Système immunitaire
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- Système urogénital
Identification du rôle d’une hormone dans la progression tumorale chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Toutes mises à mort pour prélèvement d'organes, 2 016 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales ou une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, suivie de trois cycles de cinq jours d'ingestion d'un irritant intestinal dans l'eau de boisson. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées et des risques de saignement liés à cet irritant, et mesure les tumeurs au pied à coulisse trois fois par semaine. Il conclut que le recours à l'animal est "nécessaire" parce que l'infiltration des cellules immunitaires dans la tumeur ne s'observe pas in vitro, et attend de ce travail des "traitements modulateurs du fer".
Objectifs
A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.
Impact du microbiote implanté à la naissance par une supplémentation anténatale en Human Milk Oligosaccharides (HMO) sur la prévention de l’allergie alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des souris gestantes, nourries pour une partie d'un aliment enrichi en oligosaccharide du lait maternel humain, sont tuées au 19e jour de gestation pour une césarienne, et leurs petits confiés à des mères adoptives dont les propres portées sont tuées. 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les descendantes femelles reçoivent deux injections dans l'abdomen pour les sensibiliser à un allergène, puis, à 45 jours, un gavage du même allergène destiné à déclencher chute de température, irritations de la bouche et des oreilles et isolement, avant d'être tuées. L'équipe veut savoir si la protection contre l'allergie alimentaire qu'elle dit avoir démontrée chez la descendance passe par le microbiote transmis à la naissance. Les mères adoptives sont tuées après le sevrage, les descendants mâles aussi ou bien placés dans d'autres protocoles, et les souris surnuméraires sont tuées ou employées pour des travaux in vitro.
Objectifs
La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.
Procédures
L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendantes femelles au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur les descendantes femelles. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.
Devenir
Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes et les descendants mâles seront mis à mort après le sexage et la fin du sevrage. Les descendantes femelles seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.
Réduction
Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendantes femelles) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.
Choix des espèces
Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Les descendants mâles ne seront pas utilisés dans ce protocole. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles seront soit mis à mort, soit utilisé dans d'autres protocoles mis en place dans notre animalerie.
Mécanismes d’échappement immunitaire du parasite Toxoplasma gondii au cours de la phase chronique de l’infection
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Deux gavages par jour, cinq jours par semaine, pendant quatre semaines, soit jusqu'à quarante administrations forcées par animal, après une infection par Toxoplasma gondii. 931 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélever le cerveau. En phase aiguë, le porteur indique que les souris peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids et présenter une forte prostration, l'objet du projet étant de tester des molécules censées rendre les neurones infectés à nouveau détectables par le système immunitaire. Aucun analgésique ni anti-inflammatoire n'est prévu, y compris la buprénorphine, au motif que ces molécules modifieraient les résultats.
Objectifs
Toxoplasma gondii (T. gondii) est un parasite intracellulaire très répandu, auquel environ 1/3 des êtres humains on été exposés. Des réponses immunitaires se développent suite à l’infection mais elles sont incapables d’éliminer le parasite qui persiste ensuite de manière latente dans les muscles, la rétine et le cerveau, sous forme de kystes intra-neuronaux. Plusieurs études suggèrent que des mécanismes d’échappement sont mis en place pour limiter la détection des neurones infectés par les lymphocytes T CD8+, ce qui favorise la persistence à long-terme du parasite dans le cerveau. L’infection chronique par T. gondii est problématique pour la santé car en cas d’immunosuppression, le parasite peut se réactiver et provoquer une encéphalite. De plus, un faisceau d’évidences récentes suggère que cette infection du cerveau, et la neuroinflammation chronique qui l’accompagne, perturbe les fonctions cognitives et accélère le déclin cognitif au cours de la maladie d’Alzheimer. Les traitements disponibles contre T. gondii sont efficaces contre la forme réplicative responsable de la dissémination au cours de l’infection aigue. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun traitement capable d’éliminer les formes enkystées, responsables de la chronicité de l’infection. Ainsi, ce projet vise à : (i) mieux comprendre les mécanismes moléculaires permettant à T. gondii d’échapper à la détection par les lymphocytes T CD8+ ; (ii) tester des molécules thérapeutiques pour lever les mécanismes d’échappement afin d’accentuer la détectabilité des neurones infectés par T. gondii vis-à-vis des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau et d’aboutir à une élimination (clairance) du parasite.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre (i) comment les formes persistantes de T. gondii dans les neurones interfèrent avec les neurones infectés pour limiter leur reconnaissance par les lymphocytes T CD8+, et (ii) à tester de nouvelles pistes thérapeutiques pour inverser les effets modulateurs du parasite dans le cerveau. Une meilleure compréhension des réservoirs parasitaires qui persistent en phase chronique de la toxoplasmose est essentiel car il n’existe actuellement aucun traitement contre les kystes. Cette forme latente du parasite peut se réactiver et causer une encéphalite potentiellement mortelle. De plus, l’infection latente chez l’immunocompétent est associée à des troubles neuropsychiatriques (e.g. schizophrénie), diverses altérations cognitives et une accélération du déclin cognitif. A terme, nos résultats pourraient identifier une nouvelle voie thérapeutique conduisant à l’élimination du parasite (clairance) en s’appuyant sur l’immunité naturelle des individus infectés et en rendant plus efficace l’action des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau. Ce projet pourrait avoir des retombées majeures et bénéfiques sur la prise en charge des personnes à risque de développer une encéphalite (e.g. porteuses du VIH ou subissant un traitement immunosuppresseur) ainsi que des individus touchés par des démences de type Alzheimer.
Procédures
Selon les procédures, les animaux seront infectés par : (i) injection intra-péritonéale, une fois ou (ii) gavage per os en 1 fois, qui est le mode naturel d’infection avec T. gondii. Ensuite, en phase chronique de l'infection, les animaux seront seront soumis à soit (i) des injections per os 2 fois par jour, à raison de 5 jours par semaine pendant 4 semaines, soit (ii) des injections intra-péritonéales à raison de 2 fois par semaine, pendant 4 semaines. A l'issue de ces procédures, les animaux seront éventuellement soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil, pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
La phase aigue de l'infection par T. gondii est symptomatique entre J7 et J15 pi (phase aigue) chez la souris. Pendant cette phase, les animaux peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial et présenter une forte prostration. Après récupération suit la phase chronique qui, dans les modèles d’infection latente que nous utilisons, est cliniquement asymptomatique (à l’exception de déficits mnésiques). Les symptomes d’ataxie/syndrome vestibulaire (tête ‘désaxée’, mouvements circulaires récurrents, ataxie) ne sont observés que dans les conditions ‘encéphalite’, rarement en condition latence. Dans les différentes conditions expérimentales que nous projetons de tester, nous nous attendons à observer un meilleur controle, voire une élimination, du parasite lors de la phase chronique, donc nous nous attendons à une moindre nuisance par rapport à l'infection controle. Enfin, les souris subiront des injections intrapéritonéales (i.p.) et des gavages (per os). Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et transitoire (secondes).
Devenir
Tous les animaux dans chaque procédure expérimentale seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses ex vivo ou in vitro.
Remplacement
Notre projet se focalise sur les interactions entre le parasite Toxoplasma gondii et des cellules du système nerveux (neurones) et immunitaire (lymphocytes T CD8+), qui assurent la surveillance du parasite dans le cerveau. Au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas auparavant, nous cultivons maintenant les tachyzoïtes sur des fibroblastes humains, ce qui contribue à l’objectif de remplacement. En outre, nous avons dédié une partie du projet (cf procédure 1 sans réveil) à l’étude de ces phénomènes in vitro grâce à des cultures de neurones primaires, ce qui limite le nombre d’animaux infectés passant en procédure sévère. Ces expériences in vitro permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de l'échappement immunitaire par les neurones infectés mais elles ne suffisent pas pour appréhender les conséquences réelles sur la physiopathologie de la toxoplasmose, ni la pertinence des traitements envisagés. Des infections expérimentales in vivo sont indispensables pour compléter ce projet car la complexité des systèmes immunitaire et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences in vitro) la ‘connectique’ de toutes les populations cellulaires mises en jeu. Par conséquent, il n’est actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (cf détails ci-dessous). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Basé sur nos précédentes études portant sur des modèles animaux similaires et sur la variabilité inter-individuelle, des lots de 8 animaux (groupes-tests vs. contrôles) sont nécessaires pour assurer la fiabilité de nos résultats, chaque expérience devant être répétée 3 fois. Le nombre d’animaux prévus correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations inter-expérimentales et les variations inter-individus.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), s’assurera de l’enrichissement de leur environnement et du respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). Lors des phases plus sévères (phase aigue de l’infection), l'expérimentateur vérifiera le poids et apportera une aide à l’alimentation quotidiennement (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)). Il/elle évaluera aussi l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation de la santé d’un animal atteignant les points limites d’arrêt de la procédure définis plus haut. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ces molécules sont connues pour interférer avec les processus inflammatoires et pourraient donc modifier les résultats de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique (buprénorphine) ont des propriétés immunomodulatrices.
Choix des espèces
T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte tenu des nombreux outils qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre l’hôte et Toxoplasma gondii. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’être humain : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite en cas d’immunosuppression, modifications comportementales.
Impact du procédé de fermentation sur l’allergénicité du gluten dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 500 souris femelles Balb/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées au gluten une fois par semaine pendant huit semaines, par injection dans l'abdomen ou par application sur la peau après provocation d'une inflammation cutanée. Un gavage déclenche ensuite la réaction allergique, avec chute de la température corporelle et douleurs stomacales attendues, la température étant relevée par voie rectale, et six prélèvements de sang sont faits au bout de la queue. Sur le remplacement, le porteur affirme que le modèle in vivo reste "irremplaçable" pour comparer les voies d'exposition et qualifie l'expérimentation animale d'"élément vital" du projet.
Objectifs
Les allergies sont répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. L’allergie au blé est l’une des allergies alimentaires les plus fréquentes, due principalement à un ensemble de protéines, nommé gluten. Le gluten est composé des allergènes majeurs de la céréale. Certaines études tentent de montrer l'intérêt des procédés de transformation dans la réduction des allergies. La fermentation appliquée lors de la fabrication du pain au levain peut engendrer une dégradation des protéines du gluten par certaines bactéries ou enzymes supposant ainsi une diminution de la réponse allergique. Cependant, le nombre d'études reste très limité. L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse allergique du gluten fermenté par une combinaison de bactéries lactiques, d'une levure ou d'une enzyme de grade alimentaire. En effet dans nos précédentes études, une bactérie et une enzyme ont été identifiées pour leur capacité à dégrader le gluten. L'influence de la voie d'exposition (percutanée ou intra-péritonéale) reste également largement à explorer. De ce fait, lors de ce projet, ces deux voies d'exposition sur le développement de l’allergie alimentaire au gluten sera évaluée. Pour cela, un examen approfondi des mécanismes immunologiques impliqués dans l’allergie au gluten et de l'influence du procédé de fermentation sera mené.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer l'impact du procédé de fermentation sur l'allergie au gluten. De ce fait, la réponse immunitaire précise sera élucidée pour chaque voie de sensibilisation (intra-péritonéale et percutanée). A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie du développement de l’allergie au gluten permettant d’améliorer la prise en charge des sujets atteints. Aussi, des solutions préventives pourront être proposées.
Procédures
Les souris seront sensibilisées 1 fois par semaine pendant 8 semaines par une injection intraperitonéale ou une application cutanée sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, 7 jours après la fin de la phase de sensibilisation. Pour une injection intrapéritonéale ou un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’injection ou d’administration (soit environ 10 secondes). Pour l’application cutanée sur l’abdomen ou le dépôt sur les narines, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie (soit 15 à 20 minutes). Toutes les souris auront également un prévèlement de 50 microlitres (3 à 4 gouttes de sang) à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 8) soit 6 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, les différents moyens de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances notamment en raison de la répétabilité des gestes (1 fois par semaine pendant 8 semaines). Les souris sensibilisées par voie percutanée pourront ressentir un inconfort abdominal suite à la réalisation d’une inflammation cutanée pour permettre le passage de l’allergène. Les sensibilisations réalisées par voie intra-péritonéale peuvent également provoquer une gêne abdominale au niveau du point d’injection. La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuissances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les organes pour analyse de la réponse immunologique et des marqueurs de l'allergie.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, dans le cas de l’étude de l’influence des différentes voies d'exposition, le modèle in vivo reste irremplaçable. Dans notre étude, les fermentas ont pu être testés sur un type de cellule mimant le processus de provocation, ces tests permettent de mettre en avant l'intérêt de certains échantillons. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, les allergies alimentaires sont caractérisées par des symptômes que seuls des modèles animaux, et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire. Ce projet présente enfin un réel intérêt dans la mesure où il modélise le développement de la réaction allergique au gluten et étudie l'impact d'un procédé de transformation.
Réduction
Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes et des tests statistiques, le nombre de souris a été déterminé à 20 souris par sous-groupe (hormis pour l'étude pilote, 10 souris par groupe seront utilisées). Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permettront de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 3 à 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi, une étude préliminaire sera effectuée sur un nombre de souris restreint par groupe (10 souris/groupe soit 20 souris au total), pour observer l'effet de l'application/d'injection de bactéries. Cela permettra d'affiner le protocole et la prise en charge de la douleur le cas échéant.
Choix des espèces
Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires (cellules spécifiques de l'allergie) seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et 4 semaines de vie au début des interventions. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune recevant dans la veine de la queue une injection de cellules sanguines humaines destinée à lui faire développer un système immunitaire humain. Celles de la phase de validation subissent des prélèvements de sang jusqu'à une fois par semaine et sont tuées quand les points limites sont atteints, entre quatre et douze semaines après l'injection. L'effet secondaire attendu est la maladie du greffon contre l'hôte, que le porteur décrit comme une réponse inflammatoire sévère avec altération de la peau, des organes et des poils, perte de poids et douleur. Les souris de la phase de production, elles, ne restent que deux à trois jours avant d'être expédiées à des partenaires académiques et industriels, le nombre produit correspondant au nombre commandé.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules du sang humain consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). En effet, ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée, mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. L’un des avantages de ce modèle est le développement rapide du système immunitaire chez son hôte et la multiplication des cellules d’intérêt capable de déclencher une réponse inflammatoire. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.
Procédures
Pour la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue et, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour la production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les souris vont être déplacées pour être envoyées en zone de production, ou lors du transport chez le partenaire. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Les souris recevront une injection dans la veine de la queue, ce qui pourra engendrer un bref stress et/ou douleur. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et au maximum une fois par semaine, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire lié à l’injection de cellules humaine du sang à la souris est l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant de graves lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire sévère (altération de la peau, des organes, des poils, perte de poids et douleur).
Devenir
Les animaux de la phase de validation seront mis à mort lorsque les points limites auront été atteints. Les animaux de la production seront expédiés.
Remplacement
Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes relatives au processus. Nous avons établi qu’un groupe d’un minimum de 60 souris sera planifié pour chaque modèle animal immunodéficient et scindé en deux groupes qui seront eux-mêmes divisés en 2 ou plusieurs sous-groupes pour tester les différentes quantités de cellules à injecter. Soit un nombre de 15 animaux par sous-groupe. Le nombre de souris à tester a été calculé en prenant en compte : • que le test devra être répété. • qu’il est possible que la greffe ne soit pas concluantes chez certains animaux. Deux paramètres nous permettrons de déterminer la quantité de cellules du sang humain à injecter la plus adaptée : • Le taux d'humanisation • Le temps d’apparition des points limites. Plus le temps d’apparition des points limites sera tardif et plus cela laissera du temps aux partenaires de faire ses études. Grâce aux résultats obtenus nous pourrons faire des analyses statistiques. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact d’un donneur sur l’humanisation. Grâce à la validation du protocole et à son optimisation pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine par modèle, nous réduirons d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris souhaitées. Pour la production, ce protocole sera exclusivement réalisé après réception d’une commande du partenaire afin de limiter le nombre d’animaux humanisés. Le nombre de souris produits correspondra donc au nombre de souris commandées.
Raffinement
Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7.5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois par semaine. L’apparition de la maladie du greffon chez les souris humanisées est également un point important. Les animaux seront donc observés quotidiennement et évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Pour un état observé dit « normal », les souris seront pesées 1 fois par semaine. Si l’état général de la souris se dégrade un examen clinique de la souris sera appliqué avec la mise en place d’une pesée plus régulière en fonction du développement de la maladie du greffon contre l’hôte. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, des l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. La souris est simple à élever, relativement peu coûteuse à reproduire, à entretenir en grand nombre et à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. La souris est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, sa courte gestation, de sa durée de vie et de la nécessité en réactifs expérimentaux en plus faibles quantités. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de souris génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la validation ou la production, les souris entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge jusqu’à l’atteinte des points limites pour la phase de validation, ce qui peut représenter plusieurs semaines après l’injection des cellules (entre 4 et 12 semaines post humanisation en fonction de la quantité de cellules injectées). Les souris de la phase de production entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge. Elles seront ensuite envoyées aux partenaires deux à trois jours après l’injection des cellules humaines. S’agissant d’un modèle pour des études à court terme avec un développement rapide de la maladie du greffon, nous choisissons d’envoyer rapidement les animaux afin qu’ils puissent commencer leurs protocoles expérimentaux le plus tôt possible.
Génération de truites IRF7-/- (Interferon Regulatory Factor) au moyen de l’édition du génome en vue de développer des vaccins de protection virale chez la truite
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privées de deux gènes de l'immunité par édition du génome, des truites arc-en-ciel doivent fournir à la filière truiticole des lignées cellulaires capables de multiplier des virus pour fabriquer des vaccins. 1 504 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur admet que cette perte d'immunité peut les faire souffrir si une infection se déclare. Quatre femelles matures subissent trois séances de pression abdominale, une par jour, pour en extraire les œufs, puis sont tuées parce que l'élevage de grandes truites coûte cher et que les installations ne permettent pas de les garder ensuite. Mille cinq cents alevins subissent un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour génotypage, ceux qui ne portent pas la mutation invalidante sont tués, et 125 homozygotes sont envoyés dans un autre laboratoire où des lignées cellulaires seront établies à partir de leurs cellules.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre, en les invalidant par modification structurelle ciblée, le rôle de deux gènes de l'immunité dans la réponse antivirale innée des poissons. Ce projet cherche à constituer un savoir théorique dont nous voulons qu’il conduise à des pratiques innovantes au service de la production piscicole. Un des objectifs pratiques de ce projet est d’isoler, à partir d’animaux n'ayant plus ces deux gènes, des lignées cellulaires tolérantes aux virus, ce qui permettrait leur réplication massive in vitro en vue de la production de vaccins antiviraux dont bénéficierait le cheptel truiticole.
Bénéfices attendus
Notre projet à pour finalité pratique de contribuer à l'éléboration de vaccins antiviraux en créant des lignées cellulaires génétiquement modifiées capables de propager des virus et donc les antigènes viraux nécessaires à la réponse vaccinale. Il conribuera aussi au dévelopement de méthode de diagnostic viral.
Procédures
Les femelles sexuellement matures (4 au total) subiront sous anesthésie des pressions abdominales afin d'extraire des oeufs qui seront injectés avec des ARNs guide et cas9. Chaque femelle subira 3 séances de pressions abdominales : une séance par jour pendant trois jours consécutifs. Une séance de pression abdominales ne dure jamais plus de trente secondes. Pour déterminer le génotype de chaque alevin (primo injectés, de premère et de seconde génération) un seul prélèvement mineur de la nageoire caudale sera effectué sous anesthésie.Cette opération classiquement réalisée lors d'un génotypage dure quelques secondes et l'alevin est immédiatement remis dans un bac de réveil et son comportement est observé.
Impact sur les animaux
Nous ne pouvons pas exclure que des mutations se produisent hors des deux gènes cibles et provoquent un phénotype dommageable sans rapport avec l'immunité. Ce risque est très limité car les sites potentiels de mutagénèse ont été choisis en raison de leur unicité dans le génome lequel est complètement séquencé chez la truite. Par ailleurs, il est possible que la privation des gènes cibles par génie génétique s’accompagne d’une altération de l’immunité qui conduise à une souffrance indésirable des poissons si une pathologie infectieuse se développe, malgré les mesures prophylactiques prises. En ce qui concerne l'anesthésie, elle est très courte : lorsque l'animal manifeste une perte totale d'équilibre et de réaction au toucher, il est rincé à l'eau d'élevage pour limiter la diffusion du produit et le stress physiologique qui pourrait l'accompagner. Le prélèvement d'un fragment de nageoire, qu'implique le génotypage, est réalisé sur un tissu non innervé, il n'y a donc pas de douleur directement liée à ce prélèvement. Enfin, l'isolement transitoire des alevins lors du génotypage peut être aussi un facteur de stress pour ces derniers. Nous limitons sa durée et mettons deux alevins dans un bac qu'une cloison transparente divise en deux compartiments ; de cette manière la perception visuelle d'un congénère est maintenue.
Devenir
les truites femelles sexuellement matures subissant le prélèvement des oeufs pour les fécondations in vitro seront euthanasiées. Ces truites seront euthanasiées parce que le coût d'élévage de truites de grande taille (adulte) est élevé et parce que nos structures d'élevage sont trop modestes pour permettre une stabulation des animaux post-expérimentation. Les alevins issus des oeufs injectés et qui ne présentent pas de mutation invalidante seront également euthanasiés selon les procédures en vigueur. Les animaux F0 et les 4 lignées ( première et deuxième génération) sont gardés seulement le temps prévu pour ce projet ; après quoi ils seront également euthanasiées sauf ~ 125 animaux (homozygotes pour une mutation invalidante) qui seront envoyés dans un autre laboratoire pour l'établissement de lignées cellulaires.
Remplacement
L'étude fonctionnelle "systémique" d'un gène par invalidation ou modification ciblée de celui-ci ne peut se faire que sur des organismes entiers . Un modèle cellulaire ferait par trop abstraction des régulations supracellulaires (interactions cellulaires multiples) et supratissulaires (regulations endocrines...)
Réduction
Réduire : les effectifs (femelles sexuellement matures, embryons injectés et alevins génotypés) sont réduits au maximum pour obtenir 2X 2 lignés F2 distinctes (i.e. présentant des mutations différentes) pour les deux gènes étudiés. Ainsi nous utiliserons seulement 4 femelles ovulantes dont chacune servira à l'obtention de trois pontes successives. De plus nous comptons limiter le pool de sauvegarde des F0 mutants à partir duquel seront générées les lignés F2 à seulement10 individus.
Raffinement
Les animaux seront toujours élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Le prélèvement des oeufs se fera sous anesthésie selon une procédure établie et approuvée. Si des animaux (F0, F1 ou F2) devaient présenter une anomalie morphologique ou comportementale alors ils seraient immédiatement mis à mort selon les procédures d’euthanasie en vigueur. Par ailleurs les animaux modifiés par édition du génome (F0, F1 et F2) sont placés dans un milieu enrichi artificiellement qui mime l'environnement naturel notamment en plaçant des leurres végétaux.
Choix des espèces
La truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l'élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture. L'espèce est grégaire et supporte des densités d'élevage importantes. Il s'agit en outre d'une espèce d'intérêt agronomique représentant 95 % de la production piscicole française. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Plus spécifiquement notre intention est de produire des antigènes viraux dans des lignées cellulaire en vue de la fabrication de préparations vaccinales. Il va de soi que cette entreprise n'est possible que dans des cellules specifiquement permissives à l'infectivité, donc des cellules de truites. La production des oeufs se fera à partir de femelles (4) sexuellement matures et ovulantes. ces oeufs après fécondation, seront injectés avec les outils moléculaires réalisant les modifications génétiques désirées. Le génotypage se fera sur des alevins dérivant d'oeufs injectés (500), de première génération (500) et de seconde génération (500).
SALIVE Activités des protéines salivaires de triatomes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
264 souris femelles vont être utilisées, chacune pour une seule injection de dix microlitres sous la peau et une survie de deux ou six heures. La moitié est tuée au bout de deux heures, l'autre au bout de six, pour prélever la peau et les ganglions lymphatiques, un carré de peau d'un centimètre carré ayant été rasé la veille. Le produit injecté contient des protéines de la salive du triatome, un insecte suceur de sang vecteur de la maladie de Chagas, dont le porteur veut mesurer les effets anti-inflammatoires et anticoagulants dans la peau. Il n'exclut pas une réaction proche d'une réaction allergique, et son raffinement se réduit à l'hébergement enrichi, à la surveillance quotidienne et à des points limites qu'il ne nomme pas.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'évaluer les activités antiinflammatoires/immuno-régulatrices/anticoagulantes de protéines de la salive des triatomes dans la peau de souris.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure connaissance des activités pharmacologiques, anticoagulantes, antiinflammatoires et immunitaire de la salive de l'insecte hématophage (qui se nourrit de sang) Rhodnius sp. responsable de la transmission de Trypanosoma cruzi, agent de la maladie de Chagas. Ceci pourra contribuer à proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter le passage de T. cruzi chez l'homme.
Procédures
Une injection de moins d'1 seconde sous cutanée unique de 10µl de sérum physiologique contenant des protéines salivaires de triatome, d’histamine ou de sérum physiologique sera réalisée sur souris vigile. La moitié des animaux sera euthanasiée après 2 heures, l’autre moitié après 6 heures pour prélèvement et analyse des tissus d’intérêt (peau et ganglions lymphatiques). Une surface de 1 cm2 de peau sera rasée 24h avant l’inoculation pour faciliter le prélèvement des tissus. Un total de 264 animaux sera utilisé.
Impact sur les animaux
Bien que nous nous attendions à avoir des activités fortement anti-inflammatoires, nous ne pouvons pas exclure une réaction inflammatoire précoce associée à des cellules immunitaires (comme des mastocytes et des éosinophiles) qui pourrait s'apparenter à une réaction allergique. Le suivi de l'expérience étant au maximum de 6h, une surveillance constante des animaux au cours de la procédure sera réalisée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour prélèvement histologique (peau et ganglion) et analyse cellulaire
Remplacement
Le recours aux animaux se justifie dans la mesure où il n'existe actuellement aucun autre modèle alternatif permettant d’étudier la réponse immunitaire de façon physiologique. Les études physiologiques portant sur des informations immunitaires complexes et interdépendantes ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré.
Réduction
Le nombre de souris (264) avec 12 animaux par sous-groupe est déterminé de façon à avoir une puissance statistique suffisante pour valider le résultat observé (6 groupes, 2 doses, 2 temps). 264 souris : (12 souris x 5 groupes test x 2 concentrations x 2 temps) + (12 souris x 1 groupe contrôle x 2 temps) Seules des souris femelles seront utilisées pour 1/ pour faciliter l'hébergement 2/ pour comparer aux données internes toutes produites sur femelles. Une analyse statistique multifactorielle ad hoc ser a réalisée
Raffinement
Les souris sont dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, nourriture, enrichissement, température et cycle jour/nuit). Entre autres, elles seront hébergées dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Une surveillance journalière des animaux est réalisée par un personnel compétent qui connait bien cette espèce. Les points limites établis seront suivis
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont ainsi permis d’identifier et de caractériser de nombreux mécanismes immunitaires. Tous les protocoles immunohistologiques utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris. Des souris femelles au stade adulte seront analysées, pour avoir un système immunitaire complètement fonctionnel.
Elevage d’une lignée murine modèle de cancer du tissu mammaire au phenotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt-quatre naissances par mois pendant cinq ans, soit 1 440 souris produites par quatre cages d'accouplement maintenues en continu : cet élevage transmet à la moitié des animaux, 720 individus, un transgène qui leur fait développer spontanément des tumeurs mammaires. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, ce qui couvre la biopsie de queue avant quatorze jours et la goutte de sang prélevée par poinçon de joue à trente jours, sans couvrir le développement tumoral lui-même, que le porteur décrit comme pouvant provoquer douleurs, dégradation physique et mort. La tumeur est palpée puis mesurée une fois par semaine à partir de cinq mois, et l'animal est tué lorsqu'elle atteint un centimètre cube. Les animaux non tués rejoignent d'autres projets en utilisation continue, 144 environ étant tués parce que leur génotype ne convient à aucun protocole ou parce qu'ils ont fini de reproduire, et le porteur affirme que les souris transgéniques sont "l'unique moyen" de suivre les cellules qui l'intéressent dans un "organisme entier".
Objectifs
Le programme de travail repose sur l’observation fondamentale que les cellules myéloïdes, une population du système immunitaire, sont impliquées dans le développement tumoral et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. L'étude de l'impact des thérapies conventionnelles ainsi que les nouvelles immunothérapies sur ces populations de macrophages sont nécessaires pour comprendre comment ces populations interviennent dans les résistances à ces thérapies et donc à la rechute tumorale. La complexité des interactions cellulaires intervenant dans ces processus nécessite l'utilisation de modèles animaux developpant des cancers de manière relativement controlée mais le plus proche de ce que l'on peut observer chez l'homme.
Bénéfices attendus
Le cancer du sein touche plus de 2 millions de femmes dans le monde avec 670.000 décès recensés en 2022. Il touche les femmes sans distinction d'âge et représente donc un enjeu de santé publique majeur. Le besoin de recherche scientifique sur ce cancer est nécessaire. Comprendre le rôle des macrophages dans le developement des cancers et la resistance aux thérapie anti-cancéreuses (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapies) est capitale. Ces thérapies sont actuellement les seules armes que nous possédons pour traiter les patients et pourtant dans encore trop de cas ces thérapies ne font que prolonger la durée de vie et souffrent d'effet secondaires très lourds. Le modèle de souris utilisé est un modèle qui reproduit de façon relativement fidèle, les différents stades de cancer du sein que l'on peut observer chez l'homme. C'est donc un modèle très utile pour tester et developper de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
En raison du developpement pontanée de tumeur de nos modèles transgéniques, nous réaliserons un suivi de croissance tumorale par palpation puis avec pied à coulisse sur animal vigile 1 fois par semaine à partir de 5 mois d'àge : 1min par animal pour mesure de la masse tumorale. Pour assurer l’identification génétique de nos animaux, les animaux subiront une biopsie au niveau de la queue avant 14 jours d'âge - 1 min par animal et un prelevement de sang 1 goutte par poinçon de joue à 30 jours d'âge - 2min par animal sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une biopsie de l’extrémité de la queue et un prélèvement de sang (quelques gouttes) pour génotypage. Ces gestes peuvent engendrer des douleurs légères de courte durée et un stress chez l’animal. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer un hématome dans de rare cas. Les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs mammaires. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs et un developpement tumoral pouvant provoquer la mort.
Devenir
Les animaux produit par cet elevage seront utilisés dans le cadre de projet en cours et futurs dans le cadre d'une utilisation continue. Dans quelques cas (animaux du mauvais génotype ne pouvant pas être inclus dans un autre projet de recherche et anciens reproducteurs), les animaux seront euthanasiés. Evalué à 10 pourcent soit 144 animaux
Remplacement
Le modèle animal de cancer du sein permet d'apprehender la complexité des interactions entre les macrophages et l'environnement tumoral en réponse aux thérapies. L'utilisation d'animaux est donc nécessaire. Cependant nous utilisons dans certains cas ce modèle pour des expériences de cocultures in vitro des cellules tumorales, permettant de tester plusieurs conditions à partir d'un seul animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet elevage, nous faisons particulièrement attention aux génotypes des parents afin qu'un maximum des descendants ait le bon genotype. Nous controlons le nombre de couple afin de ne pas générer d'excédent de stock. Les animaux dont le genotype ne correspond pas sont dans la plupart des cas utilisés dans le cadre d'autres projets déclarés afin de ne pas produire d'animaux inutilement. Cette utilisation rentre dans le cadre d'une utilisation continue. Dans l'ensemble 4 cages d'accouplement sont maintenues en continue. A raison d'une porté de 6 par mois, ceci represente au mieux 24 animaux par mois soit sur 5 ans un elevage de 1440 animaux. La présence du transgène chez la femelle induit un phénotype dommageable amplifié par la gestation et donc l’atteinte des points limites (taille de tumeur) ne permet pas d’aboutir jusqu’à la délivrance et sevrage de la descendance. Ainsi, les accouplements se feront uniquement avec des males heterozygote pour le transgène au phenotype dommageable, le genotype dommageable ne touchera que 720 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les animaux sont hébergés conformément à la réglementation avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 6 animaux par cages. Chaque cage contient au moins deux éléments d'enrichissement : nid en carton et bâton à ronger. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. Ce modèle tumoral est sans risque infectieux. Nous mettons en place un point limite et la surveillance de ces derniers dont les critères limite considérablement l'emergence de signe de souffrance liés au developement de la tumeur. En effet, un suivi de la charge tumorale 1 fois par semaine à partir de 5 mois d'âge est mis en place. Lorsque la tumeur atteint 1cm3 critère point limite, l'animal en elevage est euthanasié. Pour diminuer le stress, les conditions globales d'hébergement des animaux ne changent pas outre des conditions de raffinement supplémentaires si necessaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort indépendante du contexte tumoral sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés
Choix des espèces
Nous étudions la mobilisation d'un grand nombre de cellules immunitaires à travers les tissus et l'impact de drogues anti-tumorales sur l'organisme entier. Les souris transgéniques utilisées sont l'unique moyen d'obtenir les outils permettant de tracker les cellules d'intérêts par des techniques d'imagerie dans le modèle de tumeur mammaire spontanné Les animaux sont utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour le génotypage, 1 mois de vie pour le prélèvement sanguin puis dans ce modèle, les tumeurs deviennent palpable entre 6 et 12 mois d’âge.
Etude de l’effet de dérivés d’hormones sexuelles sur l’inflammation
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans la veine de la queue et une sonde de température implantée sous la peau, 48 subissent une prise de sang sous anesthésie et 133 une prise de sang terminale. Le traitement doit déclencher une inflammation générale et de la fièvre, pour tester si des dérivés d'hormones sexuelles provoquent les crises de la fièvre méditerranéenne familiale, dont les mécanismes restent inconnus. Le porteur écrit que l'analyse in vivo est "indispensable" et que la réponse aux hormones sexuelles n'est modélisable ni en culture cellulaire ni en organoïde, d'où son intérêt pour un "organisme entier".
Objectifs
La pyrine est un composant de l’immunité. Des mutations sur la protéine pyrine causent des maladies inflammatoires, dont la fièvre méditerranéenne familiale. La fièvre Méditerranéenne familiale se caractérise par des épisodes qui se répètent dans le temps de douleur abdominale intense liée à des phénomènes d’inflammation. A ce jour, les mécanismes responsables de ces flambées inflammatoires chez les patients demeurent inconnus. Certaines hormones sexuelles seraient capables de déclencher les crises inflammatoires. Le but de ce projet est de tester cette hypothèse dans un modèle murin où l'inflammation sera suivie dans le temps.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de l'immunité) et cliniques (thérapies pour lutter contre les flambées inflammatoires des patients).
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse, qui durera 30 secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée, qui durera 30 secondes d'une sonde de température. 48 animaux subiront une prise de sang sous anesthésie, l'intervention durera 2minutes environ. 133 animaux subiront une prise de sang terminale sous anesthésie sans réveil, l'intervention durera 5minutes environ.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles ; prélèvements de sang sous anesthésie ; mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Les traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires (baisse de température, anesthésie) et une inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre.
Devenir
Procédure 1 : réutilisation des animaux lors de la procédure 2. Procédure 2 : Euthanasie des animaux pour réaliser une deuxième prise de sang (terminale) chez les même animaux (réduction du nombre d’animaux utilisés) Procédure 3 : euthanasie des animaux (prise de sang terminale)
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle pertinence clinique. La réponse physiologique aux hormones sexuelles n’est pas modélisable in vitro, ni dans de systèmes plus évolués tels que les cultures tridimensionnelles ou organoïdes. D’où l’intérêt de travailler sur un organisme entier, sur lequel il est possible d’étudier la réponse inflammatoire globale de l'organisme.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Une réutilisation des animaux est prévue suite à la première procédure pour réduire le nombre d'animaux du projet. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Utilisation d'implants avec une transmission du signal pour prendre la température à distance sans introduction anale répétée 4) Minimisation de la fréquence de manipulation 5) Les animaux dont la température diminue seront placés dans des cages sur portoirs chauffants. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo), avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain (vertébré Mammifère). La souris en est un modèle idéal du fait des outils disponibles pour suivre l'inflammation et de la possibilité de manipulation génétique qui permet de mieux comprendre les mécanismes. Les expériences débuteront à l’âge de 6-8 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature. L’âge des animaux sera de 8-10 semaines maximum en fin de procédure expérimentale.
Etude de l’immunosénescence au cours de l’Insuffisance rénale aigue
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 480 un niveau modéré. Une insuffisance rénale aiguë leur est provoquée, soit par des injections dans chaque patte répétées jusqu'à trois fois, soit par une chirurgie en deux temps espacés d'une semaine, soit par l'injection d'une substance dans l'abdomen, avec une boiterie possible pendant vingt-quatre heures. Elles passent ensuite quarante-cinq minutes sous anesthésie, un capteur fixé sur le dos, pour la mesure de leur fonction rénale. Le porteur justifie le choix de la souris par le nombre de données déjà publiées et par la disponibilité de lignées mutantes, et écrit que cette espèce "permet d'utiliser le moins d'animaux possible" pour atteindre les objectifs du projet.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë (IRA) est une pathologie fréquente et grave, en partie à cause de son association avec une augmentation de la mortalité à court et à long terme et un risque accru de développer une insuffisance rénale chronique (IRC). Actuellement, il n'existe pas de traitement pour l’IRA, au-delà de la thérapie de remplacement rénal et de l'espoir d’une guérison spontanée. L'incidence de l'IRA ainsi que la mortalité associée augmentent fortement avec l'âge. Il a été montré que l’immunosénescence, qui fait référence aux changements du système immunitaire induits par le vieillissement, était accélérée chez les patients atteints de IRC. Nous avançons l’hypothèse que l’immunosénescence survient également au cours de l'IRA et que sa détection précoce et son contrôle ont un impact sur le pronostic rénal. Nos objectifs sont donc d’étudier, chez l’animal la présence de cellules immunitaires sénescentes pendant l'IRA et de déterminer si un blocage des processus d’immunosénescence peut réduire l’IRA et empêcher sa transition vers la MRC.
Bénéfices attendus
L'insuffisance rénale aiguë est une pathologie fréquente et grave, qui concerne 13.3 millions de personnes dans le monde, et est responsable de 1.7 millions de décès par an. Avec le vieillissement de la population, l'incidence augmente chaque année, engendrant des coûts élevés, une mortalité importante, et une détérioration de la qualité de vie, surtout pour les patients qui vont évoluer vers l'insuffisance rénale chronique. En cas d'IRC sévère, le recours à la dialyse est nécessaire de manière inexorable et définitive pour les patients âgés non éligibles à la greffe rénale. Ainsi, toute identification de nouveaux mécanismes permettant d'atténuer l'IRA ou son évolution vers l'IRC aura un fort impact en termes de santé publique et individuelle. A ce jour il n'y a pas de traitement préventif de la transition IRA vers IRC, en particulier chez le sujet âgé. Ce projet apporte l'espoir de pouvoir freiner l'insuffisance rénale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une insuffisance rénale aigue soit par injection intramusculaire (une injection dans chaque patte, répétée au maximum 3 fois par animal, durée maximale de 10 secondes par injection sous anesthésie gazeuse et analgésie), soit par intervention chirurgicale (sous anesthésie gazeuse et analgésie), soit par injection intrapéritonéale de drogue (durée maximale de 10 secondes).. Dans une procédure, les animaux seront soumis à une chirurgie qui se déroule en deux étapes opératoires séparée de 1 semaine, sous anesthésie gazeuse et analgésie, chaque intervention dure 15 à 20 minutes. Tous les animaux seront soumis à des mesures de leur fonction rénale (2 à 3 mesures par animal) : sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée. Les prélèvements de sang à la queue seront faits sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Lors des interventions chirurgicales, les animaux peuvent ressentir du stress, l'anesthésie est associée à une analgésie pour pallier aux douleur pour pallier aux douleurs de l’intervention. Des complications chirurgicales sont possibles et surveilllées. Stress possible lors des injections de substance. Boiterie possible pendant 24h dans une des procédures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est justifié par le fait qu’une insuffisance rénale aiguë est une pathologie complexe, impliquant différents compartiments cellulaires (épithélium, vaisseaux, cellules immunitaires…), impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (Ex : cultures cellulaires).
Réduction
Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 520 souris. Nous utilisons une technique de bologie moléculaire très sensible permettant de réduire le nombre d’animaux utilisé car la variabilité des résultats est faible.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et des points limites ont été définis. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Rôles de l’interleukine-1beta (IL-1β) en conditions physiopathologiques.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Perte de poids continue, prostration, poils ébouriffés, arrêt de l'alimentation : ces seuils déclenchent la mise à mort des souris qui les atteignent. 8 704 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées pour prélever leurs organes, 3 456 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 5 248 un niveau modéré. Elles reçoivent des injections, subissent des chirurgies d'environ quarante minutes, passent une demi-heure en imagerie et enchaînent des tests comportementaux quotidiens de cinq minutes pendant une semaine, certains composés provoquant des crises de type épileptique que le porteur décrit comme douloureuses. Dans la partie du projet consacrée à l'inflammation, il écrit qu'il n'est pas possible d'administrer des analgésiques sans modifier les résultats expérimentaux.
Objectifs
I'interleukine (IL1) est une molécule essentielle dans l’initiation de l’inflammation suite à une infection ou une lésion. Cette molécule est en outre impliquée dans le développement de nombreuses pathologies comme l’arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le diabète de type 2 et contribue au développement de maladies de type auto-inflammatoire. De nombreuses études suggèrent également que cette molécule modulerait de nombreux processus physiologiques ou pathologiques comme la mémoire ou la douleur. Cependant, en l’absence d’outils pertinents permettant d’étudier cette cytokine dans le temps et dans l’espace, les rôles précis de l'IL1 secrétée par différents types cellulaires selon le contexte physiopathologique ne sont pas connus ou controversés. Notre équipe a récemment développé un modèle de souris exprimant un capteur de l’IL1 qui émet de la lumière. Cette souris ‘2 en 1’ permet 1/soit de visualiser chez l’animal de façon spatiale et temporelle la production d’IL1 par mesure de la luminescence, 2/ soit d’inactiver spécifiquement la synthèse de l’IL1 dans un type cellulaire donné. Basé sur ce modèle murin innovant, ce projet a pour but de déterminer précisément le rôle de l’IL1 et les voies de signalisation cellulaire gouvernant sa libération, dans différents contextes physiologiques et pathologiques. A terme, ce projet devrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de différentes pathologies impliquant l’IL1. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices espérés du projet sont multiples : Il est attendu une meilleure compréhension du rôle de l’ IL1 dans divers contextes physiopatholoqiues et ainsi proposer de nouvelles pistes therapeutiques ciblant l’inflammation. Plus précisément, grâce à l’utilisation d’animaux exprimant un capteur de l’ IL1, nous pourrons définir précisément la provenance de cette molécule et la signalisation cellulaire associée à sa libération. De plus, l’invalidation génique de l’IL1 dans un type cellulaire donné nous permettra d’évaluer spécifiquement la contribution de l’ IL1 dans le développement de l’inflammation, des douleurs associées et des comorbidités anxio-dépressives.
Procédures
L'ensemble des animaux recevront des injections, des chirurgies et feront des tests comportementaux. Dans l'EU1, les expériences d'injection, de chirurgies et de tests comportementaux seront réalisés. Dans l'EU2, l'imagerie des animaux sera réalisée ainsi que des injections. Les tests comportementaux permettront de déterminer les troubles des fonctions motrices et cérébrales. Les animaux seront gardés en vie deux mois, le reste des animaux sera gardé en vie au maximum 15 jours après l'induction de l'inflammation. Les test comportementaux ont une durée de 5 minutes quotidiennes, pendant une semaine. Les chirurgies ont une durée d'environ 40 minutes. L'imagerie des animaux dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Des douleurs légères des injections par piqure, des douleurs à prendre en charge pendant et après des chirurgies. Des composés vont induire des crises de type épilepsie qui sont douloureuses pour les animaux. Les tests de comportement vont induire un stress modéré dans certaines conditions.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur l’utilisation d’un modèle murin unique et innovant permettant de suivre précisément dans le temps et dans tout l’organisme l’expression d’une molécule pro-inflammatoire. Il permettra également de ne plus avoir l'expression, spécifiquement dans un type cellulaire donné, de cette interleukine afin de definir de nouvelles pistes therapeutiques. Il n’est donc pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. Enfin, notre projet s’appuie sur différents tests comportementaux chez l’animal ainsi que l’obtention d’organes pour en étudier les caractéristiques histologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinents. L’avantage de notre souris exprimant le capteur de l’IL1 est la réutilisation possible d’un même animal pour un suivi longitudinal, notamment lors de la mesure de bioluminescence in vivo à différents temps, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans les mécanismes inflammatoires. Les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Les tests comportementaux et l’analyse des tissus seront effectués sur les mêmes animaux afin d‘en réduire le nombre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation du logiciel G Power (ver 3.4.10) approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. La taille de chacun des lots d’animaux à générer pour ce projet a été calculée sur la base de tests paramétriques permettant de détecter une différence significative sur la base d’un risque d’erreur α fixé à 5% et une puissance de 0.80.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive; prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement (adminstration d’antalgiques ou analgesiques) s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l'euthanasie de l’animal. Dans la partie de notre projet s’intéressant à l’inflammation dans différents contextes inflammatoires, il n’est pas possible d’utiliser des analgésiques ou des antalgiques afin de ne pas modifier les résultats expérimentaux. Pour le transport des animaux, nous suivrons la procédure validée par le réseau des animaleries de Montpellier, après demande d'autorisation auprès du vétérinaire et de la direction départementale de la protection des populations. Nous ajoutons à la litière des frisottis et/ou des buchettes en bois, des aliments et du gel hydrique.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu dans la caractérisation des mécanismes sous-tendant l’inflammation. Ce modèle permet également l'utilisation de souris invalidées pour nos cibles d'intérêt ou exprimant des biosenseurs, ce qui permet de facilement considérer les rôles et fonctions de différentes protéines. De plus, les études précédentes de référence ont été réalisées sur des souris, ce qui permet de se baser et de comparer directement les résultats qui seront obtenus Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 2 et 6 mois), ce qui permet de s’affranchir des effets développementaux et de senescence.
Le role des macrophages périvasculaires dans le drainage cérébral : effets sur les maladies neurodégénératives.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
1 036 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une seule injection dans le cou, de dix minutes, et le porteur qualifie les nuisances attendues de "très minimes" tout en signalant que les souris de la lignée APP/PS1 peuvent mourir prématurément du fait de leur phénotype dommageable. Certaines sont suivies jusqu'à 700 ou 800 jours d'âge pour observer les macrophages périvasculaires aux stades avancés, l'objectif déclaré étant de comprendre comment ces cellules participent à l'accumulation des plaques amyloïdes de la maladie d'Alzheimer. Le porteur justifie l'usage de la souris par le fait que ces macrophages n'ont été décrits que chez les rongeurs, ce qui exclut selon lui les espèces non couvertes par la réglementation comme le nématode ou la drosophile.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer, c'est quand le cerveau accumule une sorte de déchet appelé "plaque amyloïde". Cela se produit car le cerveau a des problèmes pour se débarrasser de ces déchets, ce qui fait qu'ils s'agglutinent et se déposent. On a découvert que des cellules spéciales appelées macrophages, qui normalement aident à nettoyer ces déchets, peuvent être en partie responsables de ce problème. Ils sont comme des éboueurs, mais dans ce cas, ils semblent avoir du mal à faire leur travail correctement. Notre idée, c'est de comprendre exactement comment ces cellules contribuent à la maladie d'Alzheimer, depuis le tout début jusqu'aux stades avancés. On pense qu'en comprenant mieux leur rôle, on pourrait trouver des moyens de les aider à mieux faire leur travail et ainsi empêcher l'accumulation de ces déchets. Pour cela, on va : 1. Regarder de près comment ces cellules et les plaques se développent ensemble dans le cerveau au fil du temps. On veut aussi voir quand ces cellules commencent à mal fonctionner. 2. Essayer de comprendre comment ces cellules fonctionnent au niveau moléculaire. Cela pourrait nous donner des indices sur ce qui déclenche et aggrave la maladie. On espère aussi trouver des signes qui pourraient nous aider à détecter la maladie plus tôt. 3. En comprenant mieux le rôle de ces cellules dans le nettoyage du cerveau, on espère pouvoir restaurer cette fonction chez les personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. Pour nos recherches, on dispose de modèles de souris qui reproduisent certains aspects de la maladie d'Alzheimer. Cela nous permettra d'étudier ces cellules et de tester des idées pour voir si elles pourraient aider à ralentir la progression de la maladie. Si nos découvertes sont fructueuses, cela pourrait ouvrir la porte à de nouveaux traitements pour la maladie d'Alzheimer et d'autres maladies du cerveau, ce qui pourrait aider à retarder leur évolution.
Bénéfices attendus
La maladie d'Alzheimer est causée par un problème de nettoyage du cerveau, mais on ne comprend pas encore très bien comment cela se produit. Avec notre recherche, nous espérons : 1. Mieux comprendre comment les macrophages périvasculaires agissent dans le cerveau. 2. Découvrir le rôle spécifique des macrophages périvasculaires dans le nettoyage des plaques amyloïdes dans le cerveau. 3. Trouver de nouvelles idées pour traiter la maladie d'Alzheimer, en plus des traitements actuels.
Procédures
Les animaux auront des injections au niveau du cou. Chaque souris subira une seule injection de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront très minimes. Cependant, il est possible que les animaux soient stressés suite à leur contention et aux injections. Ils pourront donc être sujets à des fluctuations de poids et présenter une douleur locale au niveau du site d’injection, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. De plus, les souris de la lignée APP/PS1 peuvent être sujette à une mort prématurée, entrainant leur phénotype dommageable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures dans le but de prélever les organes (cerveaux, méninges et moelle épinière) pour des études post-mortem.
Remplacement
Ce projet nécessite l’étude de macrophages dans leur contexte environnemental et dans leur tissue natif. L’étude in-vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de leurs rôles, alors il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale. Etant donné que ces macrophages sont décrits seulement chez les rongeurs, l’utilisation des modèles animaux qui ne sont pas soumis à une règlementation comme c elegans, drosophila melanogaster, etc ; n’est pas possible.
Réduction
Sur la base de notre expérience, le nombre est calculé au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.
Raffinement
Toutes les expériences sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. De plus, les animaux seront suivis à l’aide d’une grille de score, des relevés de poids seront réalisés et des points limites précoces seront établis pour prendre en charge rapidement toute douleur ou mal être observé. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les macrophages périvasculaires avant et après le déclenchement de la maladie d’Alzheimer. Ceci nécessite l’utilisation de souris du stage jeune (âge 22 jours), jeune adulte (âge 60 jours) jusqu’au stade adulte très avancé (âge 700-800 jours). Nos données suggèrent que le pic de présence des macrophages périvasculaires est aux alentours de 22 jours et que les macrophages périvasculaires sont altérés chez les souris APP/PS1 très agées. Nos données suggèrent également que le défaut de drainage observé chez nos souris est maximal à 4 mois.