Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude du rôle de l’inflammation dans l’obésité chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Comparer un régime riche en graisses donné en continu ou par alternance de deux semaines : 2 080 souris vont être utilisées pendant vingt semaines de régime gras, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Les nouveau-nés subissent une biopsie de la queue pour génotypage, puis les animaux reçoivent jusqu'à quatre injections intrapéritonéales, un gavage et jusqu'à dix prélèvements sanguins à la veine de la queue, le dernier se faisant en rétro-orbitaire sous anesthésie. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, chaque souris est isolée dans sa propre cage. Le porteur annonce des points limites lors de ces tests, avec apport de glucose ou d'insuline si les seuils sont atteints, et un enrichissement par bâtonnets de bois pour éviter que les dents ne poussent anormalement faute d'aliment dur.
Objectifs
L’obésité est en augmentation croissante dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement et contribue à l’augmentation des pathologies cardiovasculaires qui se situent au premier rang des causes de mortalité dans le monde. De ce fait, l’étude des mécanismes impliqués dans le développement de cette pathologie constitue un enjeu majeur de santé publique. Notre projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’obésité, et plus particulièrement d’étudier les effets induits par un régime induisant l’obésité donné de manière discontinue en comparaison avec ce même régime donné de manière continue. Nous étudierons en particulier les effets de ces 2 régimes sur la modulation de la réponse inflammatoire. Seule l’expérimentation in vivo, qui mime de façon fidèle la complexité de la réponse inflammatoire dans un contexte d’obésité nous permettra de mettre en lumière des acteurs clés impliqués dans la pathogenèse de cette maladie. Pour cela, nous évaluerons différents paramètres métaboliques et immunologiques chez des souris soumises à un régime riche en acides gras. Pour induire l’obésité, nous allons utiliser un modèle d’obésité chez des souris contrôle et des modèles génétiquement modifiés (mâles et femelles, nombre total de souris : 2080 sur une durée de 5 ans). Ce modèle murin est une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de cette maladie. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes in vitro qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité chronique. Ce projet comporte 2 procédures : (A) une qui consiste en la mise des animaux sous régime riche en matières grasses soit de manière continue ou discontinue (en alternant le régime gras et standard toutes les 2 semaines) pendant une durée maximale de 20 semaines de régime gras pour les 2 groupes de souris. Cette durée de régime gras de 20 semaines permet le développement de l’obésité. Pour évaluer les paramètres métaboliques des tests de tolérance à l’insuline et au glucose seront effectués. Ces tests consistent en l’administration d’insuline par voie intrapéritonéale ou de glucose par voie orale, des prélèvements de sang seront ensuite réalisés sur souris vigile à différents temps pour doser le taux de glycémie. Il y a également un prélèvement sanguin à effectuer avant la mise à mort des animaux. (B) une seconde pour l'élevage des animaux.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de comprendre, in vivo, le rôle de l'inflammation mise en jeu dans les différents types cellulaires et tissulaires et son implication dans l'obésité. Cela permettra de définir de nouvelles approches thérapeutiques ciblant la réponse immuno-inflammatoire pour le traitement des patients présentant des maladies métaboliques telle que l'obésité.
Procédures
Des animaux seront utilisés pour la génération de colonies d'animaux. Les nouveaux-nés auront une biopsie caudale. Les animaux auront jusqu'à 4 injections intrapéritonéales sur toute la durée de la procédure (durée inférieure à 30 secondes par injection) . Les animaux vigiles auront un gavage (durée inférieure à 30 secondes) au cours de la procédure. Des prélèvements sanguins auront lieu sur animaux anesthésiés (une seule fois avec une durée inférieure à 30 secondes) ou vigiles à la veine de la queue (jusqu'à 10 prélèvements de moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : 1- inconfort lié à la préhension et contention des animaux, lié au gavage, 2 - potentielle douleur au point d'injection en intrapéritonéale et au prélèvement sanguin terminal en rétro-orbitaire, 3 - stress lié à l'anesthésie, à l'individualisation des animaux durant les tests métaboliques et aux prélèvements de sang à la queue.
Devenir
A l'issue des différents gestes techniques, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure dans le but de prélever les différents organes ou tissus d'intérêt. Ceci nous permettra d'étudier les populations cellulaires d'intérêt à l'aide de différentes expériences, afin de répondre aux différentes questions posées dans le cadre de ce projet.
Remplacement
Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité. Les modèles in vivo sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.
Réduction
Selon le principe de réduction décrit au 2° de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime, et à partir des données de la littérature et de notre expérience sur le sujet (résultats analysés avec des tests statistiques adaptés), nous avons déterminé un nombre minimun de souris par groupes expérimentaux pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal. Les accouplements (en trio) seront optimisés (choix des génotypes) pour permettre l'obtention des groupes d'animaux nécessaire à la réalisation des expériences dans les conditions définies ci-dessus.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Le suivi quotidien de tous les animaux par le personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) et la mise en place de points limites adaptés permettront d'identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas : maisonnettes si des comportements de domination sont observés ; bâtonnets de bois pour les cages sous régime riche en gras (aliment mou) pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale. Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, les souris seront individualisées pour limiter les interactions avec les congénères, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose ou l'insuline sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Ensuite, les animaux retourneront avec leurs congénères, dans la cage d’hébergement d'origine pour limiter le stress lié au changement de cage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs ou par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Un suivi hebdomadaire du poids des animaux sera réalisé par les expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude de l'obésité avec notamment le développement du syndrome métabolique dans un laps de temps raisonnable. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées génétiquement modifiées que nous souhaitons étudier. En effet, la souris est l'espèce dont la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. L’utilisation des souris permet ainsi d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés, qui nous permettront d’appréhender le rôle spécifique d’un type cellulaire, d’un facteur ou encore d’une voie de signalisation dans l’obésité. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Les souris seront utilisées au stade adulte, à partir de 8 semaines. Le développement de l’obésité est corrélé à l’âge, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes. Au stade nouveaux-nés, les animaux seront marqués par bagage et une biopsie caudale sera réalisée afin de génotyper et ainsi sélectionner les animaux génétiquement modifiés pouvant rentrer dans la procédure.
Mise en place et caractérisation phénotypique d’un modèle murin d’encéphalopathie du prématuré.
- Recherche fondamentale
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- Système immunitaire
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent dès leurs premiers jours de vie une injection intrapéritonéale d'extrait bactérien destinée à reproduire l'encéphalopathie du prématuré, puis subissent deux chirurgies de quarante-cinq minutes pour la pose de prothèses de contention de la tête. 2 160 souris sont concernées, 1 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 1 040 d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur annonce des déficits fonctionnels et cognitifs parmi les effets attendus, et décrit par ailleurs les nuisances de l'imagerie et des tests comportementaux comme un simple stress lié à la manipulation, à l'isolement et à la nouveauté, sans préciser lesquels de ces tests seront pratiqués. Il affirme que ces modèles inflammatoires reproduisent "parfaitement" les caractéristiques de la pathologie humaine.
Objectifs
Une naissance est considérée comme prématurée lorsqu’elle intervient avant 37 semaines et se positionne comme un véritable problème de santé mondiale avec une incidence de 15 millions de cas par an. La prématurité est notamment associée à un large spectre d’altérations globales du développement se manifestant sous la forme de troubles moteurs, sensitif (e.g. vision), d’une altération des fonctions cognitives ou encore de troubles de l’attention et de l’hyperactivité. Ces déficits neurologiques qui peuvent demeurer observables jusqu’à l’âge adulte sont caractérisés au niveau morphologique par un ensemble d’anomalies cérébrales qui sont regroupées sous le nom d’encéphalopathie du prématuré.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre différentes pathologies neurodéveloppementales humaines. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude phénotypique de l’encéphalpathie du prématuré doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes ex vivo de ce projet seront réalisées en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser les processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.
Procédures
L’ensemble des souriceaux recevront une injection intra péritonéale d'un extrait de proteine bactérienne afin de reproduire l’encéphalopathie du prématuré (N =2160). Aux jours post-nataux (P) 3, 5, 7, 10, 15, 30 et 60 une imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 420) et une imagerie fonctionnelle échographique (1 heure maximum, n = 420) seront réalisées avec une injection intraveineuse de l'agent de contraste au préalable. La méthode la plus efficiente pour cette administration sera évaluée dans une procédure de mise au point (40 souriceaux seront concernés par cette procédure de mise au point). Deux procédures chirurgicales d’une durée de 45 minutes seront réalisées afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts de mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie fonctionnelle échographique (n = 420) et en microscopie (n = 280). Les tests comportementaux seront réalisées de manière longitudinale à P3, P5, P7, P10, P15, P30 et P60 (n = 240).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement ainsi qu’à la nouveauté. Durant les examens d’imagerie, les animaux peuvent subirent un stress dû à la manipulation. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié notamment grâce à la prise journalière du poids des animaux, leur observation dans la cage en s’assurant de leur bien-être (prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations sur des coupes de tissu.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (encéphalopathie du prématuré, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, les analyses comportementales et les analyses morphologiques ne seront pas réalisées chez les mêmes animaux pour éviter la récupération fonctionnelle et donc le biaisement des résultats. Aussi, le projet comporte deux procédures de mise au point qui permet de s’assurer que les suivantes seront réalisées de la meilleure façon. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale (pose du support de tête pour limiter les mouvements de la tête lors des examens d'imagerie), les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil chauffée. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. De plus, la souche utilisé dans ce projet est également utilisée comme fond génétique de plusieurs lignées génétiquement modifiées utilisées au laboratoire et qui pourront, plus tard, être éventuellement utilisées dans le cadre de ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, les modèles d’encéphalopathie du prématurés induits par des stimuli inflammatoires sont très souvent utilisés car ils reproduisent parfaitement les caractéristiques de la pathologie humaine, ce qui en fait un modèle d’étude robuste. De même, il est admis que l’inflammation systémique induit des changements au sein du compartiment vasculaire comme dans ses interactions avec les cellules qui l’entourent. Cet ensemble de connaissances et les acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur un stimulus inflammatoire à partir du premier jour post natal. Il est donc nécessaire de se procurer des femelles gestantes en amont afin de limiter le stress du voyage aux nouveau-nés. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. La procédure de mise au point engendrera une évaluation comportementale au 7ème jour post natal chez les souriceaux. A ce même stade, une mise au point du protocole d’injection de l’agent de contraste pour les examens d'imagerie sera réalisée. En effet, cet agent de contraste nécessite d’être injecté en intraveineuse mais la voie habituellement utilisée (dans la veine caudale de la queue) n’est pas réalisable à ce stade de développement précoce. Une analyse microscopique sur coupes de tissus prélevés au 15e jour post natal permettra de voir si le modèle récapitule bien l’atteinte la plus décrite dans l’encéphalopathie du prématuré. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (jours poast nataux 3 / 5 / 7 / 10 / 15 / 30 / 60) est nécessaire afin d’identifier des différences dans le développement des différents groupes.
Mécanismes et thérapeutiques de l’anémie autoimmune
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Onze prélèvements sanguins en une quinzaine de jours et l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau : 2 604 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections répétées d'auto-anticorps dirigés contre leurs globules rouges, pour identifier les récepteurs responsables de leur destruction dans l'anémie auto-immune. Le porteur écrit que ce modèle n'induit pas de nuisances remarquables, tout en décrivant des souris aux pattes blanchies, immobiles et ne réagissant plus quand on les saisit, et fixe la mise à mort à 70 % de globules rouges détruits. Il indique que le recours à des lignées consanguines réduit le nombre d'animaux par groupe et que les souris ne sont pas utilisées au-delà de quinze semaines pour que leur masse n'exige pas de doses d'anticorps plus fortes.
Objectifs
Identifier les sous-classes d’immunoglobulines humaines et leurs récepteurs humains responsables de la déplétion des globules rouges dans un modèle murin d’anémie autoimmune. Dans ce modèle, les souris sont injectées par des autoanticorps anti-globules rouges de différentes sous-classes d’immunoglobulines de manière répétée. Si une anémie est avérée, des souris sont injectées avec des anticorps antagonistes d’un récepteur pour certains anticorps pour identifier le récepteur responsable.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer le rôle des sous-classes d’anticorps et de récepteurs d’anticorps, dans l’anémie autoimmune afin de mieux en comprendre la physiopathologie et, à terme, pouvoir proposer des nouvelles approches thérapeutiques, ciblant les récepteurs d’anticorps par exemple.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : Procédure 1 : 7 prélèvements sanguins, durée : quelques secondes, fréquence : une première fois, puis 10 jours plus tard tous les jours pendant 6 jours. Procédure 2 : 6 prélèvements sanguins, durée : quelques secondes, fréquence : une première fois, puis 11 jours plus tard tous les jours pendant 5 jours. Procédure 3 : une implantation d’une pompe osmotique en sous-cutané et 11 prélèvements sanguins, durée : environ 5-7 minutes, fréquence : une première fois, puis 11 jours plus tard tous les jours pendant 5 jours, une pause de 2 jours puis tous les jours pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Du fait de l’anémie on peut observer au niveau macroscopique le blanchiment des extrémités des pattes, peu ou pas de mouvement, peu ou pas de réaction quand la souris est attrapée. En revanche on n’observe pas de perte de poids ni de signe de détresse. En cas de froideur des pattes un enrichissement en coton, igloo, gel hydrique, chauffage de la cage avec des chaufferettes est prévu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires de l’anémie autoimmune sont difficiles, voire impossible, à étudier chez l’homme, vu la rareté et la localisation des cellules impliquées (macrophages de la rate et du foie). Se déployant dans la rate et le foie dont les fonctions, la structure et la vascularisation sont uniques, les pathologies et les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.
Réduction
Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.
Raffinement
Ce modèle d’anémie n’induit pas d’effets indésirables ni nuisances remarquables. Du fait de l’anémie on peut observer au niveau macroscopique le blanchiment des extrémités des pattes, peu ou pas de mouvement, peu ou pas de réaction quand la souris est attrapée. En revanche on n’observe pas de perte de poids ni de signe de détresse. Aucune augmentation du volume de la rate ou du foie n’est rapportée dans la littérature avec notre modèle d’induction d’anémie. Celui-ci est basé sur la capacité des auto-anticorps à interagir avec certains récepteurs, qui induisent la phagocytose des globules rouges. Dans notre modèle il n’y a pas d’accumulation ni de séquestration de globules rouges dans le foie ou la rate, qui sont les conséquences d’un autre mécanisme de déplétion des globules rouges, liés à certains anticorps qui agglutinent les globules rouges entre eux. Les manipulations d’animaux sont restreintes aux injections intraveineuses, et aux prélèvements sanguins, afin de minimiser le stress des animaux durant les 8 à 15 jours de la durée de l’expérience. L’implantation sous-cutanée entre les omoplates d’une pompe osmotique sera réalisée sou anesthésie et analgésie. Dès l’apparition d’un signe clinique indiquant que les souris ont froid, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes. La pose de dietgel dans la cage est également prévue si nécessaire. Les animaux seront mis à mort si la perte de globules rouges dépasse 70% et que des symptômes comme le blanchissement de l’extrémité des pattes, le manque de mouvement dans la cage, le manque de réaction lors de sa saisie sont visibles.
Choix des espèces
L’anémie autoimmune est une réaction qui se déploie par destruction des globules rouges dans la rate et le foie, la pathologie et les thérapies étudiées ici, ne peuvent pas encore être modélisées pertinemment et donc remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 8 et 15 semaines). Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.
Rôle du facteur de transcription Foxk1 dans le mécanisme de tolérance périphérique exercée par les lymphocytes T régulateurs
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées au tamoxifène deux fois par semaine pendant trente jours puis injectées par voie intraveineuse de lymphocytes T modifiés, 805 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère et sont toutes tuées pour analyser leurs organes lymphoïdes. Une partie développe des signes d'auto-immunité, perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité avec ses congénères. L'objectif déclaré est de savoir si l'absence d'un facteur de transcription rompt la tolérance immunitaire et déclenche une auto-immunité. Le porteur cale sa surveillance sur un taux de survie de 10 % à cinquante jours observé dans un modèle voisin, annonce qu'il tuera les souris avant la phase très sévère de la maladie, et écrit qu'il limitera leurs douleurs dans la mesure où celles-ci n'affectent pas les mesures qu'il veut réaliser.
Objectifs
La réponse immunitaire adaptative dépend fortement de l'immunité médiée par les lymphocytes T. Les cellules T conventionnelles (Tconv), peuvent reconnaître le non-soi et éliminer les cellules infectées et les cellules cancéreuses. La sélection thymique garantit que les lymphocytes T qui atteignent les organes lymphoïdes secondaires reconnaissent les pathogènes mais sont tolérés vis-à-vis du soi. Cependant, même si plus de 95 % des lymphocytes T sont supprimés dans le thymus au cours de la maturation, la tolérance centrale reste un processus imparfait, principalement en raison de l'expression incomplète, dans le thymus, de l'ensemble des antigènes du soi. C'est pourquoi il existe des mécanismes de tolérance périphérique, notamment des cellules T régulatrices (Treg), un sous-ensemble de cellules CD4+ exprimant le facteur de transcription FOXP3 qui peut supprimer l'activation des cellules T auto-réactives en périphérie. La tolérance est un processus essentiel à l'équilibre immunitaire normal et, lorsqu'elle est rompue, l'auto-immunité peut se développer. Le facteur de transcription appelé Foxk1 a été identifié comme un acteur clé de la régulation des cellules T, et possiblement des cellules Treg. Dans ce cadre, Le projet vise donc à caractériser le rôle d'un nouveau facteur de transcription dans les cellules Treg, et à déterminer si son absence induit une rupture de tolérance et conduit à de l’auto-immunité.
Bénéfices attendus
Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immunologie est d'identifier les points de contrôle et les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour contrôler les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses auto-immunes. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur un nouveau facteur de transcription. Celui-ci constitue un candidat prometteur qui, en contrôlant le métabolisme des cellules T régulatrices pourrait donc faire l'objet d'une intervention pharmaceutique visant à réduire les dommages de pathologies auto-immunes. Par ailleurs et au-delà de ce facteur de transcription, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T auto-réactives.
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront traités au Tamoxifene par gavage (deux fois par semaine pendant 30 jours. temps de procédure: quelques minutes pour chaque souris) ou par l’utilisation de croquettes dédiées. La période d’administration s’étalera sur 50 jours. Des cellules T modifiées seront injectées par voie intraveineuse (1 seule injetion, temps de procedure: quelques secondes) sur souris anesthésiées par anesthésie gazeuse afin de déterminer leur effet in vivo. Une seule injection sera effectuée par souris, la procédure ne durera que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Du fait des protocoles envisagés, des nuisances sont attendues sur les animaux. Certains lots d’animaux pourront développer des signes d’auto-immunité, conduisant à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'analyser l’impact de la délétion du gène Foxk1, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l'étude, nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un auto-immun. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.
Réduction
Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de maximum 6 animaux, analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données fiables. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. Nous évaluerons la survie des souris en nous basant sur un taux de survie de 10% à 50 jours observé dans un modèle similaire de maladie auto-immune (Shi et al, 2019 ; Zhenh et al 2013).Tout au long de ces 50 jours (voir également fichier Annexe 1, les souris seront évaluées tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 30 jours suivants ; Le poids, la posture, l’aspect de la peau, l’activité d’exploration et la mobilité, l’aspect du pelage et le comportement avec ses congénères seront évalués. Le score cumulatif obtenu permettra de définir des points limites précoces. En fonction du score, l’animal pourra être isolé, son environnement sera enrichi (nourriture en gel sur la litière, dome/maison) et des analgésiques/antalgiques (Acétaminophène) pourront lui être administrés afin de réduire la douleur jusqu’à sa mise à mort. Nous mettrons donc en place des actions pour limiter les douleurs de l’animal dans la mesure où celles-ci n’impactent pas les mesures expérimentales que nous voulons réaliser (ex : perte de poids, peau irritée, etc..). Pour un score > ou = 5 au cours de 2 observations successives (soit sur 4 jours), l’animal sera euthanasié est décompté comme succombant à la maladie. Les animaux survivants seront euthanasiés à l’issue des 50 jours. Dans la plupart de nos expériences outre la courbe de survie, nous suivrons nos animaux suivant la même grille de score tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 10 jours suivants et mettrons à mort nos souris avant la phase très sévère de la maladie dans les 30-40 premiers jours théoriques du développement de la maladie. Les souris seront également mises sous anesthésie gazeuse lors des procédures de transfert adoptif.
Choix des espèces
Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées les animaux adultes seront utilisés à 8 semaines.
Production d’anticorps induits contre les peptides partageant des séquences identiques entre EBV et SARS-CoV-2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections sous anesthésie et subissent trois prélèvements de sang, le porteur signalant qu'elles peuvent développer des ulcérations de la peau ou du muscle au point d'injection, ainsi que des décolorations de l'œil et des lésions de la cornée avant la prise de sang. Leur sang doit fournir des anticorps dirigés contre des fragments de protéines communs au virus d'Epstein-Barr et au SARS-CoV-2, anticorps qui serviront ensuite d'outils de laboratoire. Le porteur indique que ces anticorps ne peuvent être produits qu'à partir d'animaux vivants, et justifie la mise à mort par le fait qu'il ignore leurs effets sur l'organisme des souris et le risque de souffrance supplémentaire.
Objectifs
L'objectif de ce projet repose sur la production d'anticorps contre des séquences spécifiques de virus humains tels que Epstein-Barr (virus de l’herpès) et le SARS-CoV-2 (COVID-19). Ces anticorps sont un outil important pour étudier les maladies auto-immunes causées par ces virus.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra aux chercheurs de mieux connaître les effets du SARS-CoV-2 et de l'infection par le virus d'Epstein-Barr sur l'homme et leur relation avec le développement de maladies du système immunitaires, les maladies auto-immunes
Procédures
Trois injections sont réalisées sur animal anesthésié. Trois prélèvements sanguins sont effectués sur animal vigile. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2-5 minutes/souris
Impact sur les animaux
Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle après l'injection, ainsi que des décolorations de l'œil et des lésions cornéennes avant le prélèvement de sang.
Devenir
Une fois l'immunisation terminée et le sang recueilli pour l'extraction des anticorps, les animaux ne pourront plus être utilisés à d'autres fins. À ce jour, nous ne connaissons pas encore les effets possibles de ces anticorps sur l'organisme ni s'ils pourront induire des altérations du système immunitaire susceptibles de provoquer des maladies chez la souris et donc d'entraîner une souffrance supplémentaire.
Remplacement
Notre récente étude a déjà identifié un groupe de peptides présents dans le protéome humain et partageant des séquences avec les virus Epstein-Barr et SARS-CoV-2. L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme vivant complexe. Cela nécessite d’induire des anticorps contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez -ou à partir- d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin de la procédure.
Réduction
Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre nos travaux.
Raffinement
À leur arrivée dans l'établissement, les animaux seront répartis en groupes sociaux dans des cages contenant l'enrichissement approprié (matériel de nidification, tubes, bâton à ronger). Ils y resteront pendant 2 semaines pour favoriser un bon acclimatement. L'injection et le prélèvement de sang seront effectués sous anesthésie gazeuse. Une solution saline sera injectée pour prévenir la déshydratation, et une goutte d'anesthésique sera appliquée sur l'œil. En cas de douleur musculaire, un analgésique sera administré. Nous avons défini les points limites pour déterminer le degré de souffrance que l'animal peut rencontrer après la procédure, incluant : perte de poids, lésions cutanées, température, expressions faciales et lésions oculaires.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leur système physiologique mime les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire des anticorps comme outils. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront incluses. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.
Evaluation de l’efficacité de lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique dirigée contre une toxine végétale en vue de sa mise sur le marché
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Toutes tuées à l'issue, sans réutilisation possible parce que leur corps contient la toxine, 2 500 souris vont être intoxiquées par une toxine végétale classée parmi les agents de bioterrorisme aux États-Unis. 2 100 sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 400 à un niveau sévère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection de toxine puis d'anticorps, avec deux prélèvements de sang, les effets attendus allant de la perte de poids et de la mobilité réduite aux difficultés respiratoires et aux douleurs liées à la destruction des tissus, jusqu'à la mort. Aucun anti-inflammatoire n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la survie et l'effet des molécules testées, et le même projet revendique comme second objectif de démontrer la corrélation avec une technique in vitro afin de remplacer "dès que possible" ce test sur les souris.
Objectifs
La toxine d’origine végétale, cible de ce projet, est classée dans la liste des agents bioterroristes des CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) aux Etats-Unis. Sa disponibilité dans la nature et sa facilité d’extraction font de cette toxine une arme de bioterrorisme, et de nombreuses tentatives ayant pour objectifs son utilisation à des fins malveillantes ont été répertoriées notamment en France à Paris en 2018 ainsi qu’en Allemagne à Cologne en 2023. A ce jour, aucun traitement n’est disponible commercialement. Une contre-mesure médicale a été développée et il est maintenant nécessaire d’utiliser un test de contrôle de qualité pour garantir que chaque lot de produit pharmaceutique fini possède les caractéristiques d’efficacité revendiquées. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Contrôler l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques administrés à la dose cible dans un modèle in vivo, à la suite d’une intoxication avec la toxine végétale. Ce premier objectif va permettre le contrôle qualité de l’efficacité et donc la libération de lots de produits pharmaceutiques selon les exigences réglementaires. 2) Le deuxième objectif est de répondre à la demande globale de remplacement des techniques de contrôle de qualité de l’efficacité in vivo (seule technique pertinente aujourd’hui pour la toxine) par une technique in vitro. Il est indispensable, pour sa recevabilité réglementaire, de démontrer que la technique in vitro est fortement corrélée avec la technique in vivo pour le contrôle de l’efficacité thérapeutique des lots de produit pharmaceutique. Le prérequis de cette démarche de remplacement est donc de disposer d’un nombre de données vivo/vitro suffisantes pour démontrer la corrélation des techniques nécessaire au dépôt du dossier d’enregistrement.
Bénéfices attendus
L’objectif premier du projet est de contrôler l’efficacité de différents lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique en utilisant un modèle murin d’intoxication par une toxine végétale. Dans le contexte de la classification de cette toxine végétale comme agent de bioterrorisme et l’absence de traitement, le bénéfice attendu est la mise sur le marché d’un traitement contre les intoxications à cette toxine. Cette technique in vivo d’intoxication dans le modèle murin, seule technique fiable pour contrôler l’efficacité d’une molécule thérapeutique contre cette toxine, va permettre de répondre aux requis réglementaires de contrôle de l’efficacité du produit pharmaceutique dans le cadre de l’enregistrement de cette molécule thérapeutique et sa mise sur le marché. De plus, elle permettra la libération des lots de produits pharmaceutiques de cette molécule thérapeutique au cours des années. Le second objectif du projet est de démontrer la corrélation des techniques vivo/vitro pour la mesure de l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques. Le bénéfice attendu de cet objectif est de pouvoir remplacer, dès que possible, la technique in vivo par une technique in vitro. Plusieurs techniques sont en cours d’évaluation et les mesures obtenues in vitro seront comparées, pour les mêmes échantillons, aux données obtenues par le modèle de référence in vivo. Si l’une des techniques in vitro démontre une corrélation suffisamment robuste avec les données de la technique in vivo, et si ce niveau de corrélation est accepté par les autorités réglementaires, elle sera alors utilisée en remplacement de la technique in vivo.
Procédures
Des prélèvements de sang et des injections (intoxication à la toxine et administration des anticorps) seront réalisés sur les animaux. Ces manipulations pouvant entrainer des perturbations du bien-être animal, elles seront réalisées sur des animaux anesthésiées. Les prélèvements sanguins seront au nombre de deux et seront réalisés rapidement (30 à 60 secondes). Le volume prélevé sera adapté au poids de l’animal et toujours réalisé sur animaux anesthésiés. L’intoxication et l’administration des anticorps ne sera réalisé qu’une seule fois et ce fera de manière rapide (30 à 60 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables (douleur et stress) liés aux gestes associés à la procédure (injections et/ou prélèvements) seront limités car réalisés sous anesthésie générale. Les effets indésirables associés à l’intoxication sont une perte de poids, une mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs associées aux destructions tissulaires en lien avec les effets de la toxine pouvant entraîner la mort de l’animal. Ces effets indésirables sont pris en compte dans la définition des points limites. L’objectif premier de ce projet étant le contrôle qualité d’une contre-mesure médicale, à priori efficace. La majorité des souris seront traitées avec cette contre-mesure, limitant les effets de l’administration de la toxine.
Devenir
A la fin de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Les animaux ne peuvent être réutilisés dans une autre procédure étant donné la présence de la toxine.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% l’efficacité des molécules thérapeutiques lors de l’intoxication par cette toxine végétale. En effet, il existe des disparités entre les résultats obtenus par les méthodes actuelles in vitro et ceux obtenus in vivo. Nous avons ainsi pu observer qu’une molécule apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des molécules thérapeutiques contre cette toxine peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. A ce jour, il est donc nécessaire de passer par des modèles plus complexes pour contrôler l’efficacité de lots de produit pharmaceutique, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. Le deuxième objectif de ce projet est de démontrer la corrélation entre la technique de contrôle de l’efficacité in vivo et de nouvelles techniques in vitro. Si la corrélation est suffisante aux requis réglementaires, la technique in vivo sera remplacée par une technique in vitro pour le contrôle de l’efficacité des lots de produit pharmaceutique.
Réduction
Objectif 1 : Le nombre d’animaux utilisés pour contrôler chaque lot de produit pharmaceutique doit correspondre au nombre permettant de conclure que l’échantillon contrôlé a bien une efficacité supérieure à la spécification et différente du groupe placébo. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour comparer les taux de survie obtenus lors d’un test in vivo à la spécification d’efficacité du produit avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 2 : Le nombre d’animaux utilisés pour démontrer la corrélation entre les techniques vivo/vitro doit correspondre au nombre permettant de s’assurer que la technique in vitro est fiable et robuste pour contrôler l’efficacité des lots de produit pharmaceutique. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour réaliser les analyses de corrélations entre les techniques vivo/vitro avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 1 & 2 : Les groupes placébo seront mutualisés. Un seul groupe placébo sera utilisé pour chaque phase expérimentale incluant des groupes répondant à l’objectif 1 (avec plusieurs lots de produit pharmaceutique) et des groupes répondant à l’objectif 2 (avec plusieurs lots de corrélation).
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une hutte en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés quotidiennement durant toute la durée des essais, et lors de l’ensemble des procédures par du personnel qualifié. L’ensemble des procédures sera réalisé sur animaux anesthésiés. Les points limites déterminés pour ces essais (notamment les signes cliniques) nous serviront à nous assurer du bien-être des animaux, et nous permettront d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec la toxine, des aliments hydratés seront ajoutés dans la cage pour éviter la déshydratation des animaux. L’utilisation d’anti-inflammatoires est impossible, du fait de leurs effets potentiels sur la survie et sur l’effet thérapeutique des molécules testées.
Choix des espèces
Le modèle murin est majoritairement utilisé et a été amplement validé pour l’évaluation d’activité de différentes contre-mesures médicales contre ricinecette toxine. Les souris utilisées sont adultes car elles possèdent à cet âge-là un système immunitaire mature. La facilité d’élevage et de manipulation des souris font de ces animaux un modèle adéquat pour faire ces essais. Par ailleurs, la petite taille des souris fait utiliser une dose de toxine qui est très inférieure à la dose toxique chez l’homme, ce qui constitue un facteur de sécurité pour les opérateurs qui manipulent la toxine.
Observation des conséquences de mutations de facteur de réparation de l’ADN chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
206 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de l'extrémité de la queue vers six à huit jours de vie pour le génotypage, puis un tatouage à l'encre. Le porteur crée deux lignées portant des mutations de facteurs de réparation de l'ADN, prévoit une létalité embryonnaire, et annonce des résultats susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques pour les patients dont le génome est instable. Si un phénotype dommageable apparaît avant le sevrage, les souris sont tuées immédiatement pour que leur système hématopoïétique soit analysé.
Objectifs
Des mutations dans des génes impliqués dans la stabilité du génome peuvent causer des défauts hématopoïétiques. Afin de déterminer quelles sont les conséquences de ces mutations in vivo, 2 modèles de souris portant ces mutations seront produits. Ces modèles permettront de déterminer les conséquences fonctionnelles de ces mutations en se focalisant sur le système hématopoïétique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients présentant une instabilité du génome.
Procédures
Biopsie de la queue réalisée vers 6-8 jours de vie en vue du génotypage (une biopsie par animal). Une biopsie correspond à un prélèvement de l'extrémité de la queue par animal qui dure quelques secondes. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation.
Impact sur les animaux
Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défauthématopoïétique. Stress associé à la biopsie nécessaire pour le génotypage ainsi que le tatouage (marquage à l'encre). De plus, une létalité embryonnaire pourrait être observée.
Devenir
A la fin de chaque procédure les souris seront mis à mort selon la méthode règlementaire utilisée en fonction de l’âge des souris
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement des cellules du sang qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. En effet, le développement des cellules sanguines des mammifères et leurs rôles sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN sera en grande partie réalisée dans des lignées cellulaires des différentes lignées de souris ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.
Réduction
En se basant sur des tests statistiques, nous réduiront au maximum le nombre de souris utilisées pour obtenir les résultats escomptés. Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des lignées cellulaires obtenues de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les souris seront observées de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des souris dans une zone sans pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes et ainsi éviter un caractère dommageable. La mise à mort de la souris sera réalisée selon la méthode réglementaire en fonction de l'âge en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites observés lors du scoring hebdomadaire.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement des cellules sanguines, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les souris et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (au stade embryonnaire (E13) ainsi qu'après la naissance) sera déterminé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système hématopïétique sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel). Si un phénotype dommageable est observé avant cette période, les souris seront immédiatement mise à mort et leur système hémaopoïétique sera analysé.
Maintien et élevage de lignées de souris dans le cadre de l’étude de la réponse immune B et des lymphoproliférations
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 044 souris seront tuées pour n'avoir pas hérité de la bonne modification génétique. Elles font partie des 3 480 animaux que ce projet d'élevage prévoit de faire naître en cinq ans, à raison de trois accouplements par an pour chacune de vingt-neuf lignées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit au sevrage un prélèvement du bout de la queue ou une prise de sang sous anesthésie pour son génotypage, les 2 436 qui portent le bon génotype retournant à l'élevage en attente d'expériences ultérieures. Le porteur décrit la souris comme un modèle "incontournable" pour l'étude des lymphomes B et affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable", le mélange cellulaire en cause n'étant pas reproductible en culture.
Objectifs
Notre laboratoire étudie la réponse immunitaire normale et pathalogique des cellules spécifiques appelées Lymphocytes B avec différents objectifs: • fondamentaux : mécanismes moléculaires régulant la production des anticorps / étude du remodelage génétique / biologie de la transformation tumorale des cellules et devellopement de cancers / physiologie du lymphocyte B normal… • appliqués à des questions de médecine expérimentale : réalisation de modèles mécanistiques d’étude des pathologies de l’immunité / participation à des travaux de recherche clinique / mise en place de nouveaux outils diagnostiques pour les lymphomes ; • finalisés : approches visant notamment à l’amélioration du diagnostic ou du traitement de pathologies tumorales ou immunitaires / développements technologiques autour des méthodes de détection des cellules immunitaires… Toutes ces études nécessitent l'utilisation de différents modèles murins dont le maintien, l'élevage et le génotypage sont décrits ici. Dans les conditions de maintien des lignées (élevage), le phénotype tumoral ne s'exprime pas. Les différentes techniques de génotypage décrites sont : soit par PCR (amplification en chaîne par polymérase) via une biopsie de la queue de la souris qui permet de mettre en évidence la modification génétique sur l'ADN de l'animal ou par ELISA (technique d'immunoadsorption par enzyme liée) via un prélèvement de sang qui permet de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de maintenir différentes lignées de souris génétiquement modifiées permettant ainsi aux chercheurs de l'unité d'avoir différents modèles d'étude pour mener à bien leur projet de recherche. Les modèles murins génétiquement modifié permettent d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme possèdant un système immunitaire physiologique complet. La modification spécifique d'un géne cible permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de nombreuses maladies en lien avec le dysfonctionnement du système immunitaire et particulièrement les lymphomes ou les maladies de depôts.
Procédures
Les animaux subiront au moment du sevrage un prélèvement de bout de queue ou de sang après anesthésie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de bout de queue sous anesthésie entraine une douleur de courte durée aprés le reveil de l'animal. Le prélèvement de sang sous anesthésie induit une douleur de courte durée chez l'animal au reveil. Les animaux immunodéprimés sont maintenus dans des conditions particulières afin que leur phénotype dommageable ne s'exprime pas et qu'ils ne soient pas en contact avec des pathogènes.
Devenir
Pour les 5 ans à venir, 3 accouplements seront lancés chaque année pour renouveller le stock d'animaux avec en moyenne 8 petits par portée soit au total 3 accouplements x 29 lignées x 8 petits x 5 ans = 3480 animaux. Sur la totalité des animaux, 70% auront le bon génotypes et seront replacés dans l'elevage soit 2436 aniamux. Les 30% n'ayant pas le bon génotype seront euthanasiés, soit 1044 animaux.
Remplacement
La réponse immune B et le développement des maladies lymphoprolifératives sont étroitement liés à la présence et à l'interaction de populations cellulaires et d’un microenvironnement adapté (cellules stromales de différents types, facteurs de croissance, chimiokines…). Ce mélange complexe n’est pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux vivants est indispensable pour pouvoir étudier ces mécanismes.
Réduction
Notre laboratoire possède une grande expérience dans l’élevage des lignées murines destinées à la recherche ce qui permet d’anticiper le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires au maintien de chaque lignée ainsi que le nombre de portées nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’animaux pour effectuer les diverses expériences. Ce projet comprend un grand nombre d'animaux car il décrit l'ensemble des lignées de souris élevées par notre laboratoire pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux produits est réduit au minimum afin d'être suffisant pour maintenir la lignée et effectuer les expérimentations ultérieures tout en évitant de produire des animaux inutilement.
Raffinement
L’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux : les prélèvements de sang et de tissus seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé et tout animal présentant des signes de souffrance sera immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
Il existe une très forte homologie de structure et fonction entre les locus IgH humain et murins faisant de la souris un modèle expérimental incontournable pour l'étude des disfonctionnements oncogéniques aboutissant à la genèse des lymphomes B et pour le developpement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La souris est également l'espèce de référence internationale pour l'étude des lymphomes. La réponse immune B et le développement des maladies lymphoprolifératives sont étroitement liés à la présence et à l'interaction de populations cellulaires et d’un microenvironnement adapté (cellules stromales de différents types, facteurs de croissance…). Ce mélange complexe n’est pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux vivants est indispensable pour pouvoir étudier ces mécanismes. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel mâles et femelles sont sexuellement matures et jusqu’à l’âge de 20 semaines car les animaux plus âgés (en particulier les femelles) commencent à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 4 semaines.
Amélioration de l’humanisation chez des rats immunodéficients humanisés
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rendus immunodéficients par construction, puis greffés de cellules souches et d'un fragment de thymus humains, 120 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La greffe de thymus est placée sous la peau ou sous la capsule rénale, suivie d'injections d'anticorps dans le ventre aux jours 0, 7 et 14, puis de prélèvements de sang derrière l'œil aux semaines 12, 18 et 24. Le porteur mentionne parmi les atteintes possibles la séparation de la mère, le risque qu'elle rejette ses petits, et une réaction du greffon contre l'hôte, sans en décrire les manifestations. Tous sont tués à l'issue pour prélever sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus.
Objectifs
A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Afin de pouvoir répondre à ce type de problèmatique, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire en mimant de manière plus spécifique la physiologie humaine. Et cela tous en permettant d'extrapoler les effets qu'ils pourront avoir avec d'avantage de sécurité. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Ce projet expose donc la procédure visant à améliorer l'humanisation de rats immunodéficients qui recevront une greffe de cellules souches et une greffe de thymus.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation dans les rats humanisés par une greffe de cellules souches et une greffe de thymus. Ces animaux pourront montrer un système immunitaire semblable au système immunitaire humain.
Procédures
Les différentes interventions sur les animaux sont : l'injection de cellules souches, la greffe de thymus soit en sous-cutanée soit sous la capsule rénale (durée entre 10-20 min). Les injections d'anticorps LoCD2b en intra-péritonéale à J0, J7 et J14. Ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil). Toutes ces procédures expérimentales sont maitrisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendues sont : le stress dû à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales (placement biopsie thymique en sous cutanée ou sous la capsule rénale, l'injection en ip, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux, GVHD...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude grâce à une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.
Devenir
A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux afin de pouvoir documenter l'effet des différents traitements étudiés sur le système immunitaire.
Remplacement
Il n'est à l'heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et d'étudier l'effet sur celui-ci d'anticorps et/ou médicament. Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Le rat ayant un système immunitaire humain constituera donc un modèle scientifiquement robuste et fiable pour reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entres les groupes.
Raffinement
Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter le stress du à l'expérimentation. Les rats seront hébergées en cages ventilées par groupe de 2 à 5 individus dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). La nourriture et l'eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Par ailleurs, nous maitrisons les gestes expérimentaux. L'état de santé des animaux seront surveillés par une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.
Choix des espèces
Le choix du rat repose sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris. Les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés.
Régulation de la réponse de la microglie aux cytokines et de la clairance des dépôts amyloïdes et des agrégats de tau par le remodelage des glycanes sulfatés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Environ 80 % des souris porteuses du gène Tau sont mortes à l'âge de 12 mois, et leur faiblesse des pattes évolue vers une paralysie entre 7 et 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. 2300 souris, dont des souris porteuses des gènes hAPP ou Tau liés à la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : toutes ont le bout de la queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, et 366 sont destinées aux expériences sur cinq ans. Chez les petits de femelles porteuses du gène hAPP, la mortalité atteint environ 15 % sur les six premiers mois. Le porteur écrit pourtant que les lignées utilisées "ne présentent aucun problème physique ou physiologique". Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, après anesthésie et analgésie, sans que le texte précise le rôle des souris génotypées au-delà des 366 destinées aux expériences.
Objectifs
Le projet de recherche vise à comprendre comment les molécules cérébrales appelées glycanes sulfatés régulent l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer par les cellules immunitaires du cerveau dans des modèles de souris. Nous étudierons si un modèle de souris dont le gène d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés est augmenté ou un modèle de souris dont le gène d'une enzyme générant des glycanes sulfatés n'est pas fonctionnel dans les cellules immunitaires du cerveau, serait bénéfique pour l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer in vivo. Des études animales sont nécessaires pour examiner ces possibilités de limiter la progression de la maladie par l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés ou par l'élimination d'une enzyme génératrice ou d'une molécule de protéine présentatrice dans de cerveau de modèles murins de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
La modification des glycanes sulfatés dans les cellules immunitaires du cerveau in vivo aura un impact sur la recherche en matière de neuroinflammation et de neurodégénérescence. L'analyse des rôles régulateurs des glycanes sulfatés nous permettra de comprendre en détails les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules immunitaires cérébrales éliminent les substances responsables dans le cerveau de la maladie d'Alzheimer. Notre analyse des cellules immunitaires du cerveau in vitro est applicable au criblage de composés chimiques susceptibles de potentialiser le traitement thérapeutique des patients affectés par la neurodégénérescence. Les résultats du profilage de l'expression des gènes et de la mise en évidence d'une expression génétique altérée permettraient de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques impliquées dans la cause de la maladie d'Alzheimer. Nos données déjà obtenues montrent que l'augmentation d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés améliore l'élimination des maladies cérébrales responsables de la maladie in vitro, indiquant la faisabilité du projet proposé et ouvrant la voie à de nouvelles approches pour contrôler les causes de la maladie d'Alzheimer. Les concepts innovants concernant la modification des glycanes sulfatés dans le cerveau seront étendus à un autre modèle murin de la maladie d'Alzheimer appelé tauopathie. Dans l'ensemble, notre objectif ultime est de développer une nouvelle stratégie de traitement de la maladie d'Alzheimer, afin de contribuer à l'amélioration de la santé et du bien-être, ainsi qu'au bien-être social et économique. Il s'inscrit dans la priorité nationale « Plan maladies neurodégénératives ».
Procédures
Le bout de la queue (
Impact sur les animaux
Les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer, que nous utiliserons dans ce projet, présentent des déficits de la mémoire spatiale et de l'apprentissage. Les petits nés de femelles porteuses du gène responsable de la maladie, appelé hAPP, ont un taux de mortalité d'environ 15 % au cours des six premiers mois de leur vie. Environ 80 % des souris porteuses d'un autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, meurent à l'âge de 12 mois, avec la survie médiane d'environ 9 mois. Elles présentent une rétraction des pattes lorsqu'elles sont soulevées par la queue, suivie d'une faiblesse des pattes. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie à l'âge de 7 à 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. Une légère diminution du poids est observée à l'âge de 11 mois. La coupe de la queue pour le génotypage entrainent une douleur légère de courte durée. Les souris seront mises à mort après anesthésie et analgésie.
Devenir
Pendant la durée de la procédure, les animaux sont maintenus en vie. Puis, à la fin du protocole, toutes les souris sont euthanasiées selon la procédure.
Remplacement
Des lignées de cellules immunitaires cérébrales de souris immortalisées et des essais biochimiques et biologiques seront utilisés en parallèle dans le laboratoire. Les objectifs du projet proposé sont d'étudier les effets bénéfiques d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés sur les fonctions des cellules immunitaires cérébrales et d'examiner si l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés pourrait réduire la masse des matériaux responsables de la maladie dans le cerveau des souris modèles de la maladie d'Alzheimer in vivo en facilitant l'activité soutenue des cellules immunitaires cérébrales au fil du temps. Dans cette phase, l'utilisation d'animaux est essentielle.
Réduction
Le nombre de souris est réduit en utilisant chaque hémi-cerveau pour deux expériences différentes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable. Ce plan expérimental a déjà été publié dans la littérature ce qui permet de réduire au minimum statistique le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de cinq dans un milieu enrichi (un bâton, un tunnel ou dôme ou papier craft) dans des cages de taille suffisante et avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera surveillé tous les jours. Les différentes lignées utilisées dans nos procédures ne présentent aucun problème physique ou physiologique. L’ensemble des expérimentations est mené par du personnel qualifié et formé afin d’éviter tout stress ou inconfort de l’animal avec une attention particulière sur la gestion de la douleur. Nous serons attentifs à observer si les animaux souffrent ou présentent un comportement anormal en lien avec le responsable du bien-être animal en observant les paramètres cliniques suivants Les points limites : -Perte de poids rapide 15 à 20% en quelque jours, longue période de perte de poids -Poil hérissé, dos rond, abdomen distendu ou léthargie -Diarrhée -Toux, râles, respiration pénible, écoulements nasaux -Signes d’atteinte du Système nerveux central -Tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté Ce suivi sera réalisé en lien avec le responsable du bien-être animal. Les animaux présentant un de ces critères seront mises à mort.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement utilisé pour les études sur la maladie d'Alzheimer. Les modèles murins de la maladie d'Alzheimer sont largement utilisés pour les études de recherche fondamentale. De plus, de nombreux outils sont disponibles chez la souris (anticorps, kit et appareil), permettant une exploitation maximale des tissus obtenus. Des souris âgées de 3 mois, 6-9 mois et 15-18 mois seront utilisées. Dans le modèle de souris de la maladie d'Alzheimer, qui surexprime le gène responsable de la maladie, appelé hAPP, les niveaux de matériaux responsables de la maladie dans une région particulière du cerveau, importante pour la mémoire, commencent à augmenter vers l'âge de 6 semaines. Les substances pathogènes deviennent évidentes dans les régions particulières du cerveau nécessaires à la mémoire. Ce phénotype est progressif, avec des pics importants à l'âge de 8-10 mois. Une augmentation significative de l'activation des cellules immunitaires du cerveau a été observée dans ces régions à l'âge de 6-9 mois. Dans le modèle de souris qui exprime l’autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, les matériaux responsables de la maladie qui affectent directement les cellules neuronales et provoquent une perte de mémoire commencent à apparaître vers l'âge de 6 mois. Ces phénotypes ont fait l'objet de nombreuses publications dans le monde entier et ont permis d'accumuler des données utiles pour l'étude de la maladie d'Alzheimer.
Approches thérapeutiques dans une maladie inflammatoire chronique (lupus érythémateux)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes les souris sont tuées avant l'âge de quatorze semaines, avant que le lupus dont elles héritent n'atteigne le stade où il abîme sérieusement leur organisme. 720 souris femelles vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont tatouées sous anesthésie, reçoivent des injections dans le ventre trois fois par semaine pendant deux à quatre semaines ou un gavage quotidien pendant deux semaines, avec des prélèvements de sang à la joue ou dans l'œil et un prélèvement d'urine. Le porteur écrit que "ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus", pour un projet qu'il déclare lui-même en gravité sévère sur l'ensemble des 720 animaux.
Objectifs
Le projet a pour but de tester des approches thérapeutiques spécifiques contre une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (lupus). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques innovantes pour améliorer la prise en charge des patients. Dans ce but, un modèle de souris qui développent spontanément cette maladie sera utilisé et des facteurs responsables de certains paramètres de la maladie seront ciblés. Les patients atteints de lupus développent des anticorps dirigés contre des molécules présentes dans l’organisme (autoanticorps). Ces autoanticorps activent des cellules du système immunitaire, ce qui va induire une inflammation importante dans tout le corps, et notamment au niveau des reins. Nous testerons ici des molécules permettant soit de diminuer la quantité d’anticorps, soit d’empêcher l’augmentation de la production de ces autoanticorps.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du lupus et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cibles thérapeutiques dans le lupus permettra de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’humain. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène mutant dans une lignée de souris) dommageable est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent un lupus lorsqu’elles sont adultes qui ressemble à la maladie observée chez les patients qui se développe également chez des sujets adultes. Toutes les souris seront utilisées (et donc euthanasiées) avant de pouvoir développer une gravité de la maladie altérant leur état général. Tous les animaux seront tatoués sous anesthésie générale (acte durant 2 minutes). Des groupes/lots d’animaux éveillés recevront un traitement thérapeutique différent soit par des injections dans le ventre (15 secondes/injection) 3 fois par semaine sur une durée de 2 ou 4 semaines soit des administrations quotidiennes par voie orale (gavage - 30 secondes/gavage) pendant 2 semaines. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animal anesthésié avant le début des traitements soit au niveau de la joue soit au niveau de l’œil (2-3 minutes par prélèvement) ainsi qu’un prélèvement urinaire (1 à 2 minutes par prélèvement). Certains animaux auront un 2e prélèvement sanguin trois jours après l’administration d’un traitement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux lors des procédures seront de plusieurs catégories : L’anesthésie générale peut induire un inconfort de 2-3 minutes au réveil (étourdissement). Les prélèvements sanguins peuvent induire une démangeaison le temps de la cicatrisation (moins de 24 heures). Un stress passager sera induit lors des contentions nécessaires aux actes. Une légère douleur brève de piqûre sera induite lors des injections intrapéritonéales (15 secondes). Un stress et un inconfort passager (30 secondes) seront induits lors des gavages. Les souris ayant la maladie (le lupus) développent des symptômes inflammatoires au niveau de la peau et des articulations ainsi qu’une insuffisance rénale entre 20 et 30 semaines d’âge qui peuvent modifier leur comportement. Toutes les procédures se terminent quand les souris ont l’âge de 14 semaines soit avant que ces symptômes ne se soient développés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des tissus prélevés (reins, rate, ganglions) afin de déterminer les paramètres inflammatoires dans ces tissus.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de l’efficacité de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivant avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observée que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des sytèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
Le présent projet vise à tester différentes approches thérapeutiques qui ont été identifiées préalablement tant dans des modèles animaux que chez des patients. Cela a permis de réduire le nombre d’hypothèses de travail et donc de diminuer le nombre d’animaux prévus dans le présent projet. Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement et cliniquement (être sûr des effets observés). Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.
Raffinement
Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Le modèle de lupus utilisé induit une maladie pouvant entraîner des douleurs inflammatoires passagères mais qui porte atteinte sérieusement à l’intégrité physique des animaux au-delà de 20 semaines d’âge. Tous les animaux seront utilisés avant d’atteindre l'âge de 15 semaines. Afin de s’assurer du bien-être des animaux et qu’aucun ne développe une atteinte sévère avant la fin des procédures, une grille de score clinique a été établie afin de suivre l’état général des animaux et d’identifier ceux nécessitant une intervention rapide d’interruption des procédures car ils auraient atteint les points limites déterminés. Cet examen clinique des animaux est réalisé trois fois par semaine. Les animaux n’ayant pas un score nul (mais inférieur au point limite) se verront apportés une attention particulière, notamment avec l’apport d’eau et de nourriture humide directement dans la cage afin d’optimiser leurs conditions d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, jamais isolés, toujours avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher) et sont observés quotidiennement.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante dans une pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. La souris est le seul modèle de mammifère pertinent pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les souris du projet seront toutes des femelles adultes comme les patients humains qui sont à 90% des femmes en âge de procréer.
Effet de différents microbiotes sur la physiopathologie de l’infection par Eimeria tenella chez le poulet.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour trouver un moyen de limiter les pertes économiques que la coccidiose fait subir à l'aviculture, plus de 1,5 milliard d'euros par an dans le monde selon le porteur, 60 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue. Quarante subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, vingt un niveau modéré. Chaque animal reçoit deux administrations orales sous contention, l'une d'un microbiote, l'autre du parasite Eimeria tenella. La dose de parasite est calibrée pour rester en dessous du point limite, défini par la perte de poids, les plumes ébouriffées, la prostration, les yeux mi-clos et la diarrhée, et les poulets de chair retenus sont de type conventionnel pour rester au plus près des conditions des élevages industriels.
Objectifs
Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites, Eimeria. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Dans cet objectif, notre ambition est d'utiliser la modulation du microbiote pour atténuer la sévérité de la pathologie liée à l'infection par Eimeria. Comme nous l’avons décrit précédemment, nos résultats mettent en évidence un rôle du microbiote et/ou ses métabolites sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella incluant le développement du parasite E. tenella et sur la réponse inflammatoire associée à l’infection. La nature des bactéries et/ou leur métabolites impliqués dans cet effet restent encore à déterminer. Dans ce projet, nous comparerons des microbiotes présentant une complexité et une diversité plus ou moins forte (microbiote de jeune, d’adulte, enrichi en bactéries probiotiques dès l’éclosion) sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella. Nous évaluerons l'effet de ces différentes compositions microbiennes caecales sur le développement des parasites, la formation de lésions et la réponse inflammatoire. Ensuite, les corrélations entre la composition du microbiote, des métabolites caecaux et des paramètres d'infection seront déterminées pour détecter les taxons et les métabolites qui peuvent être enrichis ou appauvris dans le cas d'infections plus ou moins sévères. Ce projet fournira des indications pour le développement d'un microbiote limitant les conséquences négatives de l'infection.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleures performances zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire. Si la supplémentation du microbiote ne présente pas d’effet, les animaux supplémentés présenteront des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe contrôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux administrations orales : une de microbiote et une du parasite Eimeria. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux. Chaque intervention dure environ 30 secondes à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite, le point limite se définissant par la perte de poids, les plumes ébourriffées, prostration, yeux mi-clos, diarrhées. Une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, l'euthanasie des animaux est prévue pour des prélévements des caeca et mesures de différents paramètres (parasitaire, inflammatoire, microbiote, métabolites)
Remplacement
L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées.
Réduction
Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire et de la littérature portant sur les scores lésionnels lors de supplémentations et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe avec trois groupes pour avoir une différence significative. Ces effectifs sont suffisants pour les analyses microbiotes.
Raffinement
Hébergement : Les poulets disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans les box : petites rondelles en inox suspendues ou du bolduc suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans et des perchoirs qui apporte un enrichissement qui fait partie du comportement naturel). Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Evaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale. Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite, le point limite se définissant par la perte de poids, les plumes ébourriffées, prostration, yeux mi-clos, diarrhées.
Choix des espèces
Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de chair mâles et femelles de type conventionnel seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire exempt d'organismes pathogènes spécifiés. L'éclosion constituant une fenêtre unique pour l'implantation de bactéries et l'amélioration précoce des fonctions intestinales, l'implantation de bactéries pour améliorer précocement les fonctionnalités de l'intestin sera réalisée juste après l’éclosion (1er jour d’âge). Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.