Système immunitaire
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- Oncologie
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Comparaison de l’efficacité de deux traitements dans un modèle murin de syndrome hémolytique et urémique (SHU).
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Les tremblements sont retenus comme point limite déclenchant la mise à mort. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent une injection de Shiga-toxine qui reproduit un syndrome hémolytique et urémique, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil sous anesthésie. Le porteur écrit que ces injections n'induisent "pas de traumatisme ou de douleur" tout en décrivant des yeux mi-clos, des diarrhées, un poil piqué et des tremblements, et présente l'utilisation des animaux comme "indispensable" pour comparer deux traitements.
Objectifs
La Shiga-toxine (STx2) est produite par une bactérie de la famille Escherichia coli et est la cause d’une maladie infectieuse grave (SHU) le plus souvent d’origine alimentaire. Le SHU appartient à une famille de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. La STx2 entraîne d’une part l’inflammation et la mort cellulaire massive, et d’autre part l’activation du système du complément, qui participe aux mécanismes de défense naturels. Le traitement de ces pathologies comprend des traitements non spécifiques et des traitements spécifiques ciblant système du complément, comme l'anticorps anti-C5, le premier traitement approuvé pour le SHU chez les patients pédiatriques et adultes. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires dans les cellules et dans des modèles de souris infectées. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de la clusterine et de l’anticorps anti-C5a dans le SHU afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.
Bénéfices attendus
Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance rénale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.
Procédures
1/ L’Injection intra péritonéale sera utilisée pour les 4 lots de souris. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 2/ L’Injection intra veineuse sera utilisée pour 2 lots de souris. Elle concerne 40 au total, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 3/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée pour les 4 lots de souris. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 4/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée pour les 4 lots de souris. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner les 80 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal.
Impact sur les animaux
L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. Le poil pourra présenter un aspect piqué, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.
Réduction
Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (80) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Les souris seront placées par nombre de 4 par cage. L’alimentation et l’abreuvement seront fournies ad libitum tout le long de l’hébergement. Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro- orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.
Etude de l’évolution du profil des macrophages lors d’un changement de régime alimentaire causant le diabéte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
20 440 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à onze prélèvements de sang, six injections intrapéritonéales, un régime alimentaire de une à vingt semaines, deux mises à jeun et un gavage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les régimes servent à provoquer obésité, athérosclérose et stéatose du foie chez des souris déjà modifiées génétiquement, pour suivre le comportement des macrophages. Toutes les souris en expérimentation sont tuées pour analyse, et le porteur ajoute que les femelles non mises en accouplement et celles dont le génotype ne convient pas sont tuées au sevrage. Le bénéfice annoncé tient en une phrase sur la progression du diabète de type II, quand le raffinement se limite à deux lignes sur des "conditions optimales" et des points limites "adaptés".
Objectifs
L’objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans les différents problèmes médicaux engendrés par le diabète de type II (obésité, athérosclérose, stéatoses hépatiques, etc.). Pour cela les souris, en plus de leur modification génétique sur des gènes clés, seront soumises à différents régimes alimentaires afin d’induire les pathologies. Nous pourrons ainsi déterminer quels sont les cibles privilégiées pour envisager de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Améliorer la compréhenstion du rôle des cellules immunitaires dans les mécanimes des maladies impliquées dans le diabète de type II est primordial. En effet cette maladie, qualifiée d'épidémie mondiale sur le site du ministère de la santé et de la prévention, est en constante progression.
Procédures
• Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. • Prélèvement de sang : maximum 11 fois par animal, 2-3 secondes. • Prélevement sanguin en sub-mandibulaire maximum 6 fois par animal, 2-3 secondes• Régime alimentaire : " durée entre 1 et 20 semaines. • Injection intrapéritonéale (IP) : 6 injections, 2-3 secondes. A la fin du régime : • Mise à jeun : une fois 12h et une fois 6h. • Gavage : une fois par animal, 5-10 secondes.
Impact sur les animaux
• Biopsie extrême pointe de la queue : douleur légère de courte durée • Prélèvement de sang en sub mandubulaire et à l'extrémité de la queue sur animal vigile : douleur modérée au moment de la réalisation du geste. • Anesthésie gazeuse : légère hypothermie possible • Régime alimentaire : les animaux vont prendre ou perdre du poids • Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère de courte durée. A la fin du régime : • Mise à jeun : Jeun de courte durée: stress et sensation de faim. • Gavage : stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux en expérimentations seront mis à mort pour analyses. Les femmelles non-mises en accouplement et les souris n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort au moment du seuvrage.
Remplacement
Dans le cadre de l'étude des réponses du système immunitaire à des régimes alimentaires (mimants les maladies induites par le diabète de type II), nous avons besoin d'analyses ces variations à l'échelle d'un organisme entier. En effet, les régimes alimentaires vont provoquer des modifications dans les tissus gras, le foie et la pancréas. Nous ne pouvons pas étudier ces effets sans utiliser le modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales pour leur bien-être. De plus,nous avons mis en place des points limites adaptés.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes d'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Les animaux seront inclus à partir de l'age de 8 semaines, ce qui correspond à l'age jeune adulte chez la souris.
Etude collaborative de l’impact de l’insuffisance cardiaque sur la sévérité du Covid 19 et de l’efficacité de son traitement chez la souris (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Rendues insuffisantes cardiaques par une chirurgie de cent dix minutes dans un premier établissement, puis transportées vers un second, 92 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles y reçoivent un traitement ou un placebo par voie orale, puis une suspension de SARS-CoV-2 dans le nez, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Ce qui est fait pendant l'opération de cent dix minutes n'est jamais précisé, alors que le RNT annonce un infarctus du myocarde et une insuffisance cardiaque installée, et qu'il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des échographies des huit semaines suivantes. Sur le remplacement, le porteur conclut à la "nécessité" de réaliser l'étude in vivo, aucune approche in vitro ne reproduisant selon lui l'ensemble d'un processus d'infection.
Objectifs
Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.
Procédures
Au sein de l’établissement EU1, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines (20 min). 4) envoi des animaux à l’établissement partenaire. Au sein de l’établissement EU 2 , chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo par voie orale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).
Impact sur les animaux
Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.
Devenir
A la fin des procédures expérimentales décrites ci-dessus, les animaux seront mis à mort pour les prélèvements des organes.
Remplacement
Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés (n=5) soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie (n=13). De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2, voir Annexe 1) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test » soit n=36), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.
Mise en évidence du rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) dans le recrutement des lymphocytes B dans les tumeurs de souris (Mus musculus)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Après une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, des souris développent des nodules pulmonaires qui peuvent causer des douleurs, des difficultés respiratoires, une prostration et l'arrêt du toilettage. 1 794 souris de 6 à 10 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : selon les groupes, une injection sous anesthésie ou sous simple analgésie locale, puis trois ou quatre injections éveillées, et pour 54 d'entre elles une chirurgie suivie de 1 à 3 heures de microscopie intravitale. Le porteur affirme que le point final de chaque expérience "se situe bien avant d'atteindre les points limites", pour des procédures qu'il déclare pourtant en souffrance sévère. Toutes sont tuées pour des prélèvements de tumeurs ou d'organes, ou à l'issue d'une chirurgie prolongée, et 810 d'entre elles reçoivent encore une injection éveillées une heure avant leur mise à mort.
Objectifs
Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces chez tous les patients. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers présents dans les tumeurs murines et humaines. Ils sont les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans les tumeurs aux cours de l’immunité antitumorale et lors de traitements combinés d’immunothérapie (anti-CTLA-4 et anti PD-1). De plus, un traitement augmentant la fréquence et la maturité de ces vaisseaux induit une meilleure réponse à l‘immunothérapie dans des modèles précliniques murins. Enfin, dans les tumeurs fortement infiltrées par les cellules immunitaires ou tumeurs « chaudes », la présence de lymphocytes B et de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) riches en lymphocytes B dans les tumeurs est souvent associée à une bonne réponse à l’immunothérapie. Cependant, les mécanismes qui régulent l’entrée des lymphocytes B dans ces tumeurs restent inconnus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces vaisseaux dans l’infiltration des lymphocytes B et la formation des TLS dans les tumeurs « chaudes » traitées par immunothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs dans l'établissement de structures lymphoïde tertiaires (TLS). Ces TLS sont des structures qui ressemblent en partie à nos ganglions lymphatiques et leur induction et leur développement pourrait favoriser la réponse immunitaire anti-cancéreuse.
Procédures
540 souris subiront une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes), ces 540 animaux subiront aussi quatre injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 1200 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes) ainsi que trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 810 souris parmi ces 1200 inclus subiront en plus, 1h avant leur mise à mort, une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes). 54 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes), ces 54 animaux subiront trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). Ces 54 animaux seront anesthésiés avant la pose d’un cathéter, puis subiront une chirurgie nécessaire à la microscopie intra vitale, cette procédure dure moins d’1h, l’imagerie quant à elle dure en moyenne une heure pour la microscopie intravitale à champ large et de 2 à 3h pour la microscopie intravitale multiphoton.
Impact sur les animaux
Pour les modèles de développement de tumeurs au niveau des poumons, l’injection des cellules tumorales dans la veine de la queue peut induire une douleur modérée et la contention de l'animal pour cette injection peut entrainer du stress. L’évolution du cancer se manifeste par une apparition de nodules au niveau des poumons ce qui peut causer des douleurs, des difficultés respiratoires et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Pour les modèles de tumeurs développées, l’injection des cellules tumorales peut provoquer du stress chez l'animal. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les traitements d'immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme avec une inflammation et une auto-immunité.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes ou bien à l’issue d’une chirurgie prolongée ne permettant pas de réutilisation des animaux
Remplacement
Les procédures réalisées sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximum pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement, en utilisant des tests de comparaison de moyennes multiples appropriés. Le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.
Raffinement
La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille des scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie locale et avec un matériel de contention dédié et optimisé pour ces injections.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.
Prélèvement de sang pour la caractérisation d’animaux congéniques CD45.1 et CD45.1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immobilisées vigiles, la tête bloquée, piquées perpendiculairement à la veine mandibulaire pour deux ou trois gouttes de sang, 750 souris subissent une procédure d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement dure de cinq à vingt secondes et sert à vérifier des marqueurs de surface sur les cellules sanguines, pour trier des souris destinées à des greffes de moelle osseuse. Le porteur indique qu'environ 187 individus, ceux dont le génotype ne présente pas d'intérêt, seront mis à mort. Les 563 autres restent en vie, 60 pour maintenir la lignée et 503 pour alimenter des expérimentations ultérieures.
Objectifs
Production d’animaux congéniques utilisés dans des expériences de greffes de moelle osseuse pour l’étude de l’hématopoïèse normale et cancéreuse. La caractérisation génétique de ces animaux congéniques est réalisée par l’analyse de marqueurs spécifiques à la surface des cellules sanguines.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des souris permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux nécessaires pour les projets scientifiques pour l'étude de l'hématopoïèse normale et leucémique. La compréhension de ces mécanismes permet de développer des traitements thérapeutiques pour les leucémies humaines.
Procédures
Un seul prélèvement sanguin sera effectué à la veine mandibulaire comme suit. 750 souris vigiles sont immobilisées par une contention de base en s’assurant que la tête est bien immobilisée. Puis la veine mandibulaire est piquée perpendiculairement avec une aiguille. 2-3 gouttes de sang sont prélevées directement dans un tube de prélèvement. Le prélèvement dure entre 5 et 20 secondes. Puis une légère pression pour arrêter le saignement est effectuée avec un papier absorbant.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement sanguin unique qui génère un stress et une douleur légère.
Devenir
Parmi les animaux de génotypes utiles soit 75% des souris correspondant à environ 563 animaux, 60 souris utiles seront replacées pour le maintien de la lignée et 503 souris seront utilisées pour les expérimentations en utilisation continue. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort soit environ 25% des souris correspondant à environ 187 animaux.
Remplacement
Le prélèvement sanguin pour génotypage ne peut-être remplacer par un autre prélèvement car seules les cellules sanguines expriment le marqueur permettant de génotypage ces souris. Les souris de cet élevage sont générées et utilisées pour réaliser des expériences de greffes de cellules souches afin de tester leurs fonctions dans un individu à long terme (au moins 6 mois). A ma connaissance aucun système de culture in vitro, in silico ou ex-vivo ne permet de tester la fonction à long terme des cellules souches hématopoïétiques dans des conditions physiologiques identiques à celles d’un individu vivant (sans biais, ni stresse cellulaire pouvant altérer la fonction de dormance de ces cellules).
Réduction
Nous allons produire un nombre d’animaux en lien avec nos besoins (environ 150 animaux par an). Le nombre de cages de croissements pour générer les souris nécessaires à nos projets scientifiques est réduit au minimum requis.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances liées aux prélèvements sanguins ceux-ci seront réalisés par un technicien animalier employant une méthodologie éprouvée, rapide, précise et standardisée. Pour rétablir la volémie des animaux vigils prélevés en sang, le même volume d'une solution saline physiologique (NaCl 0,9%) sera injectée à ces animaux en sous-cutané.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires (ex : Anticorps, cytokines…) et permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Les animaux seront caractérisés le plus tôt possible vers l'âge de 4-5 semaines.
Evaluation de l’immunogénicité de la protéine VP2 du virus de la peste équine chez les équidés
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Treize prises de sang par cheval et deux injections d'un vaccin à cinq semaines d'intervalle : 15 chevaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet teste trois doses d'un candidat vaccin contre la peste équine, une maladie des équidés transmise par des moucherons, sur trois groupes de cinq chevaux. Les injections peuvent provoquer une légère douleur, un gonflement local et une hausse passagère de la température, les ponctions un hématome. Le porteur retient le cheval comme "l'espèce cible la plus sensible au virus", après des essais où la protection des souris vaccinées a été totale, et prévoit de garder les prélèvements comme "matériaux de référence" pour son laboratoire. Tous les chevaux sont gardés en vie, puis réutilisés pour d'autres activités de recherche.
Objectifs
La peste équine est une maladie des équidés causée par un virus figurant sur la liste des maladies à déclaration obligatoire de l'Organisation mondiale de la santé animale en raison de son taux de mortalité élevé (~95 %) chez les chevaux. Ce virus est endémique dans les zones tropicales et subtropicales d'Afrique, mais s'est propagé à plusieurs reprises hors de son habitat africain au 20eme siècle, provoquant de graves épidémies dans le bassin méditerranéen et en Europe et, plus récemment, jusqu'en Thaïlande. Le virus est transmis d’un animal à un autre par des moucherons piqueurs hématophages. Les facteurs liés au changement climatique (températures, vent) peuvent permettre l'introduction de ces vecteurs dans des régions jusqu’alors indemnes, et accroître le risque d’introduction du virus, comme cela a été montré pour les virus de la fièvre catarrhale du mouton (FCO) et de la maladie hémorragique épizootique (MHE), qui sont aussi vectorisés par les moucherons. La FCO et la MHE ont émergé en Europe et ré-émergent chaque année pendant la période d’activité de ces moucherons. Les mesures pour prévenir et traiter la peste équine restent limitées. Bien qu'un vaccin utilisant le virus de la peste équine atténué, c’est-à-dire non infectieux, soit disponible et utilisé en Afrique du Sud, il existe un potentiel de retour à la virulence, et son utilisation en Europe n’est pas approuvée. Le but de cette étude est de développer des vaccins innovants pour la peste équine. Ces vaccins sont constitués de protéines formant une nanostructure, sur laquelle sont greffés des antigènes. Les antigènes sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation). L’antigènes d’intérêt pour cette étude est la protéine virale VP2, connue pour induire une réponse immunitaire chez l’animal infecté et ainsi de protéger complétement l’animal vacciné d’une infection. Ces candidats vaccins ont été testés sur des souris sensibles à l’infection et la protection des souris vaccinées a été totale. L’objectif de ce projet est maintenant de tester ces candidats vaccins dans l’espèce cible la plus sensible au virus, qui est le cheval. Dans le but de déterminer la meilleure composition du vaccin permettant d’induire la meilleure production d’anticorps, 3 doses d’antigènes seront testées. Au total, 3 groupes de 5 chevaux feront l’objet de cette étude.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer si le candidat vaccin permet la production d’anticorps contre le virus de la peste équine jusqu’à 1 an après la vaccination et ainsi protéger les équidés lors d’une infection qui peut leurs être fatale. De plus, les prélèvements issus de cette expérimentation serviront de matériaux de référence pour les activités du laboratoire.
Procédures
Les chevaux recevront 2 injections du vaccin (1 minute) à 5 semaines d’intervalle. Au total, 13 prises de sang (2 minutes par prise de sang) seront réalisées par cheval lors de cette procédure.
Impact sur les animaux
Les chevaux peuvent ressentir une légère douleur lors des injections du vaccin et lors des prises de sang de contrôle. Il existe un risque très faible de formation d’hématome à la suite de la ponction veineuse. Un gonflement local au niveau du point d’injection du vaccin peut être observé ainsi qu’une augmentation transitoire de la température.
Devenir
Les chevaux seront tous gardés en vie et réutilisés pour d’autres activités de recherche.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif pour tester l’efficacité du vaccin pour la production des anticorps spécifiques sur l’espèce cible la plus sensible au virus : le cheval. Ce vaccin a été précédemment testé sur le modèle murin avec succès.
Réduction
Au total 15 chevaux seront utilisés pour cette procédure et répartis dans 3 groupes distincts (3 doses différentes de vaccins). Par lot, le nombre de chevaux a été fixé à 5. Le nombre de 5 chevaux par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure par des tests statistiques non paramètriques.
Raffinement
La vaccination sera réalisée par un vétérinaire et les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel expérimenté avec une contention légère (tenue au licol) par un animalier familier au sein de leur groupe pour limiter le stress. Un vétérinaire, praticien hospitalier spécialisé en médecine équine, sera présent lors de la primo vaccination et du rappel et restera sur site pendant les 24 heures suivantes, pouvant ainsi intervenir en cas de nécessité. Il sera également contacté en première intention en cas d’effets indésirables pendant toute l’expérimentation. Puis les animaux seront suivis les 5 jours suivant chaque injection du vaccin avec notamment une prise la température rectale des animaux matin et soir, un suivi visuel au niveau du point d’injection et un relevé de toutes postures / comportement anormal (perte d’appétit, abattement, difficulté à baisser l’encolure). Les animaux seront hébergés en groupe en stabulation avec une alimentation 100 % fourrage durant les 5 jours suivant les injections de vaccin et au pâturage en groupe le reste du temps. Si un effet indésirable devait survenir, la prise en charge sera assurée par le vétérinaire et serait la suivante : - injection en urgence de cortico-stéroides et d’adrénaline en cas d’anaphylaxie (réaction quasi-immédiate avec difficulté cardio-respiratoire, sudation, douleur abdominale, tremblements…), - injection de corticoïdes, s’il s’agit d’une réaction de type allergique (démangeaison, chaleur au point d’inoculation, gonflement voire abcès), - des soins locaux seront réalisés en cas d’inflammation marquée, - et des anti-inflammatoires oraux seront administrés en cas de douleur. Les posologies appliquées seront celles recommandées par le vétérinaire. L’expérimentation serait alors arrêtée.
Choix des espèces
La peste équine est un virus d’importance sanitaire dans les populations équines. L’espèce cible pour ce candidat vaccin est donc le cheval. Pour cette étude, des animaux adultes seront inclus afin qu’ils aient un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps.
Impact du stress in utero sur l’inflammation et la douleur
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Trois séances de contention sous lumière vive par jour, trente minutes chacune, six jours de suite pendant la gestation, voilà ce que subissent une partie des 1 442 souris de ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des pansements posés sur le dos sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines et des injections intrapéritonéales aux jours embryonnaires 7,5 et 10,5. Le porteur écrit que le modèle murin reste un "élément clé et incontournable" pour étudier l'effet du stress prénatal sur l'inflammation de la peau, faute de modèle cellulaire équivalent. Les mâles reproducteurs seront transférés à d'autres équipes, les femelles gestantes tuées à E18.5 ou après le sevrage, et les fœtus prélevés puis tués pour analyse.
Objectifs
Influencés par une variété de facteurs environnementaux, les maladies allergiques connaissent une augmentation constante de leur prévalence à l'échelle mondiale, tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. D'une façon intéressante, ces maladies sont souvent déclenchées ou aggravées par le stress chronique, bien que les données biologiques expliquant ces phénomènes restent largement incomplètes. Notre projet a donc pour objectif d'examiner l'effet du stress sur la susceptibilité à développer une inflammation allergique, et le cas échéant, de dévoiler les mécanismes moléculaires responsables de cet effet. En effet, la période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris les systèmes nerveux et immunitaire, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence l'existence de ce qu'on appelle 'unités sensorielles' dans la peau, formées par les mastocytes (cellules immunitaires spécialisées) et les neurones sensoriels (responsables de la détection de stimuli sensoriels), qui contribuent au développement de l'inflammation allergique de la peau. Nous éméttons donc l'hypothèse que le stress, plus particulièrement le stress prénatal, pourrait contribuer au développement de l'inflammation de la peau de la descendance in utero, en perturbant, au moins en partie, les phénotypes des mastocytes et des neurones sensoriels, et donc les unités fonctionnelles neuro-immunes cutanées associées.
Bénéfices attendus
Le présent projet aborde une question clé en explorant le rôle de l'exposition du fœtus au stress prénatal et ses conséquences sur la susceptibilité à développer une inflammation après la naissance. Il permettra de dévoiler, pour la première fois, les mécanismes biologiques sous-jacents activés par l'exposition au stress. Cela apportera des informations inestimables sur d'éventuels événements indésirables prénataux associés au développement des caractéristiques classiques de l'eczema pédiatrique, donnant lieu à des publications de haut niveau, protégées par des brevets découvertes et, surtout, de nouvelles options thérapeutiques/préventives potentielles pour les troubles allergiques.
Procédures
- Procédures 1/3: Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour durant 30 minutes, sur 6 jours consécutifs. Nombre de souris: 140 (P1)+162 (P3) = 302 - Procédure 2: Un pansement imbibé d'une solution physiologique sera déposé sur le dos des souris, sous anésthésie, 2 fois par semaine (lundi et mercredi, 3-5min par souris), pour une durée de 3 semaines (3 cycles au total). Nombre de souris: 504 - Procédure 4: Les souris seront injectées au jour embryonnaire 7.5 ou E10.5 en intra-péritonéal (~1min/souris). Nombre de souris: 360 - Procédure 5: Les souris seront injectées en intra-péritonéal avant chaque session de stress (~1min/souris), voir trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs. La génération F1 sera patchée (3-5min par souris). Nombre de souris: 276
Impact sur les animaux
Dans le projet proposé, les souris subiront des procédures de classe modérée qui pourraient avoir des effets indésirables ou des nuisances. Les principales nuisances attendues sur les animaux incluent: (1) comportements anormaux liés au stress comme la prostration, isolement, absence de nettoyage (bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberait le comportement soit de la souris stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà faites en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle); (2) Irritation cutanée due à l'application du patch: l'application de patch peut causer une légère gêne cutanée, une irritation temporaire sur la zone d'application et une légère inflammation; (3) Les injections pourraient causer une douleur passagère au site d'injection et un stress modéré due à la manipulation répétée. Ces effets indésirables vont être soigneusement surveillés et gérés pour minimiser l'impact sur le bien-être des animaux, en appliquant les mesures de raffinement appropriées décrites dans la section 5.10.3.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure correspondante: - Les souris mâles utilisées pour les accouplements seront séparées et proposées à la communauté scientifique. - Les souris femelles utilisées pour les accouplements et subissant le stress seront euthanasiées ou bien au jour embryonnaire E18.5 ou bien après le sevrage (semaine 3). - Les souris de la descendance seront euthanasiées à E18.5 ou à la semaine 8 avant toute intervention ou après le patch.
Remplacement
Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques, induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut substituer l'usage d'animaux pour investiguer cela. La substitution également par l'humain n'est pas évidente, étant donné que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des échantillons de foetus ou de mamans durant la gestation/ou atteints d'éczema n'est pas toujours possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le dialogue entre neurone sensoriel et mastocyte dans le cadre de l'inflammation de la peau.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal et de patch de peau (protocoles éthiques obtenus précedemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne (12 femelles par groupe, par génotype, réparties entre controle et stress). Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2mâles x 3femelles. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées.
Raffinement
Jusqu'à présent, le taux de mortalité issu des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Quant au modèle de patch ou de stress, aucun taux de mortalité n'a été détecté jusqu'à présent. D'autre part, lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera monitoré régulièrement. Nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement de prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si nécessaire, des antalgiques seront administrés (surtout si des effets indésirables liés au patch surviendront bien qu'aucune manipulation précédente n'a impliqué cela). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien des signes de baisse de température (isolement, mouvement moindre, confirmée par la prise de la tempéraure corporelle et détéction d'une baisse de 3° par rapport à la température d’origine), les animaux seront euthanasiés. Ces cas de figure n’ont encore pas été présentés lors des procédures employées dans d’autres protocoles éthiques déjà validés. Enfin, nous utiliserons des techniques de préhension adaptée (main en coupe ou igloo) aux souriceaux afin d'éviter un stress supplémentaire et maintenir le bien-être des souris. Les injections seront aussi réalisées par un personnel compétent pour éviter la douleur des souris. Les souris mâles mis en accouplement seront réutilisés par d’autres expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des mastocytes et des neurones sensoriels, et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intêret mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: 1- Jour embryonnaire E13 à E18: cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Non seulement cette période est celle décrite pour le modèle, mais elle correspond également à la période de développement des cellules d'intêret, y compris les neurones et les mastocytes. 2-Jour embryonnaire E18.5: les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélévés, euthanasiés et analysés pour les études à l'état basal. Ce stade représente le dernier jour du protocole de stress ainsi qu'un time-point où les neurones et les cellules immunitaires sont déjà présents dans la peau des souris. 3- Semaine 8: les souris de la génération F1 seront patchées à l'âge de 8 à 12 semaines car elles présentent un système immunitaire mature à ce stade. Le modèle de patch dure 3 semaines, les souris seront euthanasiées à la fin du modèle.
Comparaison in vitro de molécules sur des macrophages canins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une entreprise privée cherche des molécules anti-inflammatoires à commercialiser pour la santé canine et fait prélever du sang sur des chiens pour en isoler des macrophages. 12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun subissant deux prélèvements de 30 mL à la jugulaire espacés de quinze jours, sur animal vigile. Le porteur revendique un "besoin" de molécules anti-inflammatoires pour l'espèce canine et présente le passage par des macrophages cultivés comme un moyen d'éviter des tests sur animaux vivants. Ces chiens ne sont pas tués mais réutilisés, et il juge probable qu'ils participent encore à une séance de travaux pratiques en fin d'année avant d'être proposés à l'adoption.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est d'étudier les activités et la réponse biologique de 4 molécules potentiellement anti-inflammatoires sur les macrophages (cellules immunitaires qui ont pour rôle de contribuer à l'entretien et au bon fonction des tissus) isolés à partir de sang canin. En effet, il existe peu ou pas de molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires en santé animale et il existe notamment un besoin pour l’espèce canine. Ce type de projet a déjà été mené sur du sang bovin mais nous manquons d'informations sur les cellules de l'immunité dans le sang canin. Cette étude est donc une étape préliminaire qui se concentrera principalement sur (1) une meilleure connaissance des caractéristiques des macrophages chez le chien, (2) l'étude des interactions entre de potentielles molécules anti-inflammatoires et ces macrophages canins.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la sélection de molécules anti-inflammatoires pour améliorer la santé des chiens.
Procédures
Pour chaque chien, deux prélèvements sanguins de 30 mL espacés de 15 jours. Chaque prélèvement sanguin dure au maximum 1 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont très faibles. Nous ne préleverons en effet pas plus de maximum 7% de la volémie totale sur 15 jours avec seulement une ponction par veine jugulaire sur des animaux vigiles. Les prises de sang engendreront donc une douleur très modérée et de très courte durée.
Devenir
Les animaux pourront être réutilisés à l'issue de la procédure. Il est probable qu'ils participent à nouveau à une session de TP en fin d'année et qu'ils soient proposés à l'adoption par la suite.
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux car les macrophages canins doivent être obtenus à partir de sang canin. En effet, il n'existe pour le moment aucune lignée de macrophages canins de disponible sans passer par des prélèvements sur animaux. Cependant, les molécules seront testées pour leur action anti-inflammatoire. Or, les macrophages dérivés in vitro sont un modèle relevant pour tester ces molécules tout en évitant les tests in vivo.
Réduction
La réalisation des tests des molécules anti-inflammatoires directement sur les macrophages permet de réduire le nombre de chiens utilisés au total pour le projet (seulement 12 chiens pour cette étude contre au moins 8 chiens*4 molécules =32 chiens si le projet final était mené directement sur animaux vivants). De plus, cela permet également de diminuer les actes menés sur les animaux (seulement 2 prises de sang à 15 jours d'intervalle).
Raffinement
Les chiens sont hébergés en groupe (2 à 4 chiens) avec un accès en extérieur 5 jours/7. Les animaux sont observés en continu le jour des prises de sang pour vérifier qu'il n'y a pas d'irritation due à la tonte des poils ou de formation d'hématome suite à la ponction. Pour limiter le stress des chiens lors des prises de sang, ils ont été habitués en amont à se tenir sur une table, être contenus par un animalier, au bruit de la tondeuse, aux pressions sur la jugulaire, ... et récompensés lors de chaque entrainement.
Choix des espèces
L’espèce canine a été choisie par l’entreprise privée car son objectif est de trouver des nouvelles molécules pour améliorer la santé des chiens. Les animaux seront des animaux adultes car c'est la population ciblée pour les essais des molécules inflamatoires par la suite.
Suivi du devenir des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs et de leurs effets sur le système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
7 324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales, une partie ensuite des injections intraveineuses ou directement dans la tumeur deux fois par semaine pendant neuf semaines au maximum, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires sur trois semaines et une mesure de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine. Le projet vise à suivre les vésicules émises par les tumeurs et à comprendre comment elles agissent sur les cellules immunitaires, des applications thérapeutiques n'étant évoquées que comme une possibilité ouverte à cinq ans. Le porteur annonce dix souris par groupe expérimental comme règle générale, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 7 324 animaux du projet.
Objectifs
Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques. Ces vésicules sont sécrétées par toutes les cellules, mais lorsqu’elles sont sécrétées par les cellules tumorales, elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Bon nombre d’études dans ce domaine reposent sur l’utilisation de modèles de culture cellulaire très éloignés d’un contexte physio-pathologique. L’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, est donc une étape cruciale pour comprendre comment les tumeurs communiquent avec notre système immunitaire grâce à ces vésicules extracellulaires. Notre projet de recherche vise à suivre in situ ces vésicules extracellulaires, afin d'étudier leur capacité à interagir avec les cellules du système immunitaire et à en moduler la fonction, de comparer le devenir de différents types de vésicules extracellulaires émises par les cellules tumorales, et d’analyser le mode d’action de ces vésicules dans les cellules réceptrices. Une dernière étape consistera à moduler in vivo la sécrétion de ces vésicules de tumeurs pour moduler leurs effets sur le système immunitaire. Ces travaux permettront d’analyser le rôle de ce mode particulier de communication entre les tumeurs et le système immunitaire. Ils pourraient ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses ciblant spécifiquement ce mode de communication. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre cellules cancéreuses et système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Dans le contexte des immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer, il est essentiel de mieux comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le système immunitaire. Ce projet étudie la communication entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire grâce au développement de nouvelles méthodes de suivi de vésicules extracellulaires. Il a pour objectif d'identifier le type de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires issues des tumeurs et de comprendre le mode d’action de ces vésicules. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques en identifiant les types de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires. Notons que ces vésicules s’accumulent dans les fluides corporels, elles peuvent donc être aisément ciblées par des stratégies thérapeutiques basées sur des protocoles d’injection .
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées à tous les animaux vigiles (1 fois par expérience, durée du geste inférieure à 10 sec). Certains animaux sont ensuite traités selon 3 protocoles: soit directement dans l’eau de boisson, soit par injections aux animaux vigiles (2 injections à 24h d’intervalle – durée du geste inf à 10sec) soit par eau de boisson et injections. Certains animaux reçoivent un produit préparé au laboratoire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10sec), et d’autres par voie intra-tumorale, ou un produit commercial par voie intra-tumorale, 2 fois par semaine au long de l’expérience (maxi 9 semaines). Des prélèvements sanguins à raison d’1 prélèvement/sem pendant 3 sem) sont réalisés sur une partie de ces animaux (durée de chaque prélèvement inf 20sec – animaux sous anethésie légère). Les animaux sont observés et le développement de la tumeur est mesuré par pied à coulisse 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 20 sec).
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’injection sont limitées à la piqure elle-même : douleur légère immédiate, durée brève. La supplémentation de l’eau de boisson avec de la(Vitamine H, ne devrait pas avoir d’effet sur la quantité d’eau bue par les animaux. Aucun effet délétère n’est attendu y compris en cas de surdosage. Les nuisances attendues lors des injections de « traitement » ou des prélèvements sanguins seront celles liées aux piqures elles-mêmes (douleurs légères immédiates de courte durée)
Devenir
Les animaux seront sacrifiés pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus.
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la validation des méthodes de suivi des vésicules extracellulaires dérivées de tumeur et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles. Le projet, centré sur l’étude d’un mode particulier de communication intercellulaire, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.
Réduction
1. Les tests in vitro nous ont permis de sélectionner les molécules d’intérêt, réduisant donc le nombre d’animaux à utiliser 2. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à notre modèle, notamment le taux d’obtention de tumeur par injection de cellules tumorales, et permettra l’analyse finale de groupes d’au moins 8 animaux. Il se base aussi sur nos connaissances de nos modèles tumoraux et prend en compte la quantité de matériel cellulaire nécessaire pour les 3 types d’analyses biochimiques post-mortem prévues. Toutes les lignées tumorales génétiquement modifiées seront au préalable validées in vitro.
Raffinement
Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle. Les souris seront suivies tous les 3 jours pour surveiller leur état général. Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. En cas d’atteinte des points limite tel que décrit dans la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Implication des cellules lymphoïdes innées de type 2 dans la réponse allergique.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.
Objectifs
Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.
Procédures
Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.
Impact sur les animaux
La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.
Remplacement
La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.
Raffinement
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.
Choix des espèces
La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.
Evaluation de l’éfficacité d’immunotherapies à base de cellules CAR-T innovantes contre cellules tumorales.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T sous anesthésie ouvrent le protocole, suivies chaque semaine d'une injection dans l'abdomen et de huit minutes d'anesthésie gazeuse pour photographier la tumeur, pendant quatre à six semaines. 5 600 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec un prélèvement sanguin trois semaines après l'injection des cellules CAR-T et des pesées hebdomadaires. La tumeur peut provoquer douleur, mobilité réduite, perte de poids et prostration. Les souris jugées inaptes lors de la constitution des groupes sont tuées aussitôt, les autres au gaz carbonique avant tout point limite, à la fin de la période ou dès que l'objectif scientifique est atteint.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, exploite les mécanismes naturels du système immunitaire pour combattre diverses maladies, notamment le cancer. Une approche importante de cette thérapie consiste à isoler des cellules du système immunitaire du patient (les lymphocytes T) et à les modifier génétiquement pour les rendre capables de reconnaitre et cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après culture et expansion en laboratoire, ces cellules modifiées connues sur le nom de CAR-T, sont réintroduites dans le patient, où elles traquent et détruisent sélectivement les cellules cancéreuses, constituant ainsi une approche innovante et un espoir dans le traitement du cancer. En effet, les cellules CAR-T sont désormais un élément essentiel de la prise en charge des patients atteints de cancers, tout comme la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et autres thérapies ciblées. Et pour cause, elles ont démontré des résultats cliniques remarquables dans le traitement des cancers du sang en rechute ou résistants aux traitements classiques, et sont en cours de développement pour les tumeurs solides. Malgré leurs succès, les cellules CAR-T présentent des défis et des limites. Des recherches actuelles visent à améliorer ces cellules en utilisant des manipulations génétiques pour réduire leur toxicité, les rendre plus durables dans le corps et prévenir leur perte d’efficacité anti-tumorale au fil de temps. De nombreux partenaires, faisant appel à notre expertise, s'efforcent à comprendre et à évaluer les conséquences des modifications génétiques spécifiques introduites dans les cellules CAR-T sur leur efficacité dans la lutte contre les tumeurs. Ils cherchent également à étudier comment les cellules CAR-T interagissent avec d'autres traitements potentiels tels que des médicaments ou des anticorps pour contrôler la progression des tumeurs. Pour ce faire, après la conception et la modification génétique de variants spécifiques de cellules CAR-T, nous évaluerons leur réponse anticancéreuse en les caractérisant d'abord dans le laboratoire (in vitro), puis en suivant leur évolution et en étudiant leur fonctionnement dans un modèle ronger (in vivo) greffé avec des lignées cancéreuses d’origine humaine. L’évaluation fonctionnelle in vivo est cruciale pour valider l'efficacité thérapeutique préclinique des différents variants de cellules CAR-T dans le traitement de différents types de cancers chez l'homme.
Bénéfices attendus
Bien que les cellules CAR-T, approche thérapeutique en plein essor, offrent des avantages significatifs dans le traitement de certains types de cancer, elles font face à plusieurs défis et limitations. Pour mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, des études expérimentales approfondies et des essais précliniques sont nécessaires Les traitements ciblant spécifiquement les tumeurs avec des cellules CAR-T peuvent parfois entraîner des effets secondaires sérieux, comme une réponse inflammatoire sévère et des problèmes neurologiques. De plus, ces thérapies peuvent être limitées par la durée pendant laquelle les cellules CAR-T restent actives dans le corps, la complexité de l'environnement autour de la tumeur et le manque d'antigènes spécifiques aux tissus cancéreux et n’étant pas exprimés sur les tissus sains du patient. Malgré les avancées dans le développement de différentes générations de cellules CAR-T, les progrès technologiques offrent de nouvelles possibilités pour améliorer encore leur efficacité et leur tolérance chez les patients. Dans le domaine de la recherche sur les cellules CAR-T, les modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines sont extrêmement importants. Ils fournissent une plateforme pour étudier différents aspects, tels que la façon dont les cellules CAR-T reconnaissent les cibles tumorales, comment elles s'activent, leurs mécanismes d'action, leur durée d'activité, et comment elles sont tolérées. En recréant des conditions similaires à celles des patients atteints de cancer, ces modèles offrent un environnement expérimental précieux. En outre, ils reproduisent la diffusion et la migration des cellules CAR-T dans tout le corps, contribuant ainsi à une meilleure compréhension des réponses thérapeutiques et des interactions complexes entre cellules dans le contexte du traitement du cancer.
Procédures
Les souris seront soumises à divers actes de manipulation tout au long de ce projet, à savoir : 2 injections uniques de cellules par voie intraveineuse sur animal anesthésié au début de projet (
Impact sur les animaux
La durée de chaque étude inscrite dans ce projet est de 4-6 semaines, en fonction du type de tumeur ciblée et du temps nécessaire à sa croissance. Au cours de cette période, les animaux seront soumis à plusieurs procédures techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress, tels que : injections de cellules tumorales, injection de cellules CAR-T, suivi tumorale par imagerie ou par pied au coulisses, prélèvement sanguin (1 seul prélèvement de sang 3 semaines après l’injection de cellules CAR-T) et des pesées hebdomadaires. Des effets indésirables liés à la croissance tumorale pourraient apparaître : douleur, mobilité réduite, perte de poids, prostration. Cependant, nous avons mis en place des points limites pour minimiser la gêne et l'inconfort des animaux causéx par la présence de la tumeur. En cas de persistance de ces signes l’animal sera mis à mort. Tous les actes techniques sur les souris seront réalisés par du personnel expérimenté et spécialisé dans ces techniques afin de limiter les contraintes subies par l’animal, ce qui garantit leur bien-être tout au long des étapes expérimentales
Devenir
Au début de notre étude, lors de la constitution des différents groupes d’animaux en expérimentation (randomisation), ceux qui ne remplissent pas les conditions requises pour que la tumeur se développe correctement seront euthanasiés immédiatement. L'euthanasie par inhalation de CO2 sera appliquée à tous les animaux de l'étude avant d'atteindre tout point limite éthique, à la fin de la période expérimentale, ou dès que l'objectif scientifique est accompli.
Remplacement
Nous étudions attentivement comment différents modèles de cellules CAR-T, qui sont des cellules immunitaires modifiées pour combattre les cellules cancéreuses, fonctionnent. Pour ce faire, nous effectuons plusieurs tests pour comprendre à quoi elles ressemblent (leur phénotype) et comment elles agissent (leur fonction). Cependant, ces tests ont leurs limites car ils sont réalisés dans des conditions de laboratoire, en utilisant des plaques de culture où les cellules CAR-T sont mises en contact avec des cellules tumorales. Malgré toute l’information qu’il nous apporte, ce système en laboratoire est très simplifié et ne prend pas en compte de nombreux éléments importants qui existent dans le corps humain, notamment l'environnement complexe autour des tumeurs. Pour vraiment comprendre comment ces cellules CAR-T pourraient fonctionner chez les personnes, en l’occurrence chez les patients atteins de cancers, il est nécessaire de les étudier dans un organisme vivant, tel quel un modèle murin, qui reproduit de manière plus réaliste les conditions que l'on trouve chez les humains. En utilisant des souris, nous pouvons confirmer comment les cellules CAR-T agissent et si elles peuvent surmonter les défis rencontrés dans l'environnement autour des tumeurs. Ces défis incluent un réseau complexe de différentes cellules, de signaux moléculaires, de vaisseaux sanguins, et d'autres éléments qui interagissent de manière dynamique et qui peuvent limiter l'efficacité des cellules CAR-T. Ces interactions sont difficiles à reproduire de manière réaliste en laboratoire. En résumé, étudier ces cellules dans des organismes vivants nous aide à choisir les cellules CAR-T qui sont les plus prometteuses pour le traitement du cancer, en éliminant celles qui ne montrent pas d'activité anticancéreuse. Cela nous donne une base solide pour continuer notre recherche et pouvoir apporter ainsi du rationnel scientifique pour le développement des traitements plus efficaces contre le cancer.
Réduction
Dans la première étape de ce projet, nous étudions et vérifions l’activité anti-tumorale des diverses versions de cellules CAR-T face à un ou plusieurs modèles de tumeur, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations sur des souris. Cela signifie que nous essayons de faire le moins d'essais possible et d'utiliser le moins d'animaux nécessaires, tout en faisant en sorte de garantir la fiabilité de nos résultats. Nous considérons également d’autres éléments nous permettant de réduire le nombre de souris en expérimentation, notamment : a) l’analyse de plusieurs groupes d’étude en même temps avec un seul groupe témoin ; b) le suivi de la croissance de tumeurs chez les souris par imagerie spécial (bioluminescence), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux étudiés, car les images peuvent être extraites des mêmes sujets au fil du temps sans avoir à sacrifier l’animal pour mesurer la croissance des tumeurs ; c) les types de lignées de cellules cancéreuses que nous utilisons ont été étudiés en détail, ce qui nous permet de déterminer la quantité optimale de cellules à injecter pour que la tumeur se développe, réduisant ainsi le nombre de groupes d’animaux nécessaires pour tester différentes quantités de cellules tumorales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans les expériences seront hébergés dans un environnement dédié, appelé zone EOPS, dans des cages par groupes de 5 au maximum, du même sexe, avec suffisamment d'espace pour se déplacer librement et un accès libre à la nourriture et à l'eau. Pour rendre leur habitat plus agréable, nous enrichirons leurs cages en ajoutant de la litière en copeaux de bois stérilisée, une maisonnette en carton pour qu'ils aient un endroit où se cacher, ainsi que des morceaux de papier Kraft ou "Sizzle Pad" qu'ils pourront grignoter pour construire un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telle que les injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T seront réalisées sous anesthésie. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour repérer tout signe de détresse ou de souffrance chez les souris, et des mesures appropriées seront immédiatement prises Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons une grille de notation qui prend en compte leur comportement naturel, leur comportement en réponse à certaines situations, les changements de poids, ainsi que les caractéristiques expérimentales, comme l'apparence et la taille des tumeurs. Si les scores atteignent des seuils critiques préétablis, cela pourrait entraîner l'euthanasie de l'animal. Toutes les personnes impliquées dans ce projet ont les qualifications nécessaires et ont démontré les compétences requises pour manipuler les animaux de manière éthique. Pour suivre la croissance des tumeurs, nous utiliserons principalement une méthode non invasive appelée bioluminescence in vivo sous anesthésie gazeuse. Si nécessaire, nous effectuerons des mesures régulières à l'aide d'un pied à coulisse.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce animale dont le fonctionnement interne (physiologie) se rapproche le plus de celui de l'Homme ce qui justifie notre choix d'utiliser des souris comme modèle. Les souris présentent une similitude génétique élevée avec les humains, avec 99% de leurs gènes correspondants à ceux de l'homme. Cela signifie que les résultats obtenus lors des études sur les souris sont plus susceptibles de refléter les réponses biologiques humaines. Actuellement, l'utilisation de souris immunodéficientes (agées de 8 semaines), répresent un avantage majeur pour notre approche, en raison de leur déficit immunitaire profond, facilitant ainsi la prise de greffe de cellules immunitaire et de cellules tumorales, toutes les deux d’origine humaine. Ceci offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules CAR-T humaines dans un modèle de souris. En outre, les souris sont des animaux de petite taille, qui se reproduisent rapidement et sont faciles à élever en laboratoire.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour fournir à des laboratoires utilisateurs des souris dotées d'un système immunitaire humain, une plateforme prévoit de faire naître en cinq ans 4 800 souris de quatre lignées immunodéficientes, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux reçoivent avant 9 jours de vie des cellules souches humaines, chaque souris une irradiation, puis selon les protocoles jusqu'à huit prises de sang, des injections répétées sous la peau, dans l'abdomen, le muscle ou les veines, du gavage, jusqu'à dix séances d'imagerie, une greffe de tissu humain, une infection par le VIH ou des cellules tumorales humaines qui provoquent des tumeurs. Immunodéficientes, elles sont exposées aux infections et aux dermatites, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs, observées selon le porteur chez moins de 10 % des adultes. Une souris prise de dyspnée dans les 5 à 10 minutes suivant une injection hydrodynamique est mise à mort. Le projet ne déclare aucune souris gardée en vie. Le porteur écrit pourtant que des souris pourront être incluses, "à la demande des utilisateurs de la plateforme", dans d'autres procédures décrites dans une demande de projet ultérieure, et n'annonce la mise à mort que pour celles de la procédure de validation d'immunomodulateurs.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)
Impact sur les animaux
Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
ous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 770 souris par an soit un total de 3850 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 8 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). Afin de produire ces souris HIS, nous aurons 4 lignées de souris immunodéficientes en élevage en continu. Nous aurons 2 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x2trios= 240 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 240x5ans = 960 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 4 lignées, 960x4 = 4800 animaux produits en 5ans.
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (