Système immunitaire
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Déchiffrer le code de compatibilité entérofécal après transplantation de microbiote fécal pour contourner la resistance aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et, selon les protocoles, chacune peut recevoir une tumeur, deux administrations orales de matières fécales de souris, jusqu'à quatre traitements d'immunothérapie et une prise de sang par semaine. Certaines procédures ajoutent une chirurgie de cinq minutes sous anesthésie générale pour injecter un traceur qui suit la migration des cellules. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leurs organes. L'équipe cherche à comprendre pourquoi une transplantation de microbiote fécal réussit ou échoue à lever la résistance des patients aux immunothérapies contre le cancer, avec un bénéfice renvoyé à plus tard, mieux choisir donneurs et patients, quand la douleur liée à la tumeur et une possible perte de poids sont prévues pour les souris.
Objectifs
Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.
Etude de la fonction des cellules endothéliales en contexte physiologique, de régénération du thymus et de dissémination leucémique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées a 12 ou 18 mois, choisies pour leur involution thymique avancée, d'autres reçoivent une injection de cellules leucémiques. 295 souris vont être utilisées, 175 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère, toutes tuées pour analyse. Deux séries de quatre injections quotidiennes éliminent un récepteur dans les cellules des vaisseaux sanguins, avant trois injections du ligand testé et des prises de sang sur animaux vigiles. Le porteur décrit une leucémie qui génère un inconfort et une douleur prolongée, précise que ce modèle est létal au-delà de 21 jours, et fixe la mise à mort au dixième jour au plus tard.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT). Les LT se développent au sein du thymus, hébergeant leur production et leur sélection. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie tel que le vieillissement. En effet, avec l’âge, le thymus subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus résulte en une forte altération de la production de nouveaux LT, réduisant ainsi fortement leur renouvellement dans l’organisme. Ceci résulte en une susceptibilité accrue de l’organisme aux infections, aux pathologies auto-immunes et aux cancers. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration d’une protéine ligand-X capable de se fixer sur un récepteur-Y spécifique présent sur les cellules du thymus promeut la régénération de cet organe et la production des LT au cours de l'involution associée à l'âge. Nos résultats montrent que l’action de cette molécule est médiée par une amélioration du nombre et de la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins. Ce projet s’intéresse à comprendre comment ce Ligand-X agit sur la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins du thymus. Ainsi, le premier objectif de notre projet est de caractériser le rôle de l’axe ligand-X/ récepteur-Y dans la physiologie des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques ainsi que de déterminer le rôle de ces cellules dans la régénération du thymus. De plus, puisque le ligand-X est important pour la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et que nos résultats démontrent que les cellules leucémiques produisent fortement cette protéine ligand-X, nous émettons l’hypothèse que l’axe ligand-X/récepteur-Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins est impliqué dans la dissémination des cellules leucémiques. Ainsi, le deuxième objectif vise à démontrer et caractériser le rôle de cet axe dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques au cours de la leucémie. Ce projet permettra d’évaluer le rôle de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques en contexte physiologique, de régénération du thymus, de dissémination leucémique et de réponse vaccinale.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’amélioration de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge, étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeure. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude évaluera le rôle des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la régénération thymique. Par ailleurs, notre étude du rôle de l’axe ligand-X /récepteur-Y dans la dissémination leucémique permettra de mettre en avant une nouvelle cible thérapeutique, particulièrement en ciblant cet axe afin de limiter l’invasion dans les tissus. A plus long terme, nos études devraient participer au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts de développement thymique liés à l’âge et pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémies.
Procédures
Pour l’étude du rôle du ligand-X dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques, des souris âgées de 8 semaines, 12 mois (involution thymique avancée) ou 18 mois (involution thymique très avancée) vigiles recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les souris âgées de 12 et 18 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle par injection sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Une partie des animaux recevront des progéniteurs de lymphocytes T par injection sous anesthésie gazeuse légère. La fonctionnalité des cellules sera ensuite analysée. Pour le modèle de leucémie, les souris âgées de 8 semaines recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les animaux recevront une injection de cellules leucémiques sous anesthésie gazeuse légère durant 2 minutes par animal. Aux jours 3 et 6 après l’injection des cellules leucémiques, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sur animaux vigiles. Finalement, pour les tests de réponse vaccinale, des souris de 12 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. 28 jours après la première injection, les animaux recevront par voie sous-cutanée une protéine A en tant que modèle de vaccination sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses (sous anesthésie gazeuse légère) et intrapéritonéales peuvent générer un stress, un inconfort et une douleur légère de courte durée. Concernant le modèle de leucémies, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort et une douleur prolongée. Bien que ce modèle puisse être léthal au-delà de 21 jours, les souris seront mises à mort et analysées à un temps court (maximum 10 jours) dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur prolongée. Concernant le modèle de réponse vaccinale, les injections sous-cutanées (sous anesthésie gazeuse légère) peuvent générer un stress et une douleur légère de courte durée et peuvent éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée quotidiennement attentivement. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur modérée et prolongée.
Devenir
Les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération de la production du thymus par le traitement ligand-X. De plus, l’étude de la dissémination leucémique au sein des tissus nécessite l’utilisation du modèle in vivo. Notre projet nécessite donc une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Le choix du nombre d’animaux est réalisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Il prend en considération la variabilité inter-individuelle, la variabilité de réponse au traitement et la variabilité de charge leucémique. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté après estimation du nombre d'animaux nécessaires pour garantir un résultat fiable. D’après nos analyses de la littérature et notre expérience passée, un nombre de 9 à 15 animaux par groupe devraient fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront répartis en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience, e.g. l'étude de la dissémination leucémique chez les animaux et l’étude de l’effet d’une neutralisation du ligand-X chez ces animaux.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de répartition dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés gazeuse légère par inhalation gazeuse avant chaque injection intraveineuse. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne ou tous les deux jours selon la procédure, afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur, à l’aide d’une grille d’évaluation dans le cas de la leucémie. Entre autres, les animaux seront pesés tous les jours avec une balance de précision, et seront soumis à une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids. En cas de faiblesse pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront monitorés avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire, et en particulier du thymus, ainsi qu’à l’oncologie. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ont un fond génétique stable et après traitement, le récepteur Y sera spécifiquement mutée dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques . Trois âges sont prévus : -stade jeune : souris de 8 semaines. -stade avancé d’involution thymique : souris âgées de 12 mois. -stade très avancé d’involution thymique : souris âgées de 18 mois.
Développement d’un candidat vaccin contre les virus transmis par les moustiques EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 590 souris sont utilisées dans cet établissement, l'un des deux du projet, dont 935 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injections de la cible vaccinale, saignées répétées des veines mandibulaire et saphène, ponctions cardiaques au terme de l'immunisation, exposition à des moustiques infectés : toutes sont tuées à l'issue. Le porteur annonce un vaccin universel protégeant contre plusieurs flavivirus, tout en situant le projet au stade de l'optimisation du protocole d'immunisation. Sur le remplacement, il écrit que "le modèle animal est incontournable" et qu'aucun autre modèle ne permet ce test, après avoir produit ses données préliminaires in vitro.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.
Procédures
Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.
Devenir
A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.
Raffinement
Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.
Développement d’un candidat vaccin contre les virus transmis par les moustiques EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Immunisées à J0 puis à J14, saignées par la veine mandibulaire ou saphène tous les deux jours pendant quatorze jours, 1 590 souris sont ensuite exposées sous anesthésie à des moustiques porteurs de flavivirus, trente minutes par séance. Le protocole en déclare 655 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 935 un niveau modéré, avec perte de poids, fièvre, troubles neurologiques et comportement anormal liés à l'infection. Une partie est saignée par ponction cardiaque sous anesthésie pour récupérer le sérum. Toutes sont tuées, à la fin des expériences ou plus tôt si la souffrance devient sévère.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.
Procédures
Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.
Devenir
A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.
Raffinement
Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.
Etude des défenses immunitaires de la muqueuse olfactive aux infections virales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à quatre instillations d'un virus respiratoire dans le nez, sous anesthésie, complétées pour certaines par des gavages ou des injections d'antiviraux deux fois par jour sur animal vigile. 900 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 400 un niveau léger. L'objectif déclaré porte sur les défenses immunitaires de la muqueuse nasale face au virus responsable de la bronchiolite du nourrisson. Le porteur annonce des tests olfactifs de moins de sept minutes sur 500 animaux sans préciser en quoi ils consistent, et affirme que l'infection ne provoque chez la souris ni symptôme respiratoire ni changement de comportement visible.
Objectifs
Le présent projet vise à mieux comprendre les défenses immunitaires précoces au niveau de la cavité nasale lors d'une infection par un virus respiratoire en utilisant la souris comme modèle d'étude (des lignées sauvages et des lignées génétiquement modifiées). Les expériences réalisées permettront également de valider des approches anti-virales contre les infections par des virus respiratoires, en utilisant le virus respiratoire syncytial comme modèle (responsable de la bronchiolite du nourrisson).
Bénéfices attendus
Ce projet vise donc à développer des nouvelles stratégies antivirales contre les virus respiratoires en s’appuyant sur une meilleure connaissance de l’immunité intranasale
Procédures
Au cours de ce projet, les 900 animaux seront soumis à des instillations nasales sous anesthésie (jusqu’à 4 par animal d’une durée d’une minute maximum) ). Les animaux pourront également subir des gavages ou des injections ainsi que des tests olfactifs. Au cours de ces interventions, en dehors des tests olfactifs, la procédure par animal est inférieure à 5 min sauf pour les traitements antiviraux qui seront réalisés sur animal vigile si biquotidien et durent moins de 2 min. Les tests olfactifs (concernant 500 animaux) durent moins de 7 min par animal.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus respiratoire syncytial induit très peu de symptômes chez la souris, pas de symptômes respiratoires ni de changement de température corporelle ni changement de comportement visible. Les instillations nasales, les gavages et les injections ne génèrent que peu de nuisance. En effet, l’instillation nasale peut engendrer un stress chez l’animal et une fausse déglutition. Le gavage peut engendrer une fausse route. Les modifications génétiques des lignées ne sont dommageables qu’après 6 mois. Les animaux seront anesthésiés avant instillations nasales qui ne provoqueront alors pas de stress. Les gavages et injection d’antiviraux seront réalisés sur animal en contention ce qui provoque un stress léger et très court. Les antiviraux ont été validés au préalable pour leur très faible toxicité et sont bien tolérés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus qui seront utilisés pour étudier les infections virales et la réponse immunitaire de l'hôte.
Remplacement
Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions virus-hôte. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes avec un système immunitaire fonctionnel. Les lignées transgéniques permettront de spécifiquement étudier le rôle du mucus dans l’élimination des virus respiratoires dans la cavité nasale.
Réduction
Le nombre d'animaux est limité par des expériences pilotes déjà réalisées ainsi que des effectifs adaptés de 10 animaux des deux sexes par groupe pour obtenir des différences statistiques en se basant sur nos précédentes expériences.
Raffinement
Les animaux sont gardés en groupe sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement, ils disposent également d’un enrichissement de leur environnement notamment pour créer un nid à l’abri d’une maison en carton de type igloo ainsi que de bout de bois à ronger. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue en cas de risques liés aux infections respiratoires (prise de température et de poids journalier). Des points limites sont déterminés pour éviter la douleur des animaux. Les lignées transgéniques à phénotype dommageable seront utilisées à un âge où ces symptômes n’apparaissent pas.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature permettant d’étudier les relations hôtes-pathogènes. Le choix de la souris repose sur sa capacité à être infectée par le VRS. Les lignées transgéniques permettront de spécifiquement étudier le rôle de deux composants du mucus dans la capacité de la cavité nasale à évacuer ce dernier.
Etude de la modulation du métabolisme du tryptophane sur la polyarthrite expérimentale
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La douleur de l'arthrite induite au collagène, qualifiée de sévère dans le résumé lui-même, ne recevra aucun antalgique, aucune molécule contre la douleur n'étant selon le porteur dépourvue d'un effet anti-inflammatoire qui fausserait le résultat. 104 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs articulations, dont 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intradermique sous anesthésie, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes, avec une pesée quotidienne et une mesure du volume de leurs pattes arrière gonflées trois fois par semaine. Le projet, financé par des agences de recherche, vise à accélérer le développement clinique d'une molécule contre la polyarthrite rhumatoïde et à en établir la dose minimale efficace.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires. Cette pathologie touche les articulations mobiles telles que les articulations des mains, des pieds, les poignets et les genoux. Elle est caractérisée par une inflammation articulaire et une destruction progressive des structures cartilagineuses et osseuses. C’est une maladie douloureuse qui affecte la qualité de vie des patients et qui peut provoquer un isolement social. Plusieurs traitements contre la polyarthrite rhumatoïde, notamment les biothérapies, sont actuellement utilisés. Mais des résistances et des échappements thérapeutiques sont fréquents. Ainsi, il a y une nécessité de trouver de nouveaux traitements et de comprendre les mécanismes d’action, et notamment les mécanismes cellulaires, de ces traitements. L'objectif de ce projet financé par des agences de recherche est d'accélérer le developpement clinique d'un médicament contre la polyarthrite rhumatoïde. Les objectifs spécifiques sont de comprendre le mode d'action de cette nouvelle approche thérapeutique ainsi que de déterminer la dose minimale efficace.
Bénéfices attendus
Comme l'enzyme AADAT (notre piste thérapeutique) s'est déjà avéré efficace dans le modèle de polyarthrite par injection d'anticorps anti-collagène, la présente étude permettra d'explorer les potentialités anti-inflammatoires de la molécule dans le but d'avancer cette molécule candidat médicament plus avant vers la clinique, les études prévues dans ce projet permettront entre autres d'aider à résoudre le mécanisme d'action de la molécule et donc d'envisager la mise sur le marché d'un nouveau médicament à terme.
Procédures
Certains animaux recevront des injections intradermiques (une injection unique d'une durée d'1 min environ) sous anesthésie générale. Les autres injections intrapéritonéales (d'une durée de 15 secondes et avec une fréquence maximale d'une injection par jour pendant la durée du traitement comme indiqué en 4.3.1 et 4.3.2) sont réalisées sur animaux vigiles . Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. Au cours de la procédure les animaux seront pesés (15 secondes maxi par animal avec une fréquence maxi quotidienne) et l'oedème des pattes arrieres mesurès par mesure du volume (1 min maximum par animal à une fréquence maxi de 3 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Nuisance n°1 Induction de l'arthrite sous anesthésie générale, d'une durée de 3 min environ, temps d'induction compris, cette anesthésie est réalisée sous isoflurane. Nuisance n°2 Développement de l'arthrite Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par l'arthrite. La douleur considérée comme sévère pour le modèle d'arthrite au collagène et modérée pour le modèle d'arthrite aux anticorps anti-collagène, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire. Nuisance n°3 Administration des composés pharmacologiques par injection intrapéritonéale quotidienne .
Devenir
Des analyses histologiques sur les articulations (arthrite) seront réalisées à l'issue des procédures expérimentales nécessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
La présente étude a été planifiée après une recherche documentaire approfondie et de nombreuses études in vitro. Après avoir soigneusement analysé les études thérapeutiques cruciales in-vivo, il a été observé que les modèles de souris utilisés ici sont les modèles de référence pour la polyarthrite rhumatoide. De plus, compte tenu des développements déjà réalisés sur cette molécule, cette étude in-vivo est cruciale et constituera un jalon pour progresser sur l'avenir de notre molécule médicament. Cette étude est une partie impérative du développement préclinique de la molécule. Après avoir consulté la littérature et considéré l'importance de cette étude pilote, le présent projet ne peut être remplacé par aucune autre étude alternative.
Réduction
Ce projet est planifié en gardant à l'esprit le nombre minimum d'animaux nécessaires (8 animaux par groupe) pour atteindre le niveau de signification pour chaque modèle. Le projet est divisé en trois groupes : le groupe témoin inflammatoire, le groupe traité avec AADAT, le groupe contrôle avec le médicament déja approuvé. Pour une étude comparative, il est important d'inclure ce groupe témoin qui servira de norme pour les comparaisons nécessaires pour comprendre l'impact du médicament sur la gravité et la progression de la maladie. Compte tenu de l'importance de chaque groupe dans l'étude, il n'est pas possible de réduire le nombre de groupes et d'animaux. Une analyse statistique sera réalisée pour les comparaisons entre les trois groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement est apporté par des objets (tunnel, maison) dédiés à cet usage. Les injections intra-dermiques sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Les deux modèles sont bien connus et maîtrisés au laboratoire en termes de douleurs. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Un changement de litière bi- hebdomadaire puis quotidien lorsque les animaux seront en phase d’arthrite sévère, l'utilisation de tunnel permettra de diminuer le stress occasionné par le changement de litière. Des points limites (liés à la perte de poids et/ou des anomalies du comportement) sont mis en place.
Choix des espèces
Les souris mâles avec un fond génétique de suceptibilité à l'auto-immunité, ont été largement étudiées dans la littérature comme modèle expérimental de la polyarthrite rhumatoïde. L'immunisation avec le collagène de type II provoque une réponse auto-immune similaire à celle observée chez les patients atteints de polyarthrite Des souris adultes mâles seront utilisées pour cette étude afin de diminuer l'influence hormonale des oestrogènes.
Cibles thérapeuthiques et mécanismes de maladies inflammatoires chroniques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.
Raffinement
Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.
Etude du rôle des Lymphocytes T CD8 régulateurs dans l’homéostasie du système immunitaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Colite déclenchée par l'eau de boisson, encéphalomyélite induite par deux injections sous la peau, psoriasis provoqué par une pommade appliquée six jours sur le dos : 1 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 720 en gravité sévère. Une partie est rendue immunodéficiente, donc plus vulnérable aux infections, avant d'être reconstituée par injection intraveineuse de cellules. Le porteur décrit pour le modèle d'encéphalomyélite une paralysie des membres postérieurs puis antérieurs accompagnée d'une perte de poids, pour la colite du sang dans les selles et des diarrhées avec déshydratation, et pour le psoriasis un érythème cutané plus ou moins étendu. Les 1 508 souris sont tuées à la fin de chaque procédure parce que les cellules régulatrices étudiées doivent être analysées dans les organes atteints.
Objectifs
Le système immunitaire est le fruit d’un équilibre complexe entre des cellules effectrices qui combattent les pathogènes et des cellules régulatrices qui refreinent ces dernières. En effet, les cellules effectrices du système immunitaire peuvent parfois s’attaquer aux propres cellules de l’organisme et conduire à ce que l’on nomme une maladie auto-immune. Certaines catégories des cellules régulatrices appelés lymphocytes T régulateurs (Tregs), sont très bien connues et décrites depuis une trentaine d’années. D’autres ont été mises en évidence plus récemment mais sont beaucoup moins bien décrites et connues. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des Tregs récemment mis en évidence dans différentes maladies auto-immunes grâce à des modèles murins uniques.
Bénéfices attendus
Notre étude est originale car c'est la première fois, grâce à l'établissement d'une nouvelle lignée murine transgénique, que les cellules régulatrices (Tregs) seront étudiées indépendamment selon leur sous-type. En effet, plusieurs modèles existent dans lesquels toutes les cellules régulatrices peuvent être supprimées, sans distinction des sous-types cellulaires. Avec cette étude nous allons supprimer spécifiquement des Tregs dans des contextes de maladies auto-immunes, et nous verrons directement leur rôle dans la régulation du système immunitaire. Cette étude va permettre de mieux comprendre le rôle des Tregs qui semble d’après plusieurs études avoir un rôle important dans l’équilibre du système immunitaire. Si ce rôle est bien confirmé, nous pourrons alors proposer des thérapies chez l’homme dans les maladies auto-immunes.
Procédures
La colite sera induite via eau de boisson pendant 5-6 jours (abreuvement spontanée, animaux vigiles). L’EAE sera induit par injection sous-cutané (SC) d’un peptide avec de l’adjuvant à J0 ainsi que par l’injection d’un traitement en intra-péritonéale (IP) à J0 et J2. Le psoriasis est induit par application d’une pommade pendant 6 jours sur le dos des animaux. La suppression du système immunitaire sera obtenue par injections chroniques d'un traitement par voie IP. L’injection de cellules est effectuée par voie intra-veineuse (IV). Les injections, qu’elles soient par voies IV ou SC sont effectuées sous anesthésie gazeuse, tout comme le rasage du pelage et l’application de crème sur la peau. Les injections durent 5 minutes et sont réalisées 1 seule fois par animal pour les IV, et 2 fois par animal pour les SC. Les injections par voie intra péritonéales (IP) ainsi que les prélèvements sanguins sont quant à eux réalisés sur animaux vigiles. Ces actes ne durent que quelques minutes et sont réalisés 6 fois maximum pour les injections IP et 3 fois maximum pour les prélèvements sanguins. Certains animaux présenteront un phénotype dommageable d'immunodéficience, les rendant plus sensibles aux infections. Les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de projet.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux présente une immunodéficience acquise ou induite ce qui implique un risque accru aux infections, à des atteintes cutanées avec l’apparition de lésions de l’épiderme, ou encore à des atteintes digestives conduisant à une perte de poids. Les 6 injections de traitement nécessaires pour la suppression du système immunitaire pourront conduire à un stress limité et à une douleur de courte durée. La reconstitution des souris immunodéficiences avec un système immunitaire spécifique selon les conditions sera réalisée par une injection de cellules en suspension par voie intraveineuse. L’injection pourra conduire à une gêne très courte suite à un écoulement sanguin. L’immuno-monitoring sera réalisé sur un prélèvement sanguin. Ces prélèvements (3 au maximum), peuvent conduire à un hématome ou une hémorragie. La douleur mandibulaire peut aussi avoir pour conséquence des difficultés pour se nourrir. De manière générale toutes les injections par voie intraveineuse et sous-cutanée ainsi que les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse ce qui pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. L’induction d’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) est réalisée par 2 injections sous cutanées pouvant conduire à une inflammation et donc à une douleur locale. Ce modèle a pour conséquences à une paralysie des membres postérieurs puis antérieurs associée à une perte de poids. Cette perte de mobilité peut conduire à un stress des animaux. Le modèle de colite peut conduire à une forte perte de poids, du sang dans les selles et des diarrhées plus ou moins fortes ayant pour conséquence une déshydratation. Le modèle de psoriasis quant à lui conduit à l’apparition d’érythème cutané plus ou moins étendu. Tous ces modèles de maladies auto-immunes peuvent avoir pour conséquence des symptômes une douleur qui sera évaluée tout au long des protocoles.
Devenir
Il est nécessaire à la fin de chaque procédure mettant en jeu un modèle de pathologie auto-immune d'analyser les cellules d'intérêt dans les organes atteints par la maladie. Ainsi, les prélèvements ou les analyses dans les organes internes impliquent l’euthanasie des 1508 animaux par une méthode réglementaire.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’une population cellulaire, ici une sous population régulatrice du système immunitaire, qui sont encore peu décrits et étudiés, dans différentes pathologies auto-immunes. Ici nous avons choisi d’étudier ce rôle dans 3 pathologies distinctes faisant intervenir des acteurs immunologiques de nature différente au sein de 3 organes cibles distincts : le système nerveux central, la peau et le système digestif. Les organes et les réponses immunitaires étudiés sont complexes et il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1508 animaux. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu de nos résultats préliminaires, nous avons pris l’hypothèse que la différence de score entre les souris dans nos 3 modèles pathologiques serait d’environ 10 pourcents. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux sont hébergés dans les conditions standard exempt d'organisme pathogène spécifique (EOPS). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de papier Kraft, maison en carton, tunnel en carton ou carré de coton de nidification compacté. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. Lors des gestes invasifs tels que injections, rasage et application de crème cutanée les animaux subissent une courte anesthésie gazeuse. Si après ces courtes anesthésies les animaux ont du mal à retrouver un état vigil, ils seront gardés dans la cage d’induction posée sur plateau chauffant à 37 degrés dans laquelle seule l’oxygène sera maintenu. Les animaux seront surveillés jusqu’à récupération complète. Si les animaux montrent des signes de douleur un traitement antalgique par voie orale sera mélangée à un aliment appétant. De même, 30 minutes avant les euthanasies, les animaux seront sous analgésie.
Choix des espèces
La souris est un modèle validé pour les études immunologiques. Les 3 modèles de maladies auto-immunes utilisées dans ce projet sont également très bien caractérisés et favorisés par le fond génétique choisi. Les modèles de souris transgéniques utilisées dans ce projet permettent d’étudier spécifiquement nos cellules régulatrices d’intérêt ce qui a pour conséquence que le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Les animaux inclus dans les protocoles seront des animaux adultes de 6 semaines minimum, condition favorable permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total. L’âge maximum d’inclusion dans une procédure sera quant à lui de 24 semaines. Au-delà on estime que le système immunitaire sera vieillissant vis-à-vis des animaux les plus jeunes.
Etude des protéines effectrices de Toxoplasma gondii et évaluation de l’efficacité de composés parasiticides dans les phases aiguë et chronique de la toxoplasmose chez la souris, DAP 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris seront tuées dès les premiers signes cliniques de l'infection, seuil qui fixe la limite de ce que le protocole les laisse endurer. 2 127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans l'abdomen une injection de Toxoplasma gondii, avec des souches de type I que le porteur décrit comme conduisant systématiquement à la mort en l'absence de traitement, puis un gavage quotidien pendant sept jours et quatre séances d'imagerie sous anesthésie, avant dissection du cerveau pour compter les kystes. Le porteur teste des molécules déjà approuvées par l'agence américaine du médicament et situe les retombées possibles à moyen et long terme, aucun traitement n'existant à ce jour contre les formes persistantes.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet de recherche est double, visant à approfondir notre compréhension d'une maladie due à une infection par des parasites, et à développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans un premier volet, l'équipe se concentre sur l'identification et la caractérisation des des protéines sécrétées par les parasites lors de l'infection de la cellule hôte. L'objectif ultime est de déterminer le rôle de ces protéines dans le processus de virulence du parasite chez son hôte intermédiaire naturel, la souris. Ce volet comprend une analyse in vivo, en se penchant particulièrement sur la phase initiale de la maladie et la formation de kystes pendant la phase persistante de la maladie. Dans un second volet, le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité in vivo de composés antiparasitaires, préalablement sélectionnés parmi des molécules approuvées par la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA, fda.gov). La FDA veille à ce que des médicaments sûrs et efficaces soient disponibles pour améliorer la santé de la population des États-Unis. Ces composés sont donc déjà utilisés dans le traitement de différentes maladies, garantissant leur non-toxicité chez l'humain. L'objectif est de comparer leur efficacité à la sulfadiazine, un médicament antiparasitaire utilisé actuellement en clinique, tout en confirmant in vivo leur cible moléculaire. Notez que ce projet se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (nommés EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche présente des avantages significatifs sur plusieurs aspects. Tout d'abord, il vise à répondre à des questions fondamentales sur les infections causées par les parasites, en éclairant le rôle des protéines sécrétées dans la virulence et le processus infectieux. À moyen terme, ces réponses permettront de mieux comprendre le dialogue établi entre le parasite et son hôte ainsi que les mécanismes permettant le contrôle de l'infection, guidant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En ce qui concerne le deuxième volet, l'évaluation in vivo des composés antiparasitaires présente un intérêt majeur. À long terme, si ces composés s'avèrent efficaces, cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement contre les infections parasitaires, offrant des alternatives potentielles aux traitements actuels, tout en minimisant les effets secondaires. Il est important de souligner ici qu'il n'existe jusqu'à présent aucun traitement contre les formes persistantes d’infections parasitaires. Une fois établis, les kystes persistent théoriquement pendant toute la durée de vie de l'hôte. Pour information, il est estimé que 30% de la population mondiale est infectée par un parasite. En somme, ce projet offre une approche globale, alliant une compréhension approfondie des mécanismes d'infection à des solutions thérapeutiques novatrices. Les connaissances générées et les avancées thérapeutiques potentielles contribueront à la lutte contre les maladies parasitaires, avec des implications positives pour la santé publique à moyen et long terme.
Procédures
Lors de ce projet, les interventions sur les animaux vivants seront de trois types : (i) Les injections au niveau abdominal (1 par expérience et par souris, durée du geste : quelques secondes) des parasites dans le but de déclencher l'infection parasitaire avec une charge parasitaire contrôlée. Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU1. (ii) Traitement des animaux par administration par voie orale des composés à l'aide de sondes de gavage adaptées à la souris (1 gavage par jour pendant 7 jours consécutifs et par souris, durée du geste : quelques secondes à chaque gavage). Cette étape sera réalisée dans les Etablissements Utilisateurs EU1 et EU2. (iii) Pour les expériences d'imagerie in vivo, les animaux sont anesthésiés et le produit luminescent est injectée dans l’abdomen des animaux (4 fois par souris à J0, J2, J5, et J7, durée du geste : quelques minutes chaque jour). Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les infections parasitaires peuvent est caractérisées par deux phases distinctes : la première phase de l’infection, qui correspond à la phase de dissémination des parasites dans les différents organes de l'hôte (la souris ou l’homme). Celle-ci peut être mortelle chez la souris comme chez l'homme si elle n'est pas contenue et contrôlée par le système immunitaire. Les souches de type I sont particulièrement virulentes chez les souris de laboratoire et conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement. Les souches de type II, non-virulentes, induisent une première infection légère, conduisant systématiquement à une infection parasitaire persistante sans symptômes. Cette phase correspond à l'étape où la multiplication des parasites est contenue par le système immunitaire de l'hôte, et seuls les parasites capables de s'enkyster dans les muscles et le cerveau vont survivre. Cette étape se met en place plus tardivement, et les kystes vont persister pendant toute la durée de vie de l'hôte.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sur les animaux morts tels que le prélèvement du sang dans le but de détecter la présence d’une réaction immunitaire contre le parasite et la dissection du cerveau pour la détection et la quantification des parasites sous forme de kystes dans le cerveau des animaux.
Remplacement
Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Des études préliminaires réalisées in vitro en culture cellulaire nous ont permis d’identifier spécifiquement des gènes (24 gènes candidats) du parasite codant pour des protéines du parasite sécrétées dans la cellule infectée et ayant donc un rôle potentiel dans le contrôle de la virulence chez l’animal. De même, que des études de biochimie ont permis de montrer que ces protéines s’associent avec des protéines de la cellule hôte confirmant leur rôle potentiel dans la régulation des interactions hôte-parasite. Il est donc essentiel de pouvoir réaliser des expériences chez la souris afin de déterminer l’importance de ces gènes dans le contrôle de la virulence, ainsi que dans la capacité des parasites à persister chez l’animal sous forme de kystes (infection persistante). En effet, aucune autre approche alternative in vitro ou de culture cellulaire ne permet de répondre à ces questions. Le modèle murin d’étude des maladies parasitaires est communément utilisé par la communauté scientifique. En effet, la souris constitue un hôte intermédiaire naturel et privilégié étant donné que le cycle sexué du parasite s’effectue exclusivement chez les félidés en tant qu’hôte définitif, après ingestion de proies infectées. Contrairement aux études in vitro de culture cellulaire, la souris permet l’étude de l’infection parasitaire avec la formation de kystes dans les tissus. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides" : L'activité antiparasitaire des composés (27) a été déterminée à travers des tests effectués sur des cellules in vitro. Il est maintenant essentiel de tester ces composés in vivo chez la souris afin de confirmer leur activité parasiticide chez un mammifère. En effet, des essais cliniques chez l'homme ne seront envisageables que si des études précliniques chez l'animal ont été réalisées.
Réduction
Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, 3 souches mutantes différentes seront testées en parallèle d’une souche sauvage parentale de référence. Par exemple, les souches mutantes de type I seront comparées entre elles et à la souche sauvage de référence de type I. Idem pour les souches parasitaires de type II. Concernant les souches de type I (virulentes), une première lignée des souris seront d’abord testées. Si une atténuation de virulence est observée, l’analyse sera poursuivie sur lignée différente de souris. Ces dernières étant plus sensibles, cette expérience permettra d'évaluer la robustesse de l’atténuation de virulence. Si aucun effet du mutant n’est observé sur la virulence avec la première lignée de souris, l’expérience ne sera pas poursuivie sur la deuxième lignée de souris, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides dans les phases initiale et persistante de l’infection parasitaire" : La première expérience sera conduite avec 2 à 3 animaux par condition à tester (totalisant 13 souris pour cette première expérience). L'objectif est d'assurer une efficacité totale des composés, et les expériences subséquentes ne seront menées que si la survie atteint 100% parmi les souris traitées avec les composés testés lors de cette première expérience. Si les composés se révèlent seulement partiellement efficaces, le protocole ne sera pas poursuivi. De plus, les contrôles sont mutualisés puisque les trois composés sont testés simultanément. En cas de réussite, les expériences ultérieures seront menées avec 2 à 5 animaux par condition à tester.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un établissement utilisateur agréé par du personnel formé. Les souris seront maintenues en groupes autant que possible, dans des cages offrant un enrichissement du milieu de vie, et leur bien-être sera régulièrement contrôlé. Les animaux seront logés dans un environnement contrôlé, exempt de germes dangereux pour les animaux, afin d'éviter toute infection supplémentaire pouvant biaiser l'interprétation des résultats obtenus. Dès le début de chaque expérience, les souris sont observées 3 fois par semaine jusqu'à l'apparition des symptômes, puis quotidiennement (jusqu'à deux fois par jour) jusqu’à la fin de la procédure expérimentale et elles seront euthanasiées dès l'apparition des premiers signes cliniques dû à l’infection parasitaire, avec le point limite défini dans ce document. Les composés testés, non toxiques, seront mis en solution selon une formulation préalablement déterminée. Pour l'expérience d'imagerie in vivo réalisée dans une autre animalerie, les animaux seront transportés dans des conditions optimisées afin de limiter le stress lié au transport.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé pour étudier les infections parasitaires est largement adopté par la communauté scientifique. La souris, en tant qu'hôte intermédiaire naturel du parasite, offre un cadre privilégié, car le cycle sexué du parasite se produit exclusivement chez les félidés, en tant qu'hôtes définitifs, après l'ingestion de proies infectées. Les souris développent ainsi une infection parasitaire avec une réponse immunitaire comparable à celle observée chez l'homme. Les souches de souris utilisées présentent des niveaux de sensibilité variables aux parasites. Il est donc pertinent d'explorer le potentiel rôle des effecteurs parasitaires dans la virulence des différents types de parasites (Type I virulent et Type II non-virulent), ainsi que chez des souris présentant divers niveaux de sensibilité à cette infection. De plus, les modèles murins sont particulièrement adaptés pour étudier l'efficacité de composés antiparasitaires, car les souris peuvent reproduire les différentes phases de l’infection, tant infection initiale que persistante. Seules des expériences in vivo, réalisées sur des modèles murins, permettront de confirmer l'efficacité de ces composés au cours des différentes phase de l’infection parasitaire, et de répondre à la question cruciale : représentent-ils de véritables candidats médicaments ? Par conséquent, les expériences seront réalisées sur de jeunes adultes, car le système immunitaire doit être mature afin de pouvoir répondre à l’infection parasitaire.
Reprogrammer les cellules immunitaires antitumorales pour les rendre plus efficaces chez la souris (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Jusqu'à douze séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie générale, six prélèvements dans la veine de la queue et douze mesures de tumeur au pied à coulisse : 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau du flanc rasé ou dans la veine caudale, et sont transportées chaque semaine entre le site d'élevage et le site d'expérimentation. Parmi les atteintes, le porteur cite la douleur du développement tumoral et, plus rare dans un résumé de ce type, le stress de certaines souris à voir disparaître leurs congénères en fin d'expérience jusqu'à se retrouver seules en cage. Il affirme que le recours aux modèles animaux est devenu "incontournable" pour valider des résultats déjà obtenus en culture sur des cellules immunitaires humaines.
Objectifs
Les thérapies cellulaires basées sur l’utilisation des propres cellules immunitaires du patient révolutionnent le traitement de certaines leucémies et lymphomes. Cependant, une fraction des patients ne répond toujours pas efficacement à ces thérapies qui s'avèrent pour l'instant moins efficaces contre les tumeurs solides. Les essais cliniques ont montré que le principal facteur prédictif d'une faible efficacité thérapeutique est la faible persistance de ces cellules immunitaires, une fois génétiquement modifiées et ré-infusées chez les patients. Ces travaux de recherche devraient permettre d’améliorer la persistance et donc l’efficacité de ces thérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes responsables de l’efficacité de thérapies cellulaires anticancéreuses utilisant des lymphocytes T. Des bénéfices thérapeutiques importants sont attendus concernent le traitement de certains lymphomes, de leucémies, mais aussi de plusieurs tumeurs solides. En effet, la modification que nous proposons devrait permettre de lever certains mécanismes de résistance à ces thérapies en confèrent aux cellules immunitaires des propriétés fonctionnelles particulières leur permettant d'éradiquer plus efficacement des tumeurs à l'interieur d'un organisme . De plus, même au-delà du domaine du Cancer, les innovations thérapeutiques que nous proposons devraient aussi, à terme, améliorer l'efficacité de ces thérapies cellulaires qui commencent à être utilisées dans d’autres pathologies humaines comme les maladies auto-immunes. L’amélioration que nous proposons pourrait aussi éviter le besoin de recourir à des injections répétées
Procédures
Les animaux de ce projet seront élevés dans l’établissement 1 et toute expérience se déroulera dans l’établissement 2. Tous les animaux seront soumis à : -selon la durée de l’expérience, jusqu’à 12 séances d'imagerie hebdomadaires, comprenant aussi l'injection intraperitoneale d'un liquide traceur, (sous anesthésie générale) la durée de ce geste est évaluée à 7 minutes. - selon la durée de l’expérience, jusqu’à 6 prélèvements sanguins, une fois chaque deux semaines. Ce prélèvement sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale sur souris vigile la durée de ce geste est évaluée à moins de deux minutes. En plus, selon les expériences, les animaux sauront soumis alternativement à : - Une séance de rasage du flanc droit la durée de ce geste est évaluée à moins de d’une minute. -Une injection sous-cutanée sur souris vigile de cellules tumorales, la durée de ce geste est évaluée à moins d’une minute. - jusqu’à 12 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, sur animal vigile, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute. Ou à: -Une injection intraveineuse(veine caudale) de cellules tumorales, sur des souris vigiles, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress consécutif à la manipulation hebdomadaire des animaux pour l’ensemble des expériences. Elles subiront aussi un stress lié au transport entre les 2 sites, au moment du rasage des poils avant les injections en sous-cutanée et de l’immobilisation pendant les injections et lors des prises de sang. Elles subiront de plus une douleur légère lors des injections en sous cutanée et lors des injections intraveineuses et des prises de sang à la veine caudale. Les souris subiront une douleur du au développement de la tumeur. Enfin, certains animaux pourraient subir un stress de voir disparaitre leurs congénères en particulier en fin d’expérience (points limites atteints) jusqu’au point de se retrouver eux-mêmes isolés dans la cage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Un grand nombre d’expériences de culture cellulaire a été realisé, montrant une amélioration des fonctions antitumorales des cellules immunitaires humaines invalidées pour un gène decrit auparavant. En effet, cette invalidation améliore les capacités d’expansion, de survie, et de prolifération de ces cellules immunitaires. Le recours aux modèles animaux est maintenant incontournable car ils permettront de valider dans des modèles précliniques pertinents et reconnus de la communauté scientifique, ces différentes observations au sein d’un même organisme vivant.
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base des travaux antérieurs et de la littérature scientifique montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés. La croissance tumorale sera suivie par imagerie, permettant un suivi dynamique de ce paramètre sans faire recours à la mise à mort des souris, ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux sont hébergés avec un nombre de 6 souris maximum par cage contenant un enrichissement constitué de cotons et de maisonnettes en cartons. Lors du transfert entre les 2 sites, les souris seront dans des boites de transport avec de la nourriture et de l’enrichissement. Certaines interventions (imagerie) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur ou le stress de l’expérience. Les souris seront surveillées pendant toute la durée des expériences afin de déceler et notifier précocement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entrainera une mise à mort anticipée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix et de référence pour les études des réponses immunitaires contre la tumeur à l’intérieur de l’organisme. Les souris utilisées pour la reproduction seront mis en accouplement à partir de 7 semaines un stade de développement auquel ces souris sont considérées comme sexuellement matures. Les souris utilisées pour les expériences d’étude de la réponse immunitaire contre la tumeur seront âgées de 7 à 12 semaines en début d’expérience (au moment de l’injection tumorale), une tranche d’âge correspondant au jeune adulte, de choix pour ce genre d’études en vertu de la bonne forme physique et de l’absence de biais éventuels dûs aux changements physiques et hormonaux liés au développement autant qu’au vieillissement.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires de la myélopoïèse au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie d'entre elles suivies jusqu'à 24 mois, soit toute leur vie. Tatouées aux doigts à trois semaines, elles passent tous les trois mois un test de force de préhension jusqu'à lâcher la grille, un test de mémoire spatiale de dix minutes et un suivi du transit au charbon, pour établir un score de fragilité calqué sur celui utilisé chez les personnes âgées. Vient ensuite l'infection fongique ou bactérienne, avec un risque de sepsis que le porteur reconnaît, puis un traitement quotidien pendant quinze jours à un mois et une pesée journalière sur sept jours. Le porteur retient la souris pour la complexité de la réponse immunitaire, puis ajoute des motifs d'un autre ordre, "faibles coûts", cycles de reproduction courts, croissance rapide et facilité de manipulation.
Objectifs
L’âge de la population mondiale augmente avec actuellement environ 8.5% de la population âgée de plus de 65 ans et cette proportion devrait approximativement doubler d’ici 2050. Cette augmentation massive de la population âgée s’accompagne d’une dégradation de l’état de santé et des pathologies associées au vieillissement. En particulier, le vieillissement est associé à un facteur de risque majeur d'infections. Les infections à Candida (candidoses) chez les personnes âgées constituent un problème clinique majeur et en expansion, avec une mortalité significativement plus élevée chez les personnes âgées que chez les plus jeunes. Ainsi, notre hypothèse serait que la différenciation des cellules de l’immunité innée, les cellules myéloïdes, au cours du vieillissement serait modifiée contribuant à l’installation de l’inflammation chronique liée à l’âge (inflammaging) et favorisant le développement d’infections. Ce projet va s’appuyer sur l’expertise acquise depuis de nombreuses années dans l’étude des mécanismes moléculaires et des voies de signalisation impliquant les récepteurs nucléaires dans la modulation du phénotype des cellules myéloïdes. Ce projet associera des modèles biologiques bien maîtrisés (infection par Candida, souris spécifiquement délétées au niveau de la lignée myéloïde pour divers récepteurs de reconnaissance des pathogènes ou des facteurs impliqués dans leurs recrutement et différenciation). Ainsi, ce projet nous permettra de définir de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques de l'inflammaging et du défaut de réponse vis-à-vis des infections observé avec le vieillissement.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur la fonction des cellules immunitaires semble essentiel pour déterminer leur importance dans l’installation de l’inflammaging (inflammation s’installant avec l’âge) et dans la modulation de la réponse anti-infectieuse chez les personnes âgées. Ces données approfondies nous permettront de définir des stratégies thérapeutiques ciblant ces cellules.
Procédures
Pour l’identification et permettre un suivi individuel, les souris seront tatouées aux doigts (tatouage permanent) à 3 semaines de vie. Uniquement pour les souris nécessitant une vérification de leur génotypage, un bout de queue sera prélevé. L'étude vise à étudier les mécanismes du vieillissement. Ainsi, différents tests seront pratiqués afin de déterminer la fragilité des animaux s'installant avec l’âge sur 24 mois maximum : test de force de préhension et de fatigue musculaire (l'animal s'agrippe à une grille et la force et le temps de prise sont évalués), test de mémoire spatiale (2 objets sont placés à proximité de l'animal et son interaction avec les objets est évalué pendant 10min 2 fois en 24h), motilité et perméabilité intestinale (le suivi d'une prise de charbon colorant les selles permet de suivre sur quelques heures l'activité du transit). Ces tests seront pratiqués une fois sur tous les animaux et tous les 3 mois pour ceux dont un suivi longitudinal sera mis en place. Ils permettront d’établir un score de fragilité comme il est pratiqué chez l’homme. Des prélèvements seront effectués 1 fois ou maximum 1x tous les 3 mois sur la durée de vie des animaux. Lors de la préhension des souris pour la pesée, l’urine ou les selles émises spontanément par la souris seront récupérées maximum avec une fréquence de 3 mois tous les 3 mois. Suite à l’étude de la fragilité, la réponse immunitaire anti-infectieuse fongique ou bactérienne des souris sera évaluée et l’effet de traitements de type nutraceutiques sera évalué. Certains animaux infectés recevront par voie orale tous les jours pendant 15 jours à 1 mois ou par injection intrapéritonéale 1x tous les 2 jours pendant 15 jours. Un suivi sera mis en place pendant maximum 7 jours avec la pesée, le prélèvement d’urine et de selles tous les jours pendant 7 jours. Du sang et différents organes seront prélevés en fin de vie.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux pour le prélèvement d’urine et les tests de force, de motricité et de cognition peuvent stresser les animaux. Une attention particulière sera portée sur la manipulation des cages de manière indépendante (changement de gants, nettoyage du matériels utilisés entre chaque cage). Bien que les prélèvements de sang soient effectués de manière très espacée, ils peuvent entrainer des lésions. Ces prélèvements, prévus au niveau mandibulaire, seront alternés d’un côté et de l’autre. Lors d’injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Les modèles d’infection peuvent entrainer un sepsis et altérer la survie des animaux. Une surveillance journalière permettra d’intervenir au plus tôt.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de récupérer de nombreux tissus et acquérir le maximum de données biologiques.
Remplacement
Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Le modèle est bien maitrisé au laboratoire. Chaque animal est observé à différents temps (étude longitudinale) et devient son propre contrôle. Les groupes d’animaux seront constitués de 6 à 10 individus pour permettre une étude statistique. Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles sur les animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, papier) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué si une modification de comportement ou des points limites ci-dessous étaient observés, ou tous les 3 mois au cours du suivi longitudinal pour certains animaux, et tous les jours au moment de l’infection, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse.
Choix des espèces
Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Des souris adultes jeunes afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature et souris âgées pour l’étude du vieillissement seront étudiées. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées.
Génération d’anticorps oncolytiques ciblant le cancer du pancréas chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les lapins reçoivent jusqu'à cinq injections d'immunisation en sous-cutané et en intraveineux sur 56 jours, sur animal vigile, plus des prélèvements de sang répétés. 100 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour produire des anticorps polyclonaux dirigés contre le cancer du pancréas. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu hors le stress de la contention, tout en prévoyant une surveillance de la rougeur, du gonflement et de la douleur après chaque injection et un traitement analgésique en cas de réaction inflammatoire. Les lapins sont tués en fin de procédure pour récupérer leur sérum hyper-immun, une lignée double KO ayant d'abord été créée pour l'occasion.
Objectifs
Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très agressive et mortelle, avec un taux de survie global à 5 ans de 6 à 8 %. Actuellement, il n’existe pas d’immunothérapies effectives dans ce domaine. La plupart des chimiothérapies mises en œuvre dans les protocoles thérapeutiques ciblent la cellule tumorale, et le mécanisme d'action des composés utilisés consiste essentiellement à arrêter leur prolifération cellulaire incontrôlée. Il en résulte une exposition importante des cellules saines à ces substances cytotoxiques, avec pour conséquence une toxicité importante à court terme et une réelle implication à moyen terme dans le développement d'autres tumeurs ou "récidives".
Bénéfices attendus
Dans le cadre du pancréas cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance qui se mettent en place dans ce cancer, de confirmer l’intérêt thérapeutique de nos anticorps polyclonaux et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints d’adénocacinome pancréatique et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement.
Procédures
Le but de ce projet est de générer une lignée de lapins homozygotes double KO pour deux xéno-antigènes majeures. Une fois générés, les animaux seront soumis à une procédure d'immunisation c'est à dire des injections multiples en sous cutanée et en intraveineuse. CEtte procédure dure au maximum 56 jours et nécessite au maximum 5 injections (1 en sous cutanée et 3 à 4 en intraveineuses). Ces injections se feront sur animal vigile et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’immunisation chez le lapin sont standards et plutôt bien tolérés. Aucun n'effct indésirable n'est attendu à part le stress lié à la contention lors du prélèvement. Cependant, une observation des points d’injection sera effectuée après chaque injection de cellules et après chaque prélèvement de sang (détection rougeur, gonflement, douleur).
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récuperer le sérum hyper-immuns.
Remplacement
La génération d’anticorps polyclonaux ne peut se faire que par vaccinations répétées chez l’animal. Il n’existe à l’heure aucune technique in vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation d’animaux dans ce contexte.
Réduction
Les protocoles d’immunisation chez le lapin sont bien standardisés et plutôt reproductibles chez les animaux. Un nombre de 3 lapins par groupe a été sélectionné afin de couvrir la totalité des besoins en serum nécessaire pour le projet pancréas global.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens animaliers. Les injections des cellules tumorales, et de prélèvements sanguins se dérouleront sans anesthésie, sur animaux vigiles. Le lapin reçoit sur chaque site d’injection une application de pommade anesthésique locale 5 minutes avant l’acte. Les points d’injection sont surveillés au cours du protocole (détection de rougeurs, gonflement, douleur) après chaque injection de cellules et après chaque prélèvement de sang. En cas de réaction inflammatoire locale, un traitement analgésique sera mis en place. Des enrichissements sont proposés aux animaux. L’environnement (bruit, odeurs, lumière, température, hygrométrie) est contrôlé et maintenu stable au cours du temps.
Choix des espèces
Le lapin est une espère communément utilisé pour la génération d’anticorps polyclonaux. Adulte pour l’immunisation