Système immunitaire

162 500 animaux non-humains vont être utilisés pour un seul geste chacun, trois millimètres de queue ou d'oreille coupés en cinq secondes chez 150 000 souris vigiles, quatre millimètres carrés de nageoire caudale prélevés sous anesthésie chez 12 500 poissons zèbres. Les procédures sont déclarées légères pour 156 750 d'entre eux et modérées pour 5 750, ce dernier niveau correspondant aux lignées dont les mutations provoquent, selon le porteur, "des douleurs, de l'inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités". Le projet relève de la gestion d'élevage, identifier génétiquement les animaux produits et repérer les lignées dont les mutations nuisent, pour constituer les lots destinés à d'autres projets. Le porteur écarte la pommade anesthésiante, qui allongerait l'intervention et pourrait gêner le génotypage, ainsi que l'analgésie par injection, et estime à 60 000 les animaux gardés vivants sur cinq ans pour renouveler les reproducteurs ou partir en expérimentation, les autres étant tués quand leur combinaison de gènes ne sert ni à l'élevage ni aux expériences.

Objectifs

L'établissement utilisateur est constitué de deux instituts de recherche qui s’intéressent à différents domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie,...). Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux précliniques génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations dans les élevages (appelé phénotypes dommageables) de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits (appelé : le génotypage). L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des scientifiques de ces instituts.

Bénéfices attendus

Pour le bénéfice direct, ce projet permet d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des chercheurs pour les expérimentations qui seront faites à l'issue de ce projet. Il permet également de prendre en charge rapidement et donc de minimiser les souffrances qui pourraient être induites par les mutations des modèles animaux. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines. Ce projet permet la caractérisation génétique ces modèles qui sont ensuite utilisés sur des projets dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de ces pathologies et pour notre établissement dans de nombreux domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie, …)

Procédures

Les souris vigiles seront prélevées d’un petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum de tissu), l’intervention dure 5 secondes et se fait une seule fois par animal. Les poissons subiront une anesthésie par balnéation suivie d’un prélèvement d’une portion de 4mm² (5% maximum) de la partie cartilagineuse de la nageoire caudale, capable de régénération complète en 20 jours. Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. Elles apparaissent à différents temps de la vie de l’animal et sont directement pris en charge. Il y a également une procédure spécifique pour évaluer le bien-être des animaux lors de la création d'une lignée génétiquement altérée. Elle est non invasive et est basé sur l’observation de paramètres zootechniques et physiologiques en élevage.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissu pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention, de la pêche par épuisette ou de la sédation (poisson) et de la douleur légère lors de la coupe du tissu. En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable, induisent en général et à des degrés divers, des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est sans douleur sauf si un phénotype s'avère dommageable par cette évaluation. Cette demande de projet traite ces nuisances pour en minimiser aux maximum les souffrances animales.

Devenir

Les procédures d'évaluation et de gestion des phénotypes dommageables s'appliquent durant toute la vie des animaux. Les animaux pourront être mis à mort en élevage pour la gestion de la colonie ou bien partir en utilisation continue en expérimentation. Pour les procédures de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique des animaux le devenir peut-être soit la mise à mort car la combinaison de gènes n’est pas utilisable pour les expérimentations et l’élevage, soit les animaux sont gardés en vie pour renouveler les reproducteurs en élevage ou sont utilisés sur des projets expérimentaux prévus pour ces animaux (estimé à 60000 animaux sur 5 ans).

Remplacement

Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques . Les modèles animaux sont justifiés par la nécessité de caractériser des mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux (en neuroscience, cardiologie, oncologie par exemple). Les chercheurs des instituts développent ces modèles le plus souvent après avoir testé leurs hypothèses sur des systèmes moléculaires et cellulaires et justifié le remplacement dans leurs demandes d’autorisation de projet expérimentaux. Dans l’institut nous encourageons l’utilisation de modèles alternatifs. Par exemple une équipe a mis en place des organoïdes intestinaux qui leurs a permis de développer et consolider leurs hypothèses avant le passage sur leurs modèles de souris génétiquement modifiées. Des modèles cellulaires sont également utilisés. Enfin les projets des instituts explorent les mécanismes de pathologies complexes faisant intervenir de nombreux tissus et interactions cellulaires, le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable.

Réduction

Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Nous favorisons les élevages qui fournissent 100% d’animaux utiles ce qui permet de réduire le nombre d’animaux à produire d’une part et d’autre part permet de ne pas génotyper tous les individus. Pour le génotypage en gestion de colonie, nous recherchons systématiquement les lignées non ou peu utilisées. La production de ces lignées est soit fortement réduite, soit arrêtée. Elles sont en parallèle sécurisées par cryoconservation des gamètes ou des embryons. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable. Enfin, nous cherchons à améliorer nos pratiques. Tout d’abord, si le prélèvement invasif est indispensable, nous nous orienterons vers la coupe à l’oreille par rapport à la coupe de queue plus douloureuse et nous sommes en cours de mise au point de la technique de prélèvement de follicule de poil considérée sans douleur que nous espérons pouvoir mettre progressivement en place dans les années à venir. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est basée sur les recommandations du guide Européen sur les animaux génétiquement altérés soit 14 animaux sur 2 générations.

Raffinement

Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées en routine et le geste est très court et précis. La douleur est légère. Le raffinement est de s’assurer d'un process cadré et éprouvé, appliqué par des zootechniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l’intensité et la durée de la douleur induite. L’utilisation de pommade anesthésiante n’est pas envisagée pour éviter une intervention plus longue et le produit pourrait interférer avec la technique de génotypage. L’analgésie par injection n’est aussi pas recommandée car la piqûre augmente la nuisance sur l’animal. Toutefois, les éléments suivants sont mis en place : manipulation par un zootechnicien expérimenté, le poste de prélèvement est codifié et préparé en amont pour éviter les gestes parasites pendant le prélèvement pour réduire le stress des animaux. L’animal est pris en contention et la biopsie est rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et aiguisé pour réduire le temps et intensité de douleur. L’animal, remis dans sa cage est observé. En cas de mauvaise reprise de l’activité ce qui constitue le principal point limite, il sera pris en charge. Les observations quotidiennes permettent de s’assurer de la bonne cicatrisation. En cas de mauvaise cicatrisation (point limite) des pommades cicatrisantes peuvent être utilisées. Chez le poisson un raffinement particulier est apporté aux conditions d’isolement maintenues dans le système d’hébergement en circulation, maintenant des paramètres d’eau stables. Le point limite est de s’assurer de la bonne nage des poissons. Pour le raffinement des phénotypes dommageables, les lignées sont aujourd’hui bien connues et le phénotype bien caractérisé. La stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances (le caractère spécifique du phénotype ne nécessite pas l’utilisation d’une grille pour la détermination du point limite). Il peut s’agir également d’avoir une procédure d’hébergement adapté avec l’ajout d’un enrichissement ou des manipulations très douces pour les lignées modèles d’épilepsie par exemple. La procédure d’évaluation du bien-être animal est non invasive et sans douleur basée sur l’utilisation d’une grille de paramètres zootechniques et physiologiques. Le risque est la détection d‘un phénotype dommageable qui sera immédiatement pris en charge et classifié selon la procédure sur la gestion des phénotypes dommageables.

Choix des espèces

La création de modèles pour comprendre des pathologies humaines est très développée chez la souris car les outils pour générer ces modèles génétiquement modifiés sont très efficaces. D’autre part, la souris est un mammifère avec de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’homme. Son temps de génération est considéré court (3 mois) et son élevage simple en laboratoire. Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la recherche : une fécondation et un développement embryonnaire externe rapide et transparent, la facilité d’accès au matériel génétique permettant le développement des techniques d’ingénierie génétique. Son génome présente 70% d’homologie avec celui de l’homme (85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines), il présente également des capacités originales de régénération des tissus (système nerveux, rétine, cœur, etc.) qui en font un modèle idéal pour la compréhension de ces mécanismes, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Pour les biopsies : souris à partir de 14 jours jusqu'à 4 semaines maximum. L'essentiel des lignées sont génotypées à 14 jours pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte. La biopsie de nageoire : majoritairement jeune adulte entre 1 et 3 mois avant maturité sexuelle afin de ne conserver que les animaux de génotype d'intérêt à l'âge adulte, des animaux plus vieux peuvent être concernés en cas de doute ou erreur sur le génotype.

Tatouées aux phalanges à trois semaines puis biopsiées à la queue pour génotypage, les souris reçoivent à l'âge adulte une injection intrapéritonéale de cellules tumorales qui déclenche un adénocarcinome ovarien, colorectal ou pancréatique. 2 493 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 448 d'entre elles, avec des traitements administrés par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale tous les quatre jours pendant soixante jours. Le porteur décrit une accumulation de liquide d'ascite dans le péritoine aux stades tardifs et une altération de l'état général, tout en affirmant que des résultats antérieurs ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints, le seuil de mise à mort étant fixé à 40 % de prise de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le sang et les organes.

Objectifs

Il est reconnu que les cellules du microenvironnement tumoral, et plus particulièrement les macrophages, sont des acteurs clé dans le contrôle de la progression tumorale et de la réponse aux traitements. Plus récemment, d’autres cellules de la lignée des cellules myéloïdes, dont font partie les macrophages, ont été décrites et seraient recrutées au niveau de la tumeur. Au cours de la carcinogénèse, les macrophages, cellules de la défense immunitaire, basculent d’un phénotype anti-tumoral vers un phénotype favorisant la croissance tumorale. Ainsi, trouver des cibles et des traitements permettant de moduler le recrutement et le phénotype des cellules myéloïdes pourraient faire avancer les stratégies thérapeutiques du cancer. Nous avons en partie défini le rôle des macrophages, au cours de la progression tumorale dans différents cancers (adénocarcinome ovarien, carcinose péritonéale d’origine colorectale, cancer du pancréas). Pour la suite de ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de différents traitements pharmacologiques. Nous disposons de souris délétées spécifiquement au niveau des cellules myéloïdes pour des facteurs clé de la polarisation (Récepteur nucléaire PPAR-γ, facteurs de transcription LRH-1). Ainsi nous pourrons identifier plus clairement les voies de signalisation impliquées dans l’effet de nos agents pharmacologiques sur le recrutement et la polarisation des cellules myéloïdes dans la progression tumorale. Ces agents pharmacologiques pourraient agir en synergie avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle ou éviter une rechute due à l’acquisition d’une chimiorésistance. Ainsi, nous souhaitons en parallèle étudier l’association de ces agents pharmacologiques avec le traitement de référence. Nous utiliserons ensuite des modèles déplétés pour différentes populations immunitaires (macrophages, ou lymphocytes) afin d’évaluer la part respective des différents acteurs cellulaires dans l’effet des agents pharmacologiques testés. Une autre approche thérapeutique envisagée serait le transfert adoptif de cellules myéloïdes polarisées en vue de bloquer la progression tumorale.

Bénéfices attendus

La recherche des mécanismes modulant le recrutement et les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale dans des modèles expérimentaux de cancers chez la souris, nous permettra de définir des cibles thérapeutiques pertinentes. L’évaluation de l’effet de différents agents pharmacologiques dans différents modèles de cancers (ovarien, colorectal et pancréatique) de proposer des thérapies ciblées selon le type de cancers.

Procédures

Les souris seront identifiées au sevrage (à 3 semaines) par tatouage au niveau des phalanges afin de pouvoir suivre de manière individuelle chaque animal. Une biopsie de queue sera effectuée pour le génotypage. Lorsque les souris sont adultes, un adénocarcinome ovarien sera induit par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales. les souris seront ensuite traitée à l’aide d’agents pharmacologiques avec un suivi sur 60 jours (observations, suivi du poids). Deux autres types de cancers seront étudiés, un adénocarcinome colorectal et cancer du pancréas induits par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales avec un suivi de 15 jours. Les traitements seront administrés par voie orale (eau de boisson ou par gavage) ou par voie intrapéritonéale tous les 4 jours pendant 60 jours ou tous les jours pendant 15 jours selon le modèle. Les observations et suivi dupoids nous permettront de suivre l'évolution de la maladie. Au sacrifice, des prélèvements (sang, différents organes), nous permettront d'étudier le dévéloppement des cellues tumorales et l'effet des traitements.

Impact sur les animaux

Les modèles murins trangéniques dont nous disposons dans cette étudene présenta pas de phénotype dommageable. Des tests de cytotoxicité des agents pharmacologiques seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Dans ces modèles murins de carcinose, un liquide d’ascite s’accumule dans le péritoine lors des stades tardifs de la progression tumorale. Le développement tumoral peut engendrer un gain de poids important des souris avec une altération de l’état général. Les animaux seront mis à mort si la prise de poids est supérieure à 40% du poids initial, si les animaux présentent des signes de mutilations, des difficultés respiratoires. La durée de l’étude est définie selon des résultats antérieurs qui ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints. Pour le traitement par injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson, la prise hydrique sera évaluée journalièrement.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes

Remplacement

Nous testerons plusieurs types de molécules (agents pharmacologiques) qui sont susceptibles de pouvoir moduler les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale. Ces molécules, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule sur les processus tumoraux. Des tests de cytotoxicité de ces molécules seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Ces tests seront réalisés sur des cellules myéloïdes, population cible des molécules, et sur les lignées tumorales utilisées pour les modèles tumoraux chez la souris. Cette étape est essentielle pour éliminer les molécules pouvant induire la prolifération des cellules tumorales et pour estimer la concentration à administrer aux souris. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé.

Réduction

Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres évalués, qu’un nombre de 6 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi). Le projet sera conduit en progressant par étape afin de limiter le nombre d’animaux. Une étude pilote sera menée pour déterminer l’innocuité et le choix d’agents pharmacologiques et de la durée de traitement Le choix des modèles transgéniques sera également réduit en fonction des résultats obtenues dans les premières étapes de ce projet et les approches in vitro qui seront menées en parallèle.

Raffinement

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). le développement tumoral des animaux sera surveillé ainsi que son état général. Un animal sera mis à mort s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie générale et anesthésie locale. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Les mécanismes impliqués dans le développement des cancers sont complexes. Ainsi, cette étude permettra d’étudier dans leur contexte physiopathologique les cellules myéloïdes, cibles thérapeutiques potentielles, et ne peut pas être mimée par une approche de culture cellulaire.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Adultes, souris âgées de 8 à 20 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.

Produire des lignées de souris transgéniques, importées de banques internationales ou créées sur place par CRISPR-Cas9 : 2 185 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 450 d'entre elles et modéré pour les 735 autres. Des femelles reçoivent deux injections hormonales à 48 heures d'intervalle pour être superovulées, d'autres sont opérées sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes pour qu'on leur réimplante des embryons dans l'utérus, et des mâles sont vasectomisés par section des canaux qui transportent les spermatozoïdes. Le porteur attend des douleurs après l'opération abdominale et des complications de cicatrisation, infection, gonflement ou ouverture de la plaie. Les femelles superovulées sont tuées pour recueillir leurs embryons, les receveuses après gestation et allaitement faute d'appareil reproducteur intact, et les mâles vasectomisés lorsque leur capacité d'accouplement est jugée nulle, constatée après huit accouplements sans résultat.

Objectifs

Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste - À introduire au sein de notre animalerie des lignées de souris transgéniques déjà existantes dans des laboratoires extérieurs ou dans des banques internationales, par des techniques de reproduction assistée (ART). - En cas d’indisponibilité de ces modèles, créer de nouvelles lignées de souris transgéniques par des techniques de transgénèse notamment en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 , prix Nobel 2020

Bénéfices attendus

Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour tester les concepts permettant de développer de futures thérapies innovantes.

Procédures

Certaines femelles seront injectées 2 fois à 48H d’intervalle. Le geste ne dure que quelques secondes. D’autres femelles seront anesthésiées en vue d’être opérées pour une réimplantation d’embryons dans la cavité utérine (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes) Enfin, des mâles seront anesthésiés avant d’être opérés. L’opération consiste à couper les canaux qui transportent les spermatozoïdes (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même. Les femelles réimplantées avec les embryons ainsi que les mâles vasectomisés subissent une chirurgie. Une douleur est attendue à la suite de l’opération abdominale. Aussi la cicatrisation peut rencontrer certains problèmes : infection, gonflement, ouverture de la plaie

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les embryons à une cellule. Les mâles vasectomisés sont utilisés pour leur capacité d’accouplement. Ils sont mis à mort lorsque cette capacité est nulle, établie après 8 accouplements sans femelle accouplée. Nous transférons des embryons chez des femelles receveuses en effectuant une incision au niveau de l’appareil reproducteur. Ces souris ne présentent donc pas d’appareil reproducteur intact pour pouvoir être réutilisées pour une deuxième expérience. Elles sont mises à mort après avoir mené à terme leur gestation et allaitement

Remplacement

En amont du projet, les chercheurs effectuent systématiquement des analyses préalables in-vitro quand cela est possible (culture de cellules, organoïdes…). Cependant, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Nous favoriserons l'importation de modèles transgéniques déjà répertoriés et caractérisés dans des bases de données. Cependant, si le modèle n'est pas disponible, nous créerons un modèle innovant par les approches de transgénèse ou de FIV

Réduction

Nous avons optimisé nos procédures pour générer des modèles innovants de souris génétiquement modifiées. Nous associons la technologie CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020) à la technologie d’électroporation d’embryons pour le transfert de matériel génétique dans le noyau des embryons à une cellule. De nombreuses améliorations ont été apportées : • Optimisation des outils CRISPR/Cas9 grâce à des analyse in-silico • Choix des souches de femelles receveuses les plus adaptées pour recevoir ces embryons et mener à bien les gestations et les allaitements. Ces optimisations nous ont permis de diminuer d’un facteur 2 le nombre de souris donneuses et receveuses nécessaires à la création d’un modèle génétiquement modifié Nous avons également développé la technique de Fécondation In-Vitro (FIV), permettant la production de cohortes d'animaux de même âge tout en diminuant fortement le nombre d’animaux utilisé. Les approches de transgénèse et de reproduction assistée n’utilisent pas d’approche statistique.

Raffinement

L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale, par ailleurs des analgésiques permettent de prendre en charge la douleur liée à ces chirurgies. Un fluide réhydratant chauffé à 37°C est systématiquement injecté en fin de chirurgie afin d’éviter des problèmes de déshydration et permettre un réveil de qualité. Les souris opérées sont placées sur un tapis chauffant et reçoivent de la nourriture riche en graisses (9.9%) ainsi que des graines de tournesol disposées au fond de la cage. Cette disposition leur permet de se nourrir sans avoir à se mettre sur leurs pattes arrière et tirer sur leurs cicatrices. Les animaux seront surveillés pendant les 2 jours suivant l’opération pour vérifier que la cicatrisation se passe bien Il est extrêmement rare d’observer des complications dans ce types d’expériences. Néanmoins, la grille de score permettra l’arrêt l’expérience en cas d’observation d’une souffrance chez l’animal

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée - superovulation efficace et embryons faciles à injecter Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les femelles sont utilisées jusqu'à l'âge de 6 mois, tandis que les mâles sont utilisés jusqu'à l'âge de 12 mois.