testées pour leur capacité cognitive (sans stress ni douleur) pendant une semaine. Enfin, les souris recevront une injection intrapéritonéale 16h plus tard, une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien et seront mises à mort par exsanguination (élimination du sang). Dans la procédure 2, des souris âgées de 7 jours seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse. Suite à l’injection, les souris âgées de 15 ou 21 jours recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien. Les souris adultes après une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne seront testées pour leur comportement (pas de stress ni de douleur) dans un délai de deux semaines. Apres, les souris recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien.

Impact sur les animaux

Les injections et l'anesthésie peuvent provoquer une légère douleur et un stress temporaire. Nous ne prévoyons pas d'effets négatifs supplémentaires résultant de ces manipulations ou de la nature des substances injectées. Dans de rares cas, les souriceaux après manipulation sont rejetés par la mère et ils peuvent mourir d'hypothermie. Dans des cas sporadiques, une séparation temporaire peut provoquer un stress chez la mère entraînant un cannibalisme chez les souriceaux. De plus, la manipulation des animaux pendant les tests comportementaux peut provoquer un léger stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition.

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules situées dans la moelle crânienne agissent sur le cerveau, dans le développement et dans un modèle de maladie d’alzheimer (MA). La niche de la moelle crânienne est un organe complexe composé de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu stromal englobant différents types de fibroblastes, d'adipocytes et de cellules immunitaires de l'ensemble de l'arbre hématopoïétique. Notre question est de savoir comment ces cellules et leurs produits atteignent le cerveau et modulent sa fonction. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui capture la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composants endothéliaux, stromaux, immunitaires et neuronaux. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. De plus, l'indicateur le plus fiable de la gravité de la maladie dans les modèles de MA (et les patients) est la mesure de leur capacité cognitive, et pour les modèles de troubles du spectre autistique (TSA) - comportement social, les paramètres ne peuvent pas être testés dans des modèles non animaux.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre le crâne, la moelle osseuse et le cerveau dans les maladies neurodégénératives et le développement. Les quantités d'animaux utilisées pour réaliser notre projet sont établies en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Seuls 10 microlitres du liquide à analyser ( liquide cephalo rachidien (LCR)) peuvent être collectés dans le cerveau d'une souris, ce qui ne permet qu'un seul type d'analyse. Un seul échantillon de crâne et des méninges uniques ne peuvent être utilisés que pour une seule analyse à la fois, mais le cerveau peut être conservé (de plusieurs façons) et utilisé pour plusieurs tests. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences seront réalisées en triples pour obtenir des résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 4 groupes comparés (sains vs. alzheimer et traités vs. contrôle) : les effectifs proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.

Raffinement

Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort. Des injections sous-cutanées (sous la peau) sur le dessus du crâne seront effectuées sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant sur lequel les animaux seront maintenus pendant la procédure et jusqu'à leur réveil pour minimiser l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives. De nombreux anticorps dirigés contre des épitopes murins et permettant l’analyse par imagerie et/ou la déplétion de certains types cellulaires sont également disponibles. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Au cours du développement typique de la maladie de type Alzheimer chez les souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau, clairement visibles au microscope, qui se développent à 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, que nous mesurons dans des tests comportementaux. Cet âge peut varier légèrement en fonction de l'animal et du sexe (les femelles développent généralement la maladie plus lentement que les mâles dans ce modèle). Pour capturer ces fenêtres de progression de la pathologie, des injections sous-cutanées pour manipuler le crâne seront administrées aux animaux à l'âge de 3 à 6 ou de 6 à 9 mois et des échantillons seront prélevés à 4, 6 ou 9 mois. Nous injecterons aussi des souris le 7e jour postnatal (P.7) pour pouvoir capturer la fenêtre de développement de la croissance et du recâblage intenses du cerveau, qui se produit vers entre le 10eme et le 20eme jour postnatal. Nous analyserons les cerveaux aux âges entre le 15eme et le 21eme jour postnatal pour capturer tous les changements que la manipulation aurait pu imposer au cerveau et analyserons le comportement des souris adultes après la manipulation pour voir si cela a eu des effets à long terme.

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.