Système immunitaire

Pour mettre au point un vaccin contre le papillomavirus et les cancers qu'il provoque, 695 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de 20 000 cellules tumorales sous la peau, puis subit des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux ou trois jours et jusqu'à huit prélèvements sanguins submandibulaires sur animal vigile. Le porteur décrit une tumeur qui se développe sous la peau sans toucher les organes internes, tout en prévoyant le cas d'un échappement métastatique provoquant perte d'appétit, amaigrissement, agressivité et isolement. Deux points limites sont annoncés, la nécrose de la tumeur et sa taille quand elle gêne la mobilité de l'animal, avec une surveillance tous les deux ou trois jours à partir du vingtième jour après la greffe.

Objectifs

Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle (d’une étude pré-clinique vers une évaluation clinique) pour déterminer le meilleur protocole de vaccination contre le papilloma virus et contre les cancers en dérivant. Pour cela, différents paramètres vont être affinés : les voies d’injection, la nécessité d’utiliser ou non un adjuvant et la fréquence d’administration du vaccin. Enfin dans le cadre de l’effet anti-tumoral, l’efficacité de cette vaccination sera testée en prophylaxie, mais également en thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet est dans la continuité d’études préexistantes utilisant une technologie particulière pour la vaccination. Le vaccin est un anticorps qui cible des cellules importantes dans la mise en place d’une réponse immunitaire vaccinale. Ce type de vaccin a démontré une bonne efficacité pour d’autres pathologies. Pour certains de ces pathogènes, ce vaccin a permis de générer une réponse immunitaire mémoire protectrice. Cette étude nous permettra d’étudier les réponses immunitaires mémoires générées, et en particulier ces cellules avec un plus haut degré de protection. Bien sûr, de manière plus large, ce projet vise à introduire un nouveau type de vaccin contre le Papillomavirus Humain avec des propriétés thérapeutiques anti-tumorales. Ce type de vaccin cible des populations plus vulnérables dans les pays en voie de développement qui ont une faible couverture vaccinale, associée à un système de prévention et de diagnostic non optimal.

Procédures

Dans ces procédures, les vaccins sont injectés à des moments précis selon la procédure impliquée. Ces injections ne durent que quelques secondes, sur des animaux sous anesthésies, et selon un volume en adéquation avec les limites autorisées ne dépassant pas 50µl. Des prélèvements périodiques de sang sont pratiqués sur les souris au cours des procédures. Il s'agit d'un prélèvement submandibulaire à Jour 0, 8, 15, 21, 28 et 35. (Dans le cadre des expérimentations sur 90 jours, deux autres points de prélèvement sont effectués, à jour 60 et 90). Ces prélèvements ne durent que quelques secondes également, et sont pratiqués avec une fine aiguille sur animaux vigiles. Sur les procédures de croissance tumorale, une greffe de cellules tumorales est effectuée. Les cellules tumorales sont injectées par une seringue avec une fine aiguille. La greffe se fait en sous cutanée, le geste durant 10 à 20 secondes sur animaux vigiles. Enfin la mesure des tumeurs se fait de manière périodique (2-3 jours) par l’intermédiaire d’un pied à coulisse. La mesure dure 30 secondes sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris impliquées seulement dans la procédure de vaccination ne subissent pas de nuisances ou d’effets indésirables lourds, outre les injections répétées du vaccin. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. En revanche, les animaux impliqués dans les procédures de croissance tumorale sont greffés avec des cellules tumorales via une injection sous-cutanée. Cette greffe produit des lésions cutanées tumorales, puis le développement d’une tumeur. La croissance tumorale est cependant contrôlée à la fois par la quantité de cellules injectées et par la cinétique expérimentale associée à cette dose. La dose de cellules tumorales injectée est de 20 000 cellules, elle a été définie au sein d’un laboratoire partenaire et a fait l’objet d’une publication. La tumeur se développe sous la peau, les organes internes de l’animal ne sont pas touchés. Le mal-être de l’animal issu d’une défaillance d’organes ne peut donc pas être atteint, excepté en cas d’échappement métastatique. Dans ce cas des métastases se forment dans les organes internes de l’animal provoquant des changements physiologiques comme « perte d’appétit » (sans aucun autre signe clinique) et « amaigrissement », puis des changements comportementaux comme « agressivité » et « isolement ». Des nuisances ou effets indésirables apparaissent en fin de cinétique au niveau de la tumeur avec notamment l’apparition de parties nécrosées au sein de la tumeur et sa taille pouvant gêner la mobilité de l’animal. Ces deux points sont alors des points limites expérimentaux.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la mise en place de la réponse immunitaire (multi-cellulaires et multi-organes), et de la relation entre le système immunitaire et la tumeur, notamment à cause des différents organes et types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles expérimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la solution de référence pour étudier l’effet du vaccin anti-CD40.E6-E7.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient significatifs. Ce nombre, impliquant tous les groupes des trois procédures, est estimé à 695 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique validée et couramment utilisée dans ce cadre.

Raffinement

Pour les stratégies de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait après échappement métastatique sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille à partir du vingtième jour après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille ne doivent pas apparaitre sur l’ensemble de la cinétique expérimentale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort.

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’Homme. De plus, les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires importantes qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation et mécanismes impliqués dans les effets observés. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et qui présentent donc une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 6-12 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.

Reçues à l'animalerie à douze mois et gardées jusqu'à vingt-deux, une partie des souris attend dix mois avant d'être infectée, un vieillissement en cage que le porteur associe lui-même à de l'alopécie, à de l'hypothermie et à des blessures de combat. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Chacune reçoit trois administrations sublinguales ou trois inoculations nasales sous anesthésie, des injections sous la peau ou dans le muscle, un prélèvement de sang à l'œil, puis le virus de la grippe, la perte de poids qui suit servant à mesurer l'efficacité vaccinale. Le porteur présente ces souris comme un passage obligé "avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l'humain", nommément le primate non humain.

Objectifs

Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée du virus de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après un rappel de vaccination par voie sublinguale, sur des animaux jeunes et âgés. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. Tous les animaux du projet seront infectés par le virus de la grippe afin de comparer l’efficacité de notre candidat sublingual avec un vaccin commercial de référence. Un suivi du poids après l’infection sera effectué afin de mesurer l’efficacité de notre candidat vaccin sublingual. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement l’évaluation de l’efficacité vaccinale d’un candidat administré par voie sublinguale, en fonction de l’âge. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse (sublinguale) qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).

Procédures

- Administrations par voie sublinguale pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention, nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). Sur 2 lots (20 animaux). - Administrations par voie intranasale (infection virale) sont des actes pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). Sur tous les lots (80 animaux). - Injections par voie sous-cutanée ne nécessitent pas d’anesthésie au préalable (3 fois/animal, durée : 5 minutes). Sur quatres lots (40 animaux). - Injections par voie intramusculaire ne nécessitent pas d’anesthésie au préalable (2 fois/animal, durée : 5 minutes). Sur deux lots (20 animaux). - Prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 seule fois/animal, durée : 5 minutes). Sur tous les lots (80 animaux).

Impact sur les animaux

- Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Infection par le virus de la grippe : une perte de poids est attendue, correspondant aux symptomes d’une infection par le virus de la grippe chez la souris. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles sous contention et peuvent générer un stress chez l’animal. - Injection par voie intramusculaire : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles sous contention. Une augmentation de la température corporelle est envisageable après les immunisations. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang à l’oeil : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 12 mois et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…).

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 2 ans à 80 souris. Pour la procédure, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales.

Raffinement

- Les injections et prelèvements seront réalisés sous anesthésie. Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Le suivi des animaux après chaque étape des procédures comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée chaque semaine. En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie (ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature) ou entre à partir de 16 mois (ce qui correspond à une population âgée) afin de comparer l’efficacité du vaccin à deux âges différents. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.

Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis quatre injections de vaccin, chacune sous anesthésie : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tumeurs. Le porteur décrit une douleur possible au point d'injection, puis des douleurs liées au développement de la tumeur et une dégradation visible de l'état des animaux, absence de toilettage, prostration, lenteur des mouvements. Il attend du vaccin les mêmes effets que chez l'humain, inflammation, fièvre et douleurs musculaires. Il affirme par ailleurs connaître assez bien le modèle pour arrêter chaque expérience "bien avant d'atteindre les points limites", alors que la dégradation qu'il décrit constitue un critère classique de point limite.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de certains cancers. Cependant de nombreux patients restent non-répondeurs à ces traitements. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers qui servent de portes d’entrées majeures à des lymphocytes tueurs. Ces lymphocytes sont des cellules du système immunitaire capable de tuer les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet antitumoral d’un vaccin immunothérapeutique qui permettra d'augmenter les vaisseaux TA-HEV, donc d'augmenter les portes d'entrées au sein de la tumeur pour permettre un meilleur recrutement des lymphocytes tueurs.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mettre en évidence un effet anti-tumoral puissant médié par les lymphocytes T et les TA-HEV. Cela permettra donc à court terme d’établir la preuve de concept de l’effet antitumoral du vaccin. Et à plus long terme de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique permettant de traiter des patients non répondeurs aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles.

Procédures

Les souris subiront une injection de cellules sous anesthésie (2-3 minutes) et subiront 4 injections de vaccins sous anesthésie (10 secondes à 1 minute)

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur légère au site d'injection. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les vaccins peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme : inflammation, fièvre et douleurs musculaires.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort à l'issue de la procédure pour des prélèvements de tumeurs

Remplacement

La procédure réalisée sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 20 animaux pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives.

Raffinement

La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti-tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille de scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les injections de vaccins seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.

Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".

Objectifs

Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.

Bénéfices attendus

De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.

Procédures

- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Après un transfert de cellules T qui déclenche chez elles une maladie auto-immune de la peau, 714 souris sont saignées sous anesthésie à J0, J7, J14, J21 puis J28, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La maladie provoque des érosions sur le museau, autour des yeux et des oreilles, sur le dos, la poitrine, l'abdomen, les quatre pattes et la queue, une perte de poils et un allongement des dents. Le porteur écrit que cette inflammation ne peut pas être atténuée, puisque la réduire modifierait le phénotype recherché. Toutes sont tuées à l'issue, pour mesurer dans leurs tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire.

Objectifs

Les maladies bulleuses auto-immunes sont un groupe de maladies inflammatoires chroniques de la peau rares avec des bulles et des érosions de la peau. Parmi ces maladies, le pemphigus vulgaire (PV) est caractérisé par la production d’auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre deux protéines desmosomales. Les traitements des formes modérées à sévères de PV sont efficaces, cependant, il y a environ 40 % de patients en rechute. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait afin de prédire et de guérir les rechutes de PV. Les réponses Ac sont contrôlées par des globules particuliers appelés lymphocytes T. Nous avons observé chez les patients PV une diminution de ces cellules T après traitement corrélée à une baisse prolongée des auto-Ac.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de tester le rôle causal et mécanistique des lymphocytes T dans la physiopathologie du PV à l’aide de modèles murins pré-cliniques de PV déficients pour la population de lymphocyte T afin de développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Prélèvement sanguin à J0, J7, J14, J21 et J28 après transfert des cellules T afin d'évaluer la mise en place de la pathologie autoimmune de PV par mesure de la quantité d'auto-anticorps sérique. Les prélèvements de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux = 5.

Impact sur les animaux

Développement d'une pathologie équivalente au PV : erosion (Museau, Région périorbitaire, Région périoriculaire, Dos, Poitrine, Abdomen, Patte avant droite, Patte avant gauche, Patte arrière droite, Patte arrière gauche, Queue), alopécie (face, dos, cou et abdomen), allongement des dents avants

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire dans le contexte du pemphigus

Remplacement

Les maladies inflammatoires chroniques cutanées sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (p.ex., les structures épithéliales, les organes lymphoïdes secondaires ou encore le système vasculaires etc). Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le PV. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie étudiée.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 3 fois. Au total 10 lots experimentaux réalisés, ce qui correspond à 102 groupes experimentaux. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires

Raffinement

Les animaux seront attentivement observés après induction du PV. Le poids des animaux sera suivi et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes, l'animal sera mis à mort. Les animaux seront placés dans des cages (5 souris par cage) avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification. L'objectif de ce projet est de tester de nouvelles approches thérapeutiques, donc l'inflammation induite ne pourra être réduite car elle impacterait le phénotype.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présentent de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Toutes tuées en fin de procédure pour des analyses post-mortem, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis pour certaines des injections deux fois par semaine pendant quatre semaines, toujours sur animal vigile. Un second groupe est irradié trois minutes sous contention avant de recevoir des cellules par voie intraveineuse, puis des cellules tumorales six semaines plus tard et deux prises de sang. Le porteur reconnaît que l'irradiation peut dégrader l'état général des animaux et que des nécroses peuvent apparaître sur les tumeurs, et conclut que le recours aux souris reste "indispensable" malgré les méthodes alternatives auxquelles son laboratoire a eu recours.

Objectifs

Notre système immunitaire est capable de détecter la présence d’un élément étranger dans notre organisme et de déclencher une réponse immunitaire efficace afin d’éliminer ce pathogène. La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. Le contrôle de la réponse immunitaire est un mécanisme très important pour empêcher par exemple une suractivation des lymphocytes pouvant aboutir à la destruction des cellules saines de l’organisme. Pour cela, les lymphocytes sont équipés de récepteurs dits de contrôle (checkpoint). L’engagement de ces récepteurs avec leurs ligands (molécule qui se lie de manière réversible à son récepteur) régule la durée et l’intensité de l’activation lymphocytaire. Mais ce mécanisme peut être détourné par les cellules tumorales qui en exprimant les ligands des récepteurs checkpoint freinent le système immunitaire au lieu de l’activer. Les médicaments anti-checkpoints sont déjà utilisés en clinique contre plusieurs types de cancers. Cependant ces traitements dit « d’immunothérapie » ne sont pas efficaces chez tous les patients et uniquement pour certains cas de cancers. Comprendre la raison d’une telle variation est un défi important pour la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. Parmi celles-ci, les kinases sont une cible particulièrement intéressante. Ce sont des protéines dont le rôle principal est d'ajouter un petit groupe chimique appelé phosphate à d'autres protéines, ce qui peut les activer ou les désactiver. Dans le contexte du cancer, certaines kinases peuvent être hyperactives, contribuant ainsi à la croissance incontrôlée des cellules cancéreuses. En ciblant spécifiquement ces kinases avec des médicaments inhibiteurs, les chercheurs espèrent ralentir ou arrêter la croissance des cellules cancéreuses. Plus de 30 de ces médicaments sont déjà utilisés, et d'autres sont en cours d’essai clinique. Le but de ce projet est d’explorer si notre protéine kinase d’intérêt peut améliorer les mécanismes de défense anti-tumeurs des lymphocytes en combinaison avec des traitements anti-checkpoints.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de définir si notre protéine kinase d’intérêt joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs solides et pourrait améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Si tel était le cas, elle pourrait être considérée comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer.

Procédures

Dans un premier lot de souris, des cellules tumorales seront injectées une fois par expérience aux animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Certains animaux seront ensuite traités deux fois par semaine pendant maximum 4 semaines par injection sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Dans une deuxième expérience, des souris vigiles seront irradiées (3 minutes) puis 4H après, elles seront injectées avec des cellules par voie intraveineuse et sous anesthésie gazeuse rapide (durée de l’anesthésie inf à 5 minutes). Six semaines après cette manipulation les animaux seront injectés une fois par expérience avec des cellules tumorales. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles 7 jours et 14 jours après cette dernière injection (durée du geste inférieur à 20 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques (douleur légère de courte durée liée à la piqûre elle-même). Une légère douleur de très courte durée est attendue lors des prélèvements sanguins ou des injections par voie intraveineuse. La procédure d’irradiation n’est pas douloureuse pour les animaux néanmoins un stress de courte durée, lié à la contention est attendu. Dans de rares cas, l’irradiation peut entrainer une altération de l’état général des animaux (déshydratation, prostation……) dans les jours suivants l’irradiation.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs et nécessite donc le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. En effet, le développement des tumeurs met en jeu de multiples types cellulaires et de nombreux mécanismes qui ne peuvent pas être reproduits dans des modèles in vitro. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation des souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences. Plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) seront réalisées sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris par groupe est de 10 avec 3 manips afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures, une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal en souffrance est mis à mort. Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, et deux fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur ayant été greffée par voie sous-cutanée, afin d’appliquer les points limites de la grille de score. Après l’irradiation, du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent apparaitre.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet.