Système immunitaire

Sept injections et neuf prélèvements sanguins sous anesthésie par animal, sur des souris chez qui une tumeur mammaire est déclenchée : 166 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La pousse tumorale peut provoquer une gêne ou une douleur locale, les injections intrapéritonéales, intraveineuses et sous-cutanées une douleur au point d'injection. L'objectif déclaré est d'identifier les cellules immunitaires qui éliminent les cellules en cours de transformation tumorale, que le porteur présente comme une piste de prévention des cancers et des rechutes. Parmi les animaux tués figurent les mâles reproducteurs et les souriceaux au "génotype non relevant car inutilisés", et le point limite est évoqué comme un "volume tumoral trop important" sans que le seuil soit donné.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer chez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité lié à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. Au cours des dernières années, certaines thérapies ciblant le système immunitaire ont déjà démontré des efficacités thérapeutiques sans précédent dans certains types de cancer (mélanome, cancer du poumon). Cependant, à l’heure actuelle, seulement un faible nombre de patients répondent à ces immunothérapies innovantes. Ainsi, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant les cellules du système immunitaire des patientes atteintes de cancer du sein reste primordiale. Notre projet a pour objectif de déterminer, en utilisant un modèle de tumeur spontanée mammaire chez la souris, les acteurs du système immunitaire qui pourraient être impliqués dans l'élimination des cellules qui sont en train de se transformer en cellules tumorales.

Bénéfices attendus

La compréhens ion des mécanismes impliqués dans la détection précoce et l’élimination, par les cellules du système immunitaire, des cellules en transformation tumorale devrait permettre de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques représentant une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.

Procédures

- Pousse tumorale suite à l'induction du phénotype dommageable. - Injections (x7, 2min) ; -Prelèvements de sang, x9, 5min incluant l'anésthésie

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, et/ou une douleur locale. Les injections par voies IP, IV et SC peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer un stress causé par l’anesthésie générale et une douleur locale.

Devenir

A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort pour les raison suivantes : - Les mâles reproducteurs ainsi que les souriceaux issus des accouplements avec un génotype non relevant car inutilisés; - afin de réaliser des analyses de biologie ex vivo sur les tissus mammaires au cours de la progression tumorale, les animaux seront mis à mort avant prélèvement des tissus pour éviter toute souffrance. - atteinte d'un point limite (par exemple volume tumoral trop important...).

Remplacement

À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détections des cellules en transformation tumorale par le système immunitaire.

Réduction

Grâce à des données de la littérature, issues d'expériences pilotes sur un faible nombre d'animaux, ou de par notre exeprience, le nombre de souris a été déterminé au minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 166 souris sera utilisé dans ce projet.

Raffinement

Certaines procédures (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable,un anti-douleur sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser l’infiltrat immunitaire au cours du développement tumoral. De plus nous avons pour objectif d’effectuer une analyse détaillée du microenvironnement tumoral ; les outils que nous souhaitons utiliser ne sont disponible que chez la souris.

Infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, après implantation d'une puce de télémétrie dans le dos et trois prises de sang à la joue, 70 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend des symptômes généralisés et une perte de poids, sans mortalité, avec une guérison en quatre jours. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever les poumons, la rate et le sang, l'essai visant à confirmer in vivo trois anticorps neutralisants identifiés par séquençage de répertoires immunitaires et intelligence artificielle. Leur pouvoir neutralisant équivaut, écrit-il, à celui du seul anticorps encore efficace sur les variants circulants, dont la vente est restreinte aux États-Unis.

Objectifs

L’utilisation d’anticorps monoclonaux issus de patients ciblant les protéines de surface d’un virus a déjà fait ses preuves dans la lutte contre le SARS-CoV-2. Cependant, l’émergence de nouveaux variants viraux d’intérêt dont le variant Omicron, compromet la bonne efficacité des anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique. Ainsi, il est nécessaire d’apporter régulièrement des évolutions thérapeutiques avec le développement d’anticorps à activités neutralisantes plus larges. Nous avons identifié des anticorps dirigés contre le SARS-CoV-2 à partir de séquençages de répertoires immunitaires de patients infectés et guéris de la COVID-19 combinés aux technologies d’Intelligence Artificielle développées par une entreprise. Nos travaux se focalisent particulièrement sur l’obtention d’anticorps neutralisants de large spécificité qui conservent leur efficacité sur les nouveaux variants d’intérêt du SARS-CoV-2 en circulation ou à venir. Dans ce cadre, trois anticorps à très forte affinité et à haut pouvoir neutralisant ont été identifiés, avec la capacité de neutraliser différents variants du SARS-CoV-2, et ciblant chacun des épitopes différents de la protéine virale S. Leur capacité neutralisante est équivalente à celle d'un autre anticorps commercialisé (unique) encore efficace sur les variants circulants actuels et dont la vente est restreinte aux USA. Ainsi, le fort pouvoir neutralisant de ces 3 anticorps en fait de bons candidats à visée thérapeutique. Il nous semble nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ainsi, nous nous attendons à ce que ces 3 anticorps injectés à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 initient une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de symptômes, comme attendu avec un anticorps thérapeutique à visée clinique.

Bénéfices attendus

La validation des anticorps thérapeutiques testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’ameliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19. Cela permettra également de confirmer le processus d’identification rapide in silico d’anticorps thérapeutiques développé par notre groupe d’étude lors d’une nouvelle émergence virale de coronavirus ou d’une virose inconnue (virus X) comme soutenu par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Procédures

Tous les animaux, soit 70 souris. Une puce dorsale d’identification et de télémétrie sera injectée en sous-cutané pour une souris (12 minutes par animal, une fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Inoculation des anticoprs thérapeutiques ou placebo par voie intra-péritonéale sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique neutralisatante des anticorps. (5 minutes par animal, 1 fois). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale en voie intra-péritonéale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois). Prélèvements nasaux sous anesthésie gazeuse. L'objectif est d'analyser la réponse immmunitaire mucosale (5 min, 2 à 3 fois par animal).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptomes généralisés mais sans mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire est attendue suivi d’une guérison totale au bout de 4 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations du sensor télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, rate, swab, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour remplacer ce modèle murin qui permettra de restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain. Ce modèle de souris transgéniques a été mis au point spéicifiquement afin de pallier les difficultés rencontrées avec les précédents modèles animaux et en absence de méthode alternatives . Le modèle de souris transgénique est bien décris dans la littérature développant la pathologie attendue et induisant une réponse immunitaire, afin répondre aux attentes du projet sur la protection antivirale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base de l’étude de la réponse immunitaire et virale.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, aus sein d'une animalerie confinée, en isolateur durant l'infection infection expérimentale. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les souris sont anesthésiées par injection par voie intra-péritonéale avant chaque instillation intranasale. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type graines de Tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

Tuées après leur dernier repas, celui des moustiques, 3600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris élevées pour cela servent huit fois, chaque fois anesthésiées dix à trente minutes le temps que les moustiques les piquent, avec une anémie passagère et une injection de sérum physiologique pour compenser le sang perdu. D'autres viennent des surplus de l'animalerie, animaux qui allaient être tués pour leur génotype ou leur âge, et ne servent qu'à un seul repas. Le porteur écarte le repas artificiel sur membrane parce que 40 à 50 % des moustiques femelles s'y nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant, ce qui menacerait le rendement en œufs de ses 110 lignées.

Objectifs

Les animaux de ce projet seront utilisés pour un élevage d’une centaine de lignées de moustiques que nous utilisons pour nos expériences, qui ont pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les moustiques et le pathogènes qu’ils transmettent, et de mettre au point de nouvelles stratégies de lutte contre ces maladies. Pour ce faire, nous générons diverses lignées de moustiques, sélectionnées en fonction de leur phénotype ou génétiquement transformées, et étudions leur comportement lors d’infections. Les repas sanguins sont nécessaires aux femelles pour pondre leurs œufs. Le site fournit également des services, notamment l’envoi ou l’infection de moustiques, à des laboratoires publics ou privés extérieurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de maintenir les lignées existantes en expérimentation, et d’en créer de nouvelles pour les projets de recherche de notre laboratoire et des laboratoires extérieurs utilisant notre plateforme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour permettre aux moustiques de prendre un repas sanguin pendant 10 à 30min. Ils sont exposés aux nuisances suivantes : (1) injection d’anesthésique, et (2) prélèvement sanguin par les moustiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont limitées. Aucun signe de démangeaison n’est observé après piqûres par les moustiques, et leur récupération est rapide. Cependant, au cours de sa vie, chaque souris est soumise à 8 anesthésies générales avec perte limitée de sang qui génère une anémie passagère.

Devenir

Les animaux surnuméraires qui seront utilisés pour un unique repas sanguin des moustiques seront mis à mort après le repas. Les souris spécifiquement élevées pour les repas sanguins des moustiques seront utilisées pour 8 repas et mises à mort après le dernier repas.

Remplacement

La méthode alternative à savoir la prise de repas sanguins sur du sang humain ou animal à travers une membrane artificielle, n’est pas applicable du fait des contraintes techniques de mise en œuvre de ce système qui ne sont pas adaptées au nombre élevé de lignées de notre élevage (≈ 110 lignées). De plus, lors d’un repas artificiel sur membrane, 40-50% des femelles moustiques se nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant. Ainsi, le rendement en œufs des lignées nourries artificiellement risque d’être insuffisant, et d’interférer avec les expériences ou même de conduire à la perte de certaines lignées.

Réduction

Chaque souris est utilisée en moyenne 6-8 fois pour les repas sanguins. Nous proposons également de récupérer les souris surnuméraires de l’animalerie (souris qui sont mises à mort sans être utilisées dans des protocoles expérimentaux à cause de leur génotype, de leur âge…) pour réaliser des repas sanguins uniques et ainsi réduire le nombre de souris que nous élevons spécifiquement pour les repas sanguins des moustiques.

Raffinement

Les souris utilisées pour le repas sanguins sont hébergées en groupe. Elles bénéficient de frisure de carton ainsi que de tunnels. Elles sont anesthésiées pour le repas sanguin puis elles reçoivent une injection de solution saline physiologique pour compenser les pertes en volume sanguin lors du repas des moustiques. Durant le repas, les yeux des souris sont protégés avec un gel pour éviter qu’ils ne se dessèchent. Pendant la phase de réveil, les souris sont placées sous lampe chauffante pour limiter les déperditions en chaleur. Les souris sont laissées au repos pendant au minimum 4 semaines entre 2 repas sanguins afin qu’elles puissent reconstituer leur stock de cellules sanguines et éliminer toute trace d’anesthésique.

Choix des espèces

Parmi les espèces de rongeurs possibles Mus musculus s’avère le choix le plus pertinent pour nos expériences : - Les moustiques Anophèles et les moustiques Aedes, naturellement anthropophiles, sont capables de se nourrir sur cette espèce. - Les souris ne présentent pas de signe de démangeaison après piqûres de moustiques. - Les souris récupèrent rapidement après avoir été soumises à un repas sanguin. - Les infections des moustiques pour leur phénotypage se font en majorité sur des souris infectées (avec le parasite murin Plasmodium berghei, ou avec les virus de la dengue ou Zika). - Les moustiques sont plus enclins à se nourrir sur les souris infectées quand ils sont régulièrement nourris sur la même source de sang. Nous utiliserons des souris adultes âgées au minimum de 8 semaines (> 35 g) car les souris plus petites risquent une perte volumique trop importante lors des repas sanguins.

Nées avec une croissance dentaire anormale, des dents trop longues et incontrôlées pour certaines, rabougries pour d'autres, 2700 souris génétiquement modifiées sont élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À dix jours, chacune se voit couper un morceau de queue pour vérifier son génotype. Le porteur indique que la douleur y serait alors faible, voire nulle, l'ossification de la queue n'ayant pas commencé, et prévoit de la nourriture en gelée et des bâtonnets à ronger pour compenser les difficultés à s'alimenter. Cet élevage ne répond par lui-même à aucune question scientifique, il alimente de futures demandes d'autorisation sur les macrophages, et les animaux conservés à l'issue rejoignent d'autres projets.

Objectifs

Nous élevons une lignée de souris génétiquement modifiées qui présente un phénotype spécifique, impliquant des altérations physiologiques et comportementales. Ces souris, en raison de modifications précises de leur génome, affichent une croissance anormale des dents. Cette anomalie dentaire peut entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui, à son tour, peut causer un retard de croissance et une diminution de leur poids corporel. Pour atténuer ces effets néfastes, nous mettons en place une prise en charge adaptée, incluant une alimentation spécifique qui compense les limitations dues à la croissance dentaire. Ces souris sont produites dans le but de répondre à des objectifs scientifiques variés. En raison de leur modification génétique, elles sont un modèle précieux pour étudier les rôles spécifiques de certaines cellules immunitaires, comme les macrophages, qui jouent un rôle crucial dans divers tissus du corps. La suppression de certaines populations cellulaires permet d'examiner en profondeur les conséquences de leur absence, ce qui est pertinent pour la recherche sur le développement et la régulation immunitaire. De plus, ces souris modifiées sont utilisées pour modéliser diverses pathologies comme le cancer ou l’étude des rôles homéostasiques des macrophages. Permettant ainsi dans l’avenir des applications biomédicales.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, la recherche sur les macrophages a émergé comme un domaine clé en immunologie. Ceci est dû à notre compréhension croissante du rôle vital de ces cellules dans l'homéostasie des tissus et leurs divers rôles significatifs dans différentes maladies tels que le cancer, les infections ou encore maladies auto-immunes. Le premier Conseil Scientifique Présidentiel réuni en avril 2024 a spécifiquement souligné les macrophages comme un "axe majeur et émergent" pour les années à venir. Ce modèle de souris va permettre d'étudier le rôle de plusieurs populations de macrophages dans divers tissus très localisés. Les différentes caractéristiques observées après génération des souris confirment d'ailleurs la nécessité de comprendre leurs fonctions et l'utilité de ce modèle pour y répondre.

Procédures

2700 souris se verront prélever un morceau de queue 10 jours après leur naissance.

Impact sur les animaux

Après la première génération de souris, nous avons observé que certaines étaient plus petites que leurs congénères du même groupe. Nous avons également constaté une croissance anormale des dents : certaines souris présentaient des dents nettement plus petites et plus fines, tandis que d'autres avaient des dents beaucoup plus longues avec une croissance non contrôlée. Ces deux problèmes pourraient être liés, la croissance anormale des dents pouvant entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui diminuerait la prise de poids. Un prélèvement de la queue sera réalisé sur les animaux 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le système nerveux de cette partie est encore immature et l’ossification de la queue inexistante.

Devenir

Les animaux qui sont conservés après la fin de cette étude seront utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche. Cette utilisation continue permet de maximiser les données obtenues à partir des animaux tout en respectant les principes d'éthique de réduction du nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Ce projet décrit l’élevage de souris génétiquement modifiées en condition de maintien pour une lignée à phénotype dommageable. Ces souris seront utilisées pour de futures demande d’autorisation de projet interrogeant la fonction des macrophages ciblés. Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et son microenvironnement puisque nous ne connaissons pas l’ensemble des signaux.

Réduction

Nous maintiendrons un élevage à minima sur la base de 5 accouplements avec 1 mâle et 3 femelles par accouplement car cette lignée semble avoir des portées de petites tailles. Ces derniers seront renouvelés toutes les 26 semaines. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les descendants des accouplements précédents.

Raffinement

- de la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage pour surmonter toutes les difficultés d'alimentation des souris. - Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées lorsque cela sera nécessaire. - Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux seront surveillés pendant cette période d’accouplement et d’élevage et des mesures adéquates prises en cas de comportement agressif allant de l’enrichissement de la cage en dômes, de mesures d’isolement temporaire en cas de comportement agressif, en l’’administration de crème par voie cutanée sur de possibles blessures pourront être mises en place si nécessaire.

Choix des espèces

L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour de futures recherches. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement en fonction des projets dans lesquels ils seront impliqués. Par exemple, si nous nous intéressons au développement dentaire qui est altéré dans ce modèle, nous analyserons des souris durant les premières semaines après la naissance. Pour les projets étudiant le rôle des macrophages de la tête et du cou dans diverses pathologies (cancer, infection), des animaux adultes seront utilisés. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les individus âgés de 6 à 10 semaines au moment du début de l'accouplement.