Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Génotypage invasif des lignées transgéniques murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.
Bénéfices attendus
Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.
Devenir
Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.
Réduction
Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.
Génotypage des souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un prélèvement de tissu sous anesthésie gazeuse, de quelques secondes, permet de génotyper les souris transgéniques nées dans l'animalerie. 2 400 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la seule atteinte décrite étant le stress de la manipulation et de la contention. Le projet ne couvre que cette étape d'identification, les expériences elles-mêmes, portant sur des délétions de gènes de l'immunité liées au cancer, faisant l'objet de demandes séparées. Le devenir déclaré ne fait état d'aucun animal gardé vivant, alors que le porteur écrit que ces souris seront utilisées en continu et entreront ensuite dans d'autres protocoles.
Objectifs
Ces dix dernières années, l’immunothérapie s’est développée et a permis la mise en place d’une réponse puissante et durable chez un nombre limité de patients (20% en moyenne). Dans le but d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie des études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes de mise en place la réponse immunitaire anti-tumorale. Les études que nous réalisons au laboratoire utilisent des souris transgéniques possédant des délétions conditionnelles de gènes impliqués dans l’immunité, nous permettant d’étudier ces gènes comme des marqueurs ou des cibles pour améliorer la réponse à l’immunothérapie mais également les connaissances dans le domaine. La demande d’autorisation concerne le génotypage des souris transgéniques générées. L’utilisation de ces souris pour des études fera l’objet de demandes d’autorisation ultérieures.
Bénéfices attendus
Le cancer est aujourd’hui un problème de santé publique majeur et est la seconde cause de mortalité dans le monde. A titre d’exemple, en 2020, 20 millions de personnes ont été diagnostiquées et 10 millions de personnes sont décédées. Au laboratoire, nous travaillons sur des pistes d’améliorations pour augmenter l’efficacité de l’immunothérapie. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus permettrons de mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans une réponse anti-tumorale.
Procédures
Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse (durée : quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.
Devenir
Les animaux de ces colonies seront utilisés en continue. Ils entreront dans d’autres protocoles expérimentaux suite à leur génotypage. Ces protocoles seront soumis au comité d’éthique en amont.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, la tumeur, le système vasculaire... En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux transgéniques. Le décryptage des mécanismes moléculaires sera par la suite réalisé in vitro.
Réduction
La taille des élevages sera adaptée en fonction des nécessités expérimentales, elles-mêmes soumises au comité d’éthique. Les 2 sexes seront utilisés.
Raffinement
Les souris seront élevées dans un milieu enrichi avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. Chaque animal sera examiné 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. La procédure sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux de référence pour les études sur le cancer et l’immunité. De plus, les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée. Les manipulations relatives au génotypage et à l’identification par puce seront réalisées sur des animaux très jeunes (1ère semaine de vie) pour limiter le mal-être.
Caractérisation du rôle d’une voie de la réponse immunitaire et de souches bactériennes du microbiote dans les troubles du comportement chez un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt et un gavages pour 360 souris, sept injections pour 240 autres, 1 200 prélèvements de selles, un rasage du dos et une ponction de la veine submandibulaire : 600 souris sont soumises à ces actes, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage à la canule et un risque d'infection cutanée lié au rasage. Il s'agit d'explorer le rôle de bactéries intestinales et de produits bactériens sur le comportement, chez des souris dont la réponse immunitaire a été altérée par délétion génique. Chaque souris passe une fois chaque test comportemental, pour 145 minutes cumulées d'épreuves sur trois semaines, sans que ces tests soient nommés.
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies manifestées par des symptômes neuro-psychiatriques (Parkinson, dépression, sclérose en plaque). Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans les manifestations comportementales de l’hôte. Des travaux suggèrent que certaines bactéries et des produits bactériens sont responsables de l’apparition de troubles du fonctionnement du système nerveux central . L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes et d’identifier le rôle des bactéries et des produits bactériens dans la régulation du comportement dans un modèle de souris présentant une réponse immunitaire altérée.
Bénéfices attendus
Validation d’un modèle de souris présentant des modifications spécifiques des cellules neuronales sur des récepteurs de l’immunité innée pour l’étude de manifestations neuro-comportementales. Amélioration de la compréhension de l’influence du microbiote sur le comportement de l’hôte sur le comportement. Amélioration de la compréhension de l’impact des voies immunologiques dans les manifestations comportementales.
Procédures
Gavages : 360 souris seront soumises à 21 gavages (quelques secondes) et 240 à 7 injections (quelques secondes) ou au total, correspondant à une intervention par jour selon le protocole. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes par un expérimentateur qualifié. Prélèvement de selles : 2 prélèvements de selles correspondant à un placement dans un pot de récolte pendant 5 minutes maximum pour les 600 animaux, soit 1200 prélèvements. Rasage : les animaux subiront 1 rasage d’identification d’une durée de 10 secondes soit 360 actes de rasages de 10 secondes. Tests de comportement : tous les animaux subiront 1 fois chaque test comportemental dont la durée maximum est de 30 minutes. La durée cumulée d’épreuves comportementale sera de 145 min sur 3 semaines par animal. Prise de sang, durée inférieure à 15 secondes, 1 fois pour chaque animal.
Impact sur les animaux
stress léger induit par le placement dans un pot de récolte pour les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et la pesées des animaux (une fois par semaine). Douleur liée à la piqure et l’injection d’anesthésique et antalgique et des métabolites de l’étude.. Risque de traumatisme de l’œsophage induit par la manipulation de gavage oral à la canule souple pour administration des bactéries de l’étude. stress induit par la mise en conditions expérimentales des tests comportementaux douleurs et stress induit par la contention manuelle et la piqure effectuée par la lancette lors des prélèvements sanguins par ponction de la veine sub mandibulaire : risque de complication cutanée par infection induit par rasage à la tondeuse d’une zone du dos pour l’identification temporaire nécesaire à l’identification pendant l’enregistrement des vidéos.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre de récupérer le sang et les organes à des fins d'analyse scientifique
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer le lien entre l'étât physiologique du microbiote et les processsus cérébraux complexes comme les comportements Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries intestinales, la composition et l’abondance du microbiote intestinal, et des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et comportementales.
Réduction
Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 12 animaux en se basant sur les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres comportementaux.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes permettant des interactions visuelles. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément une fois par semaine au moment de la pesée des animaux. Enfin des points limites adaptés sont définis pour limiter d’éventuelles souffrances.
Choix des espèces
Les animaux auront 6 à 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur le comportement et l’immunologie, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques de comparaison. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné n’existent que dans ce modèle murin.
Identification des antigènes reconnus par les Lymphocytes T gamma delta humains dans la réponse immunitaire contre le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Reçues à six semaines et acclimatées dix jours, 27 souris subissent une injection unique de cellules cibles dans le jarret de la patte arrière, sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La seule atteinte décrite est la douleur brève de la piqûre. Trois souris suffisent, indique le porteur, à produire plus de cent millions de cellules productrices d'anticorps, et il revendique la souris comme "indispensable" faute d'alternative reproduisant la réponse immunitaire d'un "organisme entier". Deux semaines après l'injection, les 27 sont tuées pour prélever leurs tissus.
Objectifs
Lorsqu'une personne reçoit une greffe d'organe, elle doit prendre des médicaments qui affaiblissent son système immunitaire pour éviter que le corps rejette le nouvel organe. Cela la rend plus vulnérable à certaines infections graves, comme celle causée par un virus appelé cytomégalovirus. Cette infection peut sérieusement compliquer la greffe et même mettre en danger la vie du patient. Certains globules blancs, appelés lymphocytes T gamma delta, peuvent aider à combattre ce virus. Notre objectif est de trouver des antigènes que ces globules blancs reconnaissent pour voir si on pourrait développer un vaccin contre ce virus. Pour y parvenir, nous devons produire des anticorps (des protéines qui se lient aux antigènes) qui bloquent la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T gamma delta. Pour fabriquer ces anticorps, nous utilisons des souris. Nous les exposons à des cellules que les lymphocytes T gamma delta reconnaissent, puis nous collectons les anticorps produits par les souris au bout de deux semaines pour les tester.
Bénéfices attendus
Une fois que nous avons trouvé les antigènes du virus , nous pourrons essayer de fabriquer un vaccin pour aider le corps à mieux se défendre contre ce virus chez les personnes qui ont eu une greffe d’organe ou celles à risque, comme les femmes enceintes qui n'ont pas encore été exposées au virus.
Procédures
Les souris sont soumises à une vaccination par injection dans le jarret de la patte postérieure gauche de cellules cibles en solution saline. Les injections se font sur animal vigile à raison d'une seule injection par animal.
Impact sur les animaux
La piqure d'aiguille pour l'injection entraîne une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les souris sont mises à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires.
Remplacement
Nous utilisons des souris pour notre projet car elles sont des modèles très bien étudiés en recherche scientifique. Les souris ont un système immunitaire qui ressemble à celui des humains, ce qui permet de mieux comprendre comment notre propre corps pourrait réagir. Pour ce projet, les souris sont indispensables en raison de l'absence d'alternatives pratiques : bien qu'il existe des méthodes alternatives comme les cultures cellulaires ou les simulations informatiques, elles ne reproduisent pas encore la complexité de la réponse immunitaire d’un organisme entier. Elles ne peuvent pas, à ce stade, remplacer la capacité des souris à produire des anticorps complexes et diversifiés. De plus, l’utilisation de souris pour générer des anticorps est une méthode bien établie depuis de nombreuses années, avec des protocoles clairs et reproductibles. Cela nous donne des résultats fiables et comparables avec les recherches existantes. En résumé, nous employons donc des souris car elles offrent une combinaison unique de caractéristiques qui ne peut pas être reproduite par d'autres moyens disponibles actuellement.
Réduction
Le protocole que nous utilisons est très efficace et ne nécessite que trois souris pour obtenir un grand nombre de cellules immunitaires. Avec ces trois souris, nous obtenons plus de 100 millions de cellules productrices d'anticorps, ce qui nous permet de tester environ 10 000 anticorps différents. Parmi ceux-ci, il est probable que nous trouvions un anticorps spécifique qui cible les cellules que nous étudions. Même si le processus pour identifier les antigènes du virus est long et compliqué, nous n'avons besoin que de neuf souris par an au maximum pour nos expériences.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à l'animalerie dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les expérimentateurs sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.
Choix des espèces
Pour obtenir les anticorps monoclonaux bloquants, il faut passer par une étape d'immunisation d'animaux suffisamment éloignés de l'homme pour générer une réponse immunitaire forte. La souris est l'espèce de choix depuis la publication du protocole de production anticorps monoclonaux en 1975. Les souris sont commandées à l'age de 6 semaines d'un poids supérieur à 20g et elles sont acclimatées à l'animalerie pendant 10j avant le début du protocole. Les animaux jeunes ont une meilleure réponse immunitaire.
Rôle des macrophages dans l’homéostasie du pancréas et au cours du diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux cent soixante-quatre souris échapperont à la mise à mort pour être replacées dans un autre projet, faute de porter la modification génétique voulue, les 576 autres seront tuées, reproductrices comprises. 840 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 324 d'entre elles et modéré pour 516. Tatouées et amputées d'un fragment de queue vers sept jours, elles reçoivent un traitement oral, et une partie subit la destruction des cellules immunitaires de ses pattes arrière suivie d'une greffe qui la laisse quinze jours avec un système immunitaire incomplet, quand d'autres passent douze semaines sous régime gras avec des tests de tolérance au glucose faits à partir d'une incision de la queue. Le porteur calcule ses effectifs sur des groupes de cinq à huit souris, sans expliquer comment il parvient à 840.
Objectifs
Ce projet vise à étudier le rôle des macrophages pancréatiques dans l’homéostasie du pancréas et durant le diabète de type 2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées présentes dans tous les tissus, jouant un rôle crucial dans la défense contre les infections, la résolution de l'inflammation et la régulation de la réponse immunitaire. Ces cellules peuvent être trouvées dans tous les tissus et organes, où elles remplissent des fonctions spécifiques adaptées à leur environnement local. Dans le contexte du pancréas, les macrophages pancréatiques peuvent jouer un rôle crucial dans la régulation de l'inflammation, de la réponse immunitaire et de la fonction des cellules bêta productrices d'insuline. Le diabète de type 2 est une maladie métabolique chronique caractérisée par une résistance à l'insuline et une production insuffisante d'insuline par le pancréas entrainant une hyperglycémie chronique. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, ou facteur de stimulation des colonies 1, une protéine qui permet aux macrophages de survivre, se développer et fonctionner correctement. Le Csf1 est produit par les cellules du micro-environnement des macrophages. Des résultats préliminaires obtenus dans un projet précédent suggèrent une dépendance de certains macrophages pancréatiques à l'égard du Csf1 produit par les fibroblastes, des cellules de soutien du tissu. Comprendre la fonction des macrophages et leur interaction avec d'autres cellules pancréatiques est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le diabète de type 2. Notre projet a 3 objectifs principaux : 1/ Étudier l’impact de la délétion fibroblastique de Csf1 sur les macrophages pancréatiques 2/ Etudier le renouvellement des macrophages au sein du pancréas 3/ Déterminer si les macrophages pancréatiques jouent -un rôle clé au cours de l’évolution du diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Le pancréas, un organe vital du système digestif et endocrinien, joue un rôle crucial dans la régulation du métabolisme glucidique et la production d'insuline. Son dysfonctionnement est intimement lié à des pathologies telles que le diabète de type 2, une maladie métabolique chronique en constante augmentation dans le monde. Comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans le développement du diabète de type 2 est essentiel pour améliorer sa prise en charge. Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels. Tout d'abord, en examinant l'impact de la délétion de Csf1 dans les fibroblastes sur les macrophages pancréatiques et la physiologie du pancréas, nous pourrions identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler la réponse immunitaire dans le pancréas et potentiellement prévenir ou traiter le diabète de type 2. De plus, en étudiant comment les cellules immunitaires appelées macrophages sont recrutées dans le pancréas à l’état physiologique, nous pourrions mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le maintien de l'équilibre immunitaire dans cet organe crucial. En comprenant le rôle des macrophages pancréatiques dans la tolérance au glucose et l'insulinémie à l'état physiologique, nous pourrions développer des approches plus précises pour réguler la glycémie et améliorer la sensibilité à l'insuline. Enfin, en déterminant si les macrophages pancréatiques jouent un rôle crucial dans l'évolution du diabète de type 2, nous pourrions ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement de cette maladie complexe. En somme, ce projet offre un potentiel significatif pour une meilleure compréhension du diabète de type 2 et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1 : En générant les lignées d’intérêt pour cette étude nous obtiendrons des accouplements avec une descendance que nous aurons besoin d’identifier afin d’obtenir les souris avec la modification génétique voulue. Pour ce faire les souris seront tatouées et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. Procédure 2 : Les souris seront traitées avec une molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant au modèle de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. Un mois après, pour laisser le temps aux effets d’avoir lieu, les cellules immunitaires des pattes arrière seront éliminées. Cette procédure se fera sous anesthésie afin de pouvoir toucher uniquement la zone souhaitée (pattes arrière). Par la suite, les animaux seront injectés de nouvelles cellules immunitaires d’une souris d’intérêt pour reconstituer les cellules précédemment éliminées. Enfin 2 mois après la reconstitution nous suivrons le renouvellement des macrophages provenant des cellules immunitaires nouvellement injectées. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur ces mêmes souris par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort. Procédure 4 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront mises soit sous régime riche en graisses soit sous régime standard (contrôle) et ce pendant 12 semaines. Aux semaines 4 et 8 (deux groupes de souris différents), un test de tolérance au glucose sera réalisé, pour cela, les souris seront mises à jeun 6h puis gavées avec une solution de glucose et la concentration de glucose sera suivie par prélèvement de sang au bout de la queue pendant 2h. Avant la mise à mort, les souris seront mises à jeun sur la nuit pour déterminer la glycémie et le taux d’insuline par prélèvement de sang au bout de la queue.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration d’une molécule permettant à notre modèle de fonctionner par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les animaux subiront une délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière ainsi qu'une injection intraveineuse pour réintroduire des cellules immunitaires au niveau des pattes arrière. Pendant toute la durée de la délétion ainsi que l'injection de cellules immunitaires, les animaux seront maintenus sous anesthésie (environ 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après la délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière, les animaux se retrouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées. - Une petite incision de la queue sera réalisé avant le test de tolérance au glucose et le sang sera prélevé par cette unique incision tout au long du test (nuisances modérées). L’administration de glucose par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les souris seront soumises à un régime riche en graisses pendant 12 semaines engendrant ainsi des maladies métaboliques (nuisances modérées).
Devenir
Tous les animaux reproducteurs seront mis à mort à l’issue de la période d’accouplement. A l'issue de la procédure 1, les animaux avec la modification génétique voulue seront utilisés dans les procédures 2, 3 et 4 et mis à mort afin de prélever les organes. Les animaux avec une modification génétique non voulue pourront être replacés dans un autre projet.
Remplacement
La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, tel que le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment l'absence des macrophages peut affecter la fonction du pancréas à l'état physiologique mais aussi au cours du diabète de type 2 met en jeu de nombreux types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans la fonction des macrophages pancréatiques.
Réduction
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Une taille de groupe égale à 5 devrait permettre de produire des résultats statistiquement exploitables. La taille du groupe sera élevée à 8 souris dans le cas des transplantations de moelle osseuse, cette expérience entrainant des variabilités plus élevées entre les échantillons. Dans le cadre de cette étude, pour les souris génétiquement modifiées (mutants conditionnels pour le facteur Csf1 et leurs contrôles), les accouplements seront faits pour permettre que tous les animaux générés dans les élevages soient utilisés pour les expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.
Choix des espèces
L'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte à partir de 6 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages pancréatiques à l’âge adulte.
Étude de l’influence des neurones sensoriels Nav1.8+ sur l’effet antitumoral des chimiothérapies dans des modèles murins de tumeurs mammaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Certaines des souris utilisées développent spontanément des tumeurs sur leurs dix glandes mammaires vers quatorze à seize semaines, d'autres reçoivent à quatre semaines une toxine qui détruit une partie de leurs neurones de la douleur. 3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent des adénocarcinomes mammaires, subissent des chimiothérapies, des injections péritumorales et l'implantation chirurgicale d'une micropompe, sans qu'aucun analgésique puisse leur être donné puisque le projet porte justement sur les neurones de la douleur, et le porteur affirme pourtant qu'en respectant les limites de taille des tumeurs elles n'atteindront jamais le stade de la souffrance. La mise à mort, entre seize et vingt-huit semaines, sert à prélever les tumeurs, les poumons, la rate, les ganglions lymphatiques et les ganglions rachidiens.
Objectifs
Il apparait de plus en plus évident que les systèmes nerveux et immunitaire travaillent de concert pour détecter les menaces, assurer la défense de l’hôte et maintenir ou restaurer l’homéostasie. Leur interaction repose sur l’action de molécules libérées par les fibres nerveuses innervant les tissus, capables de moduler les fonctions des cellules immunitaires, et vice-versa. Les glandes mammaires saines et les tumeurs mammaires murines sont innervées par ces fibres nerveuses impliquées dans la perception de la douleur et pourraient influencer la progression tumorale en fonction du statut inflammatoire des tumeurs. L’objectif principal de ce projet est donc d’examiner en détail l’influence potentielle de certaines de ces fibres nerveuses (Nav1.8+) sur la croissance tumorale et la réponse immunitaire antitumorale, en particulier lors de traitements chimiothérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’influence des fibres nerveuses Nav1.8+ sur la régulation de la réponse immunitaire antitumorale et l’effet thérapeutique des chimiothérapies reste peu exploré. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous-tendant cette régulation permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques combinées aux chimiothérapies. L’étude de l’influence des nocicepteurs sur la croissance tumorale et la réponse immunitaire anti-tumorale lors de traitement chimiothérapeutiques revêt donc une pertinence clinique évidente. Notamment, cette étude pourrait apporter des éclaircissements sur la prise en charge de la douleur provoquée par ces traitements, et déterminer si celle-ci influe sur la réponse antitumorale.
Procédures
Certaines souris seront soumises à une procédure chirurgicale afin de d'implanter une micro pompe osmotique. L'ensemble des injections (Intrapéritonéales, sous-cutanées, péri-tumorales) seront réalisée sous anesthésie gazeuse légère (isofluorane) et n’excèdent pas 10 secondes. Les souris subiront des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse sans nuisance pour l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront porteurs d’un ou plusieurs adénocarcinomes mammaires et seront soumis à des traitements chimiothérapeutiques, susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Certaines lignées de souris utilisées dans ce projet développent des tumeurs mammaires au niveau des 10 glandes mammaires aux alentours de 14-16 semaines. Cependant, par expérience, en respectant les limites de taille des tumeurs, les souris n’atteindront jamais le stade de souffrance ou de difficulté de mouvement aux temps auxquels elles seront mises à mort (entre 16 et 28 semaines). Dans ce projet, les souris seront soumises à diverses interventions (injection de cellules, agents chimiques, actes chirurgicaux) susceptibles de provoquer des douleurs allant de modérées à sévères, ainsi qu'un stress de durée variable, allant de courte durée (10 secondes) à plus longue durée (1 heure).
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (tumeurs, poumon, ganglion lympahatiques, rate, ganglions de la corne dorsale)
Remplacement
Notre hypothèse est que les fibres nerveuses Nav1.8+ pourraient influencer l’effet thérapeutique des chimiothérapies et la réponse immunitaire antitumorale. Compte tenu de la nature même du projet, qui nécessite d’effectuer des traitements de chimiothérapies sur des individus malades, seuls des modèles animaux sont utilisables pour répondre à ces questions. De plus, la tumeur est un micro-environnement complexe qui ne peut pas être modélisée in vitro et in silico, particulièrement en ce qui concerne son innervation sensorielle. Cependant, pour la recherche des mécanismes de l’interaction neurone-cellules immunitaires-cellules tumorales, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones, de cellules tumorales et de cellules immunitaires. De même, pour comprendre l’effet spécifique des chimiothérapies sur l’activation neuronale, nous tenterons d’effectuer ces traitements sur des cultures de neurones
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris au maximum. Le modèle d’induction d’un adénocarcinome mammaire est très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire. Ainsi, la pousse tumorale aura lieu dans quasiment 100% des souris. Des expertises antérieures de certains membres de l’équipe, enrichies par des recherches bibliographiques, nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience. Ce nombre a été également déterminé afin de répondre aux exigences de tests statistiques permettant d’obtenir une différence clinique et significative. Pour chaque groupe d'animaux utilisé, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la tumeur, marqueurs sanguins, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (tumeur, rate, foie, poumons, ganglions lymphatiques drainant et ganglion rachidien de la racine dorsale (DRG)) afin d'éviter de répéter des expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement tumoral et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Les souris sont nourries et boivent ad libitum et sont libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne est réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant le développement tumoral et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage et du comportement général des animaux, ainsi que de la taille et de l’aspect de la tumeur. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux à partir du moment où la taille des tumeurs atteindra 200mm3 pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature. Certaines souris seront traitées à la résinifératoxine et à la toxine diphtérique, respectivement, à l’âge de 4 semaines. En effet, l'injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d'obtenir une déplétion optimale et spécifique de cette sous-population neuronale.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Rôle de différents types de cellules dendritiques dans l’infection cutanée par le HSV-1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
724 souris vont être utilisées, toutes tuées deux jours après l'inoculation pour prélèvement d'organes, dont 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 624 un niveau modéré. Sous anesthésie, elles sont tondues, dépilées à la crème, puis la peau du flanc est abrasée avant l'inoculation du virus de l'herpès et la pose d'un pansement. Le porteur décrit une douleur modérée au réveil pendant un à deux jours, une irritation cutanée possible, des lésions vésiculaires au cinquième ou sixième jour, et le risque que les souris se coincent les dents dans le pansement pendant la nuit. Les anti-douleurs, écrit-il, "ne peuvent être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux".
Objectifs
La majorité de la population est chroniquement porteuse du virus de l’Herpès, suite à une infection dans la petite enfance lors d’un contact salivaire. Après son excrétion sur la peau, le virus de l’Herpès migre dans le ganglion nerveux du trijumeau, où il établit une infection latente. Il devient dormant et les hôtes infectés peuvent rester asymptomatiques toute leur vie. Des facteurs génétiques et environnementaux peuvent déclencher une réactivation rapide du virus. Une réactivation régulière peut entraîner l'apparition précoce de troubles auto-immuns (lupus). Des troubles cutanés sous-jacents (dermatite atopique) peuvent provoquer le développement d'un eczéma herpétique nécessitant souvent une hospitalisation. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reconnaissance et du contrôle immunitaire du virus de l’Herpès est essentielle pour progresser vers la mise au point de nouvelles thérapies visant à éradiquer ce virus ou à mieux soigner ses effets pathologiques. In-vitro, les cellules dendritiques de type 1 (cDC1s) sont capable de réguler l’activation des lymphocytes contre le virus de l’Herpès. Les lymphocytes jouent un rôle important dans le contrôle de la réactivation du virus mais on ne sait pas si c’est le cas au cours de l’infection cutanée initiale. Les cellules dendritiques plasmacytoides (pDCs) produisent des interférons lors d'une infection virale. Les interférons sont essentiels pour lutter contre les infections virales mais ils peuvent parfois avoir des effets nocifs. Les pDCs sont essentielles au contrôle d'une infection généralisée par le virus de l’Herpès, mais leur rôle est controversé dans le cas d’infections locales. ; il n’a jamais été abordé dans le cas d’une infection cutanée. Dans ce projet nous voulons étudier 1/ la cinétique des différentes phases de la réponse immunitaire précoce à une infection cutanée par le virus de l’Herpès ; 2/ le rôle des pDCs et des cDC1s dans la réponse immunitaire à une infection cutanée par le virus de l’Herpès ; 3/ le rôle des pDCs et des cDC1s dans la génération de la réponse immunitaire mémoire contre le virus de l’Herpès.
Bénéfices attendus
Nos travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la reconnaissance et du contrôle immunitaires du virus de l’Herpès. Ces recherches seront essentielles pour progresser vers la mise au point de nouvelles thérapies permettant de lutter contre les complications graves observées chez certains patients infectés. Notre Laboratoire dispose d’ores et déjà d’outils pour étudier le rôle de certains gènes, à la fois chez la souris et chez l’homme.
Procédures
1ère type d’intervention : sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc gauche suivie d’une inoculation du virus, puis elles seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements puis elles seront mises à mort pour analyses. 2ème type d’intervention : les souris recevront un traitement par ingestion ou injection pour éliminer un groupe donné de cellules immunitaires. Sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc gauche et une inoculation locale du virus puis seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements. 27 jours après une primo-infection, les souris recevront un second traitement par ingestion ou injection pour éliminer un groupe donné de cellules immunitaires. Sous anesthésie générale, les souris seront tondues et dépilées. Elles subiront ensuite une abrasion superficielle de la peau sur le flanc droit et une seconde inoculation locale du virus puis seront pansées. 2 jours après, les souris seront anesthésiées afin de retirer les pansements. Les souris seront mises à mort pour analyses.
Impact sur les animaux
La piqure d’aiguille pour l’injection d’anesthésie entraine une légère douleur de courte durée. L’application de crème dépilatoire au-delà du temps préconisé peut entrainer une irritation modérée de la peau de l’animal pendant moins d’une journée . L’abrasion du flanc sous anesthésie peut entrainer une douleur modérée au réveil de la souris, d’une durée d’un à deux jours , une fois les effets de l’analgésie dissipés. L'inoculation des flancs au virus de l’Herpès entraîne l'apparition de lésions vésiculaires dans l’épide au 5ème/6ème jour qui guérissent spontanément à partir du 7ème jour. Durant la nuit suivant la pose de bandage post-infection, les souris peuvent se coincer les dents dans le pansement s’il n’est pas bien réalisé ce qui entraine des difficultés à se mouvoir et s’alimenter. La technique d’administration de substance par voie intragastrique peut être modérément douloureuse, le temps de l’intervention , si le geste n’est pas maitrisé.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. Soit un total de 724 animaux.
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours d’une infection virale in vivo. L’importance et la complexité des nombreuses interactions cellulaires nécessaires au développement du système immunitaire ainsi qu’à la mise en place d’une réponse immunitaire suite à une infection virale justifient l’utilisation de modèles d’études vivants. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable.
Réduction
Nous réaliserons des expériences pilotes, afin de réduire la variabilité et le nombre de souris utilisées. Ces expériences nous permettront également de définir la temporalité optimale des analyses pour nos études. Selon les résultats, nous pourrions réduire le nombre total de souris utilisées à 622 : soit une réduction possible de 102 souris. Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits le plus possible. Nous travaillons avec des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de réduire la taille des groupes expérimentaux à 5 souris pour chaque condition, et afin de répondre aux exigences des tests statistiques nécessaires à effectuer. Pour les souris non infectées, la variabilité étant moindre, nous réduirons la taille des groupes à 3 individus par condition. Aussi, nous répéterons chaque expérience de façon indépendante seulement 2 fois.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupe. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids. Pour la partie infectieuse, les animaux seront rapidement transférés en animalerie de confinement et immédiatement hébergés dans des cages ventilées étanches. Ce type d’hébergement offre une protection contre les pathogènes et prévient aussi toute contamination entre cages adjacentes. Les animaux seront observés quotidiennement, avec attribution d’un score clinique. En fonction de ce score, des mesures adéquates seront prises pour minimiser la souffrance des animaux. Pour un score faible, ( pas de souffrance ou seulement très légère), aucune mesure ne sera prise. Pour un score moyen, (souffrance modérée), l’accès à la nourriture et à l’eau sera facilité ainsi que l’ajout d’enrichissements supplémentaires pour nidation, et la surveillance sera accrue à deux fois par jour. Pour un score élevé (une souffrance ne pouvant être soulagée), les animaux seront immédiatement mis à mort. Les anti-douleurs ne peuvent être utilisés sans compromettre les résultats expérimentaux. Lors de la pose des pansements, une vérification sera réalisée le lendemain, afin de s’assurer que les animaux ne se sont pas coincés les dents dans les bandages. Dans le cas où les modèles de souris que l’on testera dans ce projet présenteraient une infection aggravée, nous solliciterons l’avis de la Structure du Bien-Etre Animal de notre établissement, afin d’adapter notre grille de score. L’ensemble des gestes techniques sur souris vigile sera effectué par du personnel expérimenté, afin de réduire le plus possible le stress des animaux.
Choix des espèces
La taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées, pour lesquelles des stratégies interventionnelles expérimentales sont nécessaires, y compris l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire humain. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Rôle des cellules immunitaires et du nerf vague dans un modèle murin de fibrose hépatique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une section chirurgicale du nerf vague au cou, cinq gavages quotidiens, des injections dans l'abdomen trois fois par semaine et un régime qui attaque les canaux biliaires : 8 832 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La finalité déclarée est de comprendre les liens entre cellules immunitaires, nerf vague et cholangite sclérosante primitive, maladie rare qui touche six à dix personnes sur cent mille en France et pour laquelle aucun médicament n'a fait la preuve de son efficacité. Le porteur prévoit qu'une perte de poids de 20 % conduira à interrompre le régime quelques jours, avant de le reprendre pour atteindre la durée totale prévue. L'effectif est rapporté à un calcul de puissance, sans qu'un seul chiffre soit donné.
Objectifs
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie hépatique chronique, rare (6 à 10/100 000 habitants en France) caractérisée par une inflammation du foie, une prolifération des cholangiocytes et une fibrose péri-portale. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. A ce jour, aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la maladie et la prévention des complications qui lui sont associées. Des études suggèrent que certaines cellules immunitaires pourraient induire les lésions hépatobiliaires au cours de la CSP, notamment la fibrose. Toutefois, les mécanismes, notamment ceux à l’origine de la fibrose, demeurent encore mal connus. Afin de mieux appréhender les interactions complexes opérant au cours de la CSP, une perspective globale en examinant le rôle potentiel de diverses populations cellulaires dans la mise en place de la fibrose sera adoptée. D’autre part, le rôle du nerf vague dans la CSP sera étudié. En effet, la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, bien que les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux appréhender ces interactions complexes, une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront ensuite soumises à un régime pour induire la CSP, sera réalisée. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre l’inflammation, le nerf vague, la pathogenèse de la CSP et sa résolution. En décryptant ces mécanismes, les bénéfices attendus du projet sont d'ouvrir de nouvelles perspectives permettant le développement de nouveaux traitements et ainsi contribuer à une meilleure prise en charge de la CSP. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important pour le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Bénéfices attendus
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie rare qui touche entre 6 à 10 personnes pour 100 000 habitants en France. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. Aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la progression de la maladie et la prévention des complications. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important dans le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Procédures
Les souris seront soumises à : 1.une administration de molécule pour les modèles murins inductibles (via soit 5 gavages quotidiens pendant 5 jours, d'une durée de moins de deux minutes par gavage ; soit nourriture changée une fois par semaine ou eau de boisson changé tous les deux jours ; soit injection intrapéritonéale 3 fois par semaine, d'une durée de moins de deux minutes par injection, tout au long de la mise sous régime) 2.un régime alimentaire spécial (tous les jours pendant 28 jours maximum) 3.des traitements par injection d'anticorps en intrapéritonéale sur animal vigile (une à deux fois par animal, durée de quelques secondes) 4.une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (une fois par animal, durée de 10minutes) 5.un prélèvement sanguin sur animal vigile (une fois par animal, durée de quelques secondes) 6.Une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une modification du poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Le régime induisant la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) peut provoquer une perte de poids. Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de l'oesophage. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. La procédure chirurgicale pourra induire une douleur en post-opératoire malgré la prise en charge prévue ainsi que des risques d'infections dans de rares cas. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.
Réduction
8832 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins.
Raffinement
Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois au minimum). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. En cas d'observation d'une perte de poids trop rapide (20 pourcents par rapport à l’initiation des régimes), des mesures appropriées seront prises. Plus spécifiquement, le régime sera interrompu pendant quelques jours afin de permettre une récupération, puis le régime induisant la cholangite sclérosante primitive sera repris pour atteindre la durée totale prévue du régime. Cette approche vise à assurer une tolérance optimale du régime, comme démontré dans des études antérieures.
Choix des espèces
Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP). La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la CSP. En effet, le modèle murin permet de modéliser et d’intégrer les réponses immunitaires comme observé chez l’Homme. La souris offre l’avantage d’être un modèle bien établi pour l’étude de la CSP et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Les animaux âgés d’au moins 8 semaines seront utilisés pour l'entrée dans la procédure expérimentale afin que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris pourront entrer en procédure dès leur 8ème semaine d’âge et en ressortiront après 1, 2 ou 4 semaines de régime.
La maladie vasculaire du foie : prédire et comprendre sa progression
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
110 souris vont être utilisées, chacune recevant deux injections le même jour à deux heures d'intervalle, une fois par semaine, pendant cinq à huit semaines. Toutes sont tuées à quinze ou dix-huit semaines de vie pour prélever le foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté provoque une maladie des petits vaisseaux du foie, avec accumulation de liquide dans le ventre, altération de l'état général et modification du comportement, la dernière semaine ajoutant trente minutes d'anesthésie pour une imagerie hépatique. Le porteur indique avoir utilisé des tests statistiques pour fixer l'effectif, sans donner ni le calcul ni la taille des groupes.
Objectifs
La maladie des petits vaisseaux du foie appelée MVPS est une maladie rare (2,5 cas pour 100 000 habitants) caractérisée par l'atteinte des petits vaisseaux dans le foie mais sans lésion de cirrhose (foie dur et fibreux non fonctionnel). La maladie des petits vaisseaux du foie touche des individus jeunes, en moyenne de 45 ans. Elle est souvent associée à d'autres maladies comme des maladies du sang (cancer du sang), des maladies du corps qui s'attaquent à lui-même (appelées maladies auto-immunes) ou encore des maladies génétiques. Les mécanismes à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie sont inconnus. Sa progression peut conduire au développement d'une hyperpression dans les grosses veines situées avant le foie et qui sont censées le traverser pour ramener le sang au cœur, cette hyperpression s’appelle une hypertension portale. Cette pression dans les veines abdominales peut entrainer des ruptures de ces veines avec des saignements dans le tube digestif, l’accumulation de liquide dans le ventre appelé ascite, ou encore la formation d'un caillot dans ces veines empêchant la circulation du sang. Il n'existe actuellement aucun traitement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Comme cette maladie est encore largement incomprise, les progrès dans la recherche de traitement sont difficiles. Si l’implication des cellules formant les vaisseaux du foie est depuis longtemps suspectée puisqu’il s’agit d’une maladie des vaisseaux, l’une des nouvelles voies de recherche est l’étude d'autres cellules : les cellules de défense de l'organisme. Ces cellules, qui jouent un rôle contre les bactéries, peuvent être au repos dans le foie ou activer une réaction inflammatoire en cas de signal de danger de l’organisme. Elles ont été étudiées ces dernières années et leur nombre ainsi que leur activation semblent jouer un rôle dans le développement de nombreuses maladies dont certaines du foie comme la cirrhose. Notre hypothèse est donc que ces cellules pourraient, par leur interaction avec les cellules formant les vaisseaux du foie, être des acteurs clés dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. L'objectif est donc d’étudier leur impact dans son développement et sa progression. A terme, en cas d'implication, elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques. La première étape pour ces études est de développer la maladie des petits vaisseaux chez les souris.
Bénéfices attendus
Il existe plusieurs bénéfices à ce projet : en effet, la maladie des petits vaisseaux du foie touche des sujets jeunes et est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ en cas d’implication des cellules de défenses de l'organisme dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, ces cellules pourraient devenir des cibles thérapeutiques ce qui permettrait d’éviter ou de ralentir le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie.
Procédures
Les expériences dans notre étude durent 5 à 8 semaines. Tout d’abord nous déterminerons le nombre nécessaire et l’endroit (ventre de la souris ou veines de la souris) des injections du produit permettant le développement de la maladie vasculaire chez la souris. Pour cela, un premier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, vigiles, des injections dans le ventre du produit entrainant la maladie (l'injection dure 30 secondes, il y a 2 injections le même jour dans le ventre à 2 heures d'intervalle). Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang directement dans la veine qui revient au coeur (veine cave) sera réalisée pour obtenir un volume de sang suffisant. Un second groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (5 minutes d'anesthésie environ, le temps d'injection étant d'une minute environ). 2 injections le même jour seront réalisées chaque semaine, à 2 heures d'intervalle. Ces injections seront réalisées pendant 8 semaines et les souris recevront également pendant ces 8 semaines un régime alimentaire spécial. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 18 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée. Enfin, un dernier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (procédure idem groupe de souris précédent). La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines et les souris recevront également pendant ces 5 semaines un régime alimentaire spécial. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée.
Impact sur les animaux
Les souris qui reçoivent le produit pour développer une maladie des petits vaisseaux du foie peuvent présenter une altération de l’état général avec perte ou une prise de poids (en cas de formation de liquide dans le ventre). Pour les souris recevant les injections dans le ventre vigiles, les injections répétées de produit peuvent générer un stress ainsi que des douleurs temporaires au moment de l’injection. Le stress induit par le développement de la maladie (liquide dans le ventre, altération de l’état), les manipulations et les injections peuvent entraîner une modification du comportement de la souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés puis nous préléverons leur foie pour les analyses.
Remplacement
Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la MVPS et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur (par exemple la génétique).
Réduction
Pour limiter le nombre de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier les cellules de défenses sur le sang de patients atteints de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous réaliserons également des études préliminaires des interactions des cellules immunitaires avec les cellules des vaisseaux du foie sur des cellules isolées en laboratoire. Pour les souris, une seule souris fournira des prélèvements de sang et de foie pour plusieurs analyses différentes ce qui permet de diminuer le nombre de souris nécessaires. Nous avons également réduit le nombre d’animaux au strict minimum afin d’être en mesure d’obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous inclurons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les groupes.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par du personnel qualifié dans l’animalerie, hébergement dans des cages en groupe afin de limiter le stress (présent tout de même du fait des manipulations des souris), enrichissement de l’environnement avec du coton ou des batônnets en bois. Toutes les procédures pouvant faire souffrir ou occasionner plus de stress (comme les imageries) seront réalisées sous analgésie et anesthésie. L’état général de la souris sera évalué par une grille d’évaluation (étude du comportement de l’animal, mesure de son poids, état du poil...) remplie une fois par semaine, pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. En cas d'altération de l'état général, un antalgique sera administré pendant 72h. En l'absence d'amélioration de l'état général la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier l’ADN, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 10 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l’âge auquel apparaît cette maladie chez l’homme) et au maximum jusqu’à 18 semaines de vie (âge de développement de la maladie par injections du produit).
Etude fonctionnelle des cellules dendritiques dans les réponses T de la peau.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 80 d'entre elles reçoivent pendant cinq jours un traitement qui déclenche une dermatite atopique, les 344 autres une injection dans le derme des deux oreilles, geste de six minutes sous anesthésie, avant sept jours d'attente. Une inflammation des oreilles avec démangeaisons et rougeur est attendue. Les résultats obtenus hors de l'animal n'étant pas clairs, le porteur les attribue à des conditions trop simples et conclut qu'il faut retrouver ses cellules dans "un organisme entier".
Objectifs
La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui affecte jusqu’à 20% des enfants et 10% des adultes dans les pays développés. Elle est caractérisée par du prurit et de l’eczéma, ainsi qu’une inflammation de la peau accompagnée d’infiltration de cellules immunitaires et des niveaux d’anticorps anormaux. L’absence de traitements curatifs et la difficulté de vie des patients rendent nécessaire la recherche de nouvelles stratégies et cibles thérapeutiques. Notre laboratoire a mis en place un modèle murin reproduisant la dermatite atopique observée chez l'humain. A l'aide de ce modèle, nous avons pu mettre en évidence et caractériser une nouvelle sous-population de cellules immunitaires que nous avons démontré comme induisant préférentiellement une réponse anti-inflammatoire. Nous avons également cherché à tester la capacité de ces cellules immunitaires à induire une réponse pro-inflammatoire, mais les résultats préliminaires obtenus ne sont pas clairs, ce que nous supposons être dû à des conditions simples et contrôlées, ne reproduisant pas la complexité d’un organisme entier. Dans ce projet, nous souhaitons donc réaliser et confirmer nos études préliminaires dans un environnement immunitaire plus complet et complexe. Pour cela, nous souhaitons obtenir spécifiquement nos cellules immunitaires et les injecter dans la peau des animaux afin de tester le potentiel de ces cellules à induire une réponse pro- ou anti-inflammatoire au niveau local. Nous serons alors amenés à étudier la réponse immunitaire au niveau de la peau des animaux et dans des organes immunitaires par différentes techniques.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de la fonction de nos cellules immunitaires dans la modulation des réponses inflammatoires constituerait une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans le traitement de pathologies comme la dermatite atopique ou en lien avec le système immunitaire, comme les maladies auto-immunes ou le cancer. En effet, la modulation de la réponse immunitaire permettrait d'atténuer ou de restreindre l'inflammation dans un contexte d'allergie ou de maladie auto-immune, ou de l'amplifier dans un contexte de cancer.
Procédures
Lors de la première procédure, 80 souris seront anesthésiées par voie gazeuse et traitées pendant une durée de 5 jours (le traitement est d'une durée d'environ 30 secondes) afin d'induire une dermatite atopique. Pour la deuxième et troisième procédure, 344 souris seront anethésiées et injectées par voie intra-dermique avec des cellules immunitaires au niveau des deux oreilles et gardés pendant 7 jours (l'injection est d'une durée de 6 minutes).
Impact sur les animaux
D'après l'expérience du laboratoire sur de précédents projets, l'induction de la dermatite atopique pendant un temps de traitement court de 5 jours engendrera uniquement un léger stress de courte durée. L'injection au niveau des oreilles génèrera également un léger stress et une légère douleur de courte durée. Il sera également possible d'observer une inflammation au niveau des oreilles, accompagnée de démangeaisons et d'une rougeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les différents organes ou tissus nécessaires à l'étude de la réponse immunitaire.
Remplacement
Les résultats préliminaires ont été obtenus dans des modèles simplifiés et contrôlés qui ne nous permettent pas de reproduire la complexité des réactions immunitaires qui ont lieu dans différents organes ou qui impliquent divers acteurs de l'immunité. La réalisation d'expériences avec des animaux est nécessaire pour mettre en évidence la fonction de nos cellules immunitaires d'intérêts dans un environnement immunitaire complet et complexe et pour confirmer les résultats précédemment obtenus.
Réduction
Le protocole d'induction de la dermatite atopique sera appliqué à un total de 7 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules immunitaires d'intérêts ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. Cependant, les cellules immunitaires d'intérêts représentent moins de 1% de la population cellulaire totale des organes immunitaires après induction de la dermatite atopique et, par expérience sur de précédents projets, nous savons qu'il est nécessaire d'avoir environ 10 animaux dans chaque lignée murine pour avoir un nombre de cellules suffisant pour la suite du projet. Seul un groupe traité sera nécessaire dans l'obtention des cellules immunitaires d'intérêts, donc nous n'incluerons pas de groupe non traité comme contrôle. Le protocole d'injection des cellules immunitaires d'intérêts obtenues depuis les animaux ou générées en dehors d'organismes sera réalisée sur un total de 2 lignées afin d'étudier la réponse immunitaire mis en place par les cellules injectées. Dans le cas de l'obtention des cellules immunitaires d'intérêts depuis des animaux, un total de 2 groupes composés de 8 animaux sera mis en place. Dans le cas des cellules immunitaires générées en dehors d'organismes, un total de 3 groupes composés de 8 animaux sera mis en place. Dans les deux cas, ce nombre est justifié par l'obtention de résultats statistiquement interpétrables pour les différents paramètres mesurés. Après analyse, nous effectuerons des tests statistiques permettant de comparer les réponses immunitaires induites par les cellules immunitaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience. L'induction de la dermatite atopique et l'injection des cellules immunitaires sont réalisées sous anethésie gazeuse légère. Pendant l'expérience, il pourrait être possible d'observer une inflammation au niveau de l'oreille, accompagné de démangeaisons et d'une rougeur, mais n'impactera pas le comportement des animaux (soin du pelage, posture, activité normale, ...). Cependant, si un animal vient à dépasser les points limites fixés par la grille de score de chaque procédure expérimentale, il sera retiré de l'étude et euthanasié.
Choix des espèces
Un modèle de souris est plus adapté de par son système immunitaire proche de celui de l'humain, avec notamment la présence d'un système immunitaire adaptatif. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines après leurs naissances afin de mener nos études sur un système immunitaire adulte.
Etude de la réponse immunitaire induite chez le furet après vaccination BCG par voie orale ou sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Commandés à un fournisseur après une première série de quatre furets utilisés entre novembre 2023 et février 2024 pour que les expérimentateurs acquièrent les gestes, 12 furets vont être utilisés à leur tour, tous tués à l'issue pour constituer une banque de tissus. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Sur onze semaines, chaque furet reçoit un implant télémétrique, jusqu'à huit prises de sang, une vaccination BCG par voie orale ou sous-cutanée, une administration intratrachéale et un lavage broncho-alvéolaire, tous ces actes sous anesthésie générale de 5 à 30 minutes. Le furet est retenu parce qu'il est sensible à Mycobacterium bovis comme le blaireau, espèce sauvage visée par le programme de vaccination, dont l'expérimentation est soumise à une réglementation plus contraignante.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique plus global visant à étudier la vaccination contre la tuberculose, dans la faune sauvage. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Les objectifs sont d’analyser l’influence de la voie de vaccination (orale vs sous cutanée) sur la mise en place d’une réponse immunitaire contre les mycobactéries. Le modèle furet est utilisé pour la première fois dans nos conditions « infectieuses » d’expérimentation. Une première expérimentation a eu lieu avec 4 furets entre novembre 2023 et février 2024 afin de permettre aux expérimentateurs d’acquérir les gestes techniques. Le présent projet est prévu pour au maximum 12 furets : 1 lot de 6 qui recevra le vaccin par voie orale et 1 lot de 6 qui recevra le vaccin par voie sous-cutanée. Le sexe ratio sera adapté selon les capacités du fournisseur à nous fournir au moment de la commande. La voie sous cutanée a été testée sur des blaireaux mais elle nécessite une capture des animaux. Si ce projet démontre que la voie orale est aussi efficace, elle serait plus adaptée pour une vaccination à grande échelle. La voie sous-cutanée est une référence car elle est bien décrite dans différents modèles pour son efficacité. La voie intratrachéale est utilisée pour mimer l’exposition des animaux au pathogène (voie pulmonaire) afin de visualiser la réponse protectrice développée par la vaccination. Il s’agit d’un boost pour pouvoir quantifier la réponse immunitaire. Dans le modèle murin il s’agit d’une voie classique d’exposition. Ce projet a 3 finalités : 1) Répondre à la réglementation en expérimentation animale en vigueur concernant la maitrise et le maintien du savoir-faire du personnel. Ce projet permettra de perfectionner la mise en œuvre de gestes techniques sur modèle furet (manipulation, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale, injection sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) 2) Valider les outils d’analyse de la réponse immunitaire developpé sur des furets sains « non infectés » 3) Quantifier la reponse immunitaire des furets suite à une vaccination BCG.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont doubles : 1) valider les outils nouvellement developpés (analyse des cellules immunitaires par cytométrie en flux, analyse des réponses immunitaires par transcriptomique) 2) définir la meilleure voie d’administration du vaccin BCG (voie sous cutanée ou orale), permettant la mise en place d’une protection optimale contre les mycobactéries.
Procédures
Au cours des 11 semaines du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : - 1 pose de puces télémétriques qui durent quelques secondes - 8 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes - 1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min - 1 administration en SC (sous cutanée), qui dure quelques secondes - 1 administration en intra-trachéale, qui dure quelques secondes.Tous ces actes se feront sous anesthésie générale pendant 5 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. En raison de leur hébergement en couple, d'éventuelles blessures infligées par les congénères sont possibles (griffure, morsure, abcès…).
Devenir
La totalité des animaux sera mis à mort à l’issue du projet afin de constituer une banque de tissus d’animaux qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimal d’animaux a été fixé à 6 par lot pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux (hébergement en couple) et pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet. En fonction de ce que le fournisseur sera en mesure de nous fournir au moment de la commande, le sexe ratio de chaque lot pourra être adapté. L’expérimentation contient 2 lots : un lot pour lequel le BCG est administré par voie orale et un lot avec une administration par voie sous-cutanée. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants.
Raffinement
Dans les 2-3 jours suivants leur arrivée, les furets seront anesthésiés pour permettre la pose des implants télémétriques puis une période d’acclimatation à l’environnement et d’habituation au personnel sera mise en place pendant 21 jours. La seule intervention du personnel sera de les habituer à leur présence et aux contacts : jeux, friandises. Ils seront également vermifugés. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues spécifiquement pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage mais elles seront interconnectées par 2 avec un système de tunnel permettant aux furets de se regrouper. Un hamac en tissu sera suspendu à l’intérieur de chaque cage permettant aux furets d’avoir un coin repos. Différents types de jouets seront utilisés (balle, tissus…). Des récompenses alimentaires (saumon, jus de thon, pâte appétente) seront données après les interventions qui ne nécessitent pas d’anesthésie (pesée, traitement anti-parasitaire). Ces récompenses alimentaires qui seront données au cours de la période d’acclimatation permettront d’habituer les animaux pour l’administration orale du vaccin à J0. Les furets seront maintenus sous anesthésie générale gazeuse. Tout au long de l’anesthésie, ils seront sous monitoring (fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, température), sous lampe et/ou tapis chauffant et sous la supervision du personnel en charge des anesthésies. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel sera mis sur la sonde pour anesthésier la gorge. Lors de la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera faite, jusqu'à son réveil complet. En cas de besoin, des traitements seront mis en place pour faciliter le réveil et gérer une éventuelle douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique sera mis en place. La vétérinaire de l'unité sera systématiquement consultée en amont. Deux visites quotidiennes seront réalisées afin d'assurer les soins quotidiens, de surveiller l’état de santé des animaux. Des point limites adaptés ont été définis et la vétérinaire de l’unité sera avertie en cas d’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 1 an (poids d’environ 1400 g pour les mâles et 1200 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes est conditionné par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement.