Système urogénital

Une partie des 288 souris porte des mutations parmi les plus fréquentes du cancer de la prostate humain, et à 5 mois, après un traitement au tamoxifène à 8 semaines de vie, les souris présentent selon le porteur des lésions précancéreuses et des adénocarcinomes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, une chirurgie de 45 minutes pour implanter une mini-pompe qui diffuse pendant six semaines le composé GC7 ou une solution saline, puis une seconde chirurgie pour la retirer. Le porteur écrit avoir choisi la mini-pompe afin d'"améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes", un choix qui impose deux opérations. Toutes sont tuées par lots, de trois semaines après le début du traitement jusqu'à un mois après sa fin, pour le prélèvement d'échantillons.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie durant une période de 6 semaines une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue en maitrisant la dose délivrée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigenèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation d'isoflurane durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe puis d'une seconde intervention chirurgicale à son retrait. L'administration du composé a lieu en continu pendant 6 semaines. A la fin du traitement, les pompes seront retirées sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane (30 minutes). Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous aseptie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 1 mois après la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des échantillons et leur analyse. Par ailleurs, un temps d'observation de 1 mois est nécessaire pour laisser le temps au composé d'agir et d'avoir un effet sur la croissance des tumeurs, ce qui justifie d'attendre un mois.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques et 5 souris pour l'analyse des transcrits soit 2 génotypes x 18 souris x 2 conditions x 4 temps, donc 288 souris. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques. Nous aurons les génotypes des souris contrôle et des souris mutantes, et les 2 conditions eau saline et GC7. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec protection du cycle veille/éveil par des systèmes de lampes programmées. Une nourriture adaptée aux rongeurs ainsi que des biberons d'eau seront disponible à volonté. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. De la naissance à la mort et afin de favoriser le bien-être animal, les groupes sociaux des animaux seront respectés et aucun animal ne sera laissé seul. Nous mettrons aussi dans chaque case de la cellulose afin que les souris puissent se constituer un nid. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée sera mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés au Tamoxifène à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques et des adénocarcinomes. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, puis un lot à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.

60 brebis vont être utilisées, gardées vivantes à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un implant sous-cutané de mélatonine, une injection intramusculaire et dix-sept prises de sang à la jugulaire, pour évaluer une hormone de synthèse censée remplacer l'eCG dans la maîtrise de la reproduction. Le porteur reconnaît que la production de l'eCG "pose des problèmes en termes de bien-être animal" et vise à étaler la production de lait et de viande sur l'année. Il affirme que l'efficacité de ces hormones ne peut être évaluée que sur animaux vivants et qu'"aucune alternative n'existe".

Objectifs

La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnière (en période de jours courts). Chez les deux sexes, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel (contre-saison), en général de février à juillet. La durée de la saison sexuelle est très variable selon les races. La reproduction des brebis et des chèvres en contre-saison permet aux éleveurs d’étaler la production de lait ou de viande sur l’année, et ainsi de répondre à la demande des consommateurs. Dans le cadre de cette pratique (appelée « désaisonnement »), l’insémination animale (IA) est utilisée chez les petits ruminants quasi exclusivement après un traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations (mimant les mécanismes endocriniens), méthode aujourd’hui la plus efficace pour désaisonner la mise à la reproduction. Les conditions de production de l’eCG (gonadotropine chorionique équine) utilisée dans le cadre de ce traitement posent des problèmes en termes de bien-être animal. C’est pourquoi le projet a pour objectif d’évaluer chez la brebis l’efficacité d’une molécule de synthèse (la GnRH, « Gonadotropin-Releasing Hormone » ou gonadolibérine, médicament vétérinaire) qui pourrait permettre à moyen-terme de remplacer l’eCG.

Bénéfices attendus

Le projet s'inscrit dans un contexte d'évolution des pratiques de maîtrise de la reproduction vers la réduction, voire la suppression, de l’utilisation de traitements hormonaux pour la synchronisation des chaleurs et des ovulations chez les ruminants. La recherche de méthodes alternatives est en cours, notamment via le développement et/ou l’évaluation de traitements vétérinaires (molécules de synthèse) posant moins de problème en termes de bien-être animal et d’enjeux environnementaux.

Procédures

Les brebis seront soumises à une pose d'implant sous-cutané de mélatonine (une seule fois par brebis, durée moyenne d'environ 30 secondes), à des injections par voie intramusculaire (une seule injection par brebis, durée de quelques secondes) et à des prises de sang (au total 17 prélèvements/brebis, durée de prélèvement moyenne d'environ 30 secondes par brebis).

Impact sur les animaux

Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie dans l'établissement utilisateur à l'issue du projet.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des hormones gonadotropes sur l’induction et la synchronisation des ovulations chez les brebis ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative n’existe.

Réduction

Le projet utilisera 60 brebis réparties en 3 lots : lot 1 témoin eCG (n=12 brebis), lots 2 et 3 GnRH (24 brebis/lot). Les variables étudiées seront la proportion de brebis ovulant après traitement, le jour d’augmentation de progestérone plasmatique > 0,5 ng/ml et la proportion de brebis gestantes. Des calculs de puissance ont été faits avec ces 3 variables afin de déterminer le nombre de brebis/lot. Le nombre minimum de brebis à inclure par lot est déterminé par la variable proportion de brebis gestantes après IA. L’objectif de cette étude exploratoire est de déterminer si les ovulations induites par la GnRH de synthèse sont fertiles et si la fertilité obtenue nous incite à poursuivre (ou pas) cette stratégie pharmacologique.

Raffinement

Les brebis sont hébergées dans la bergerie de l'installation. Lors de la constitution des lots expérimentaux, une habituation au parc de tri et un marquage de la toison avec une peinture adaptée (pour repérer les lots) sont réalisées. Afin de respecter la grégarité de l’espèce, les brebis sont placées ensemble en lots sur litière paillée et leur contention pour les différentes interventions est faite dans un espace réduit (entre des claies ou au parc de tri) en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence répétée des expérimentateurs en interaction positive en dehors des procédures (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du comportement de fuite de l’animal et donc de son stress face à la contention. Les brebis sont surveillées de façon journalière (état général des animaux, vérification du site de prélèvement sanguin). En cas de signes d'inflammation ou de maladie, un traitement adapté sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale ou avec son intervention si nécessaire.

Choix des espèces

L’espèce ovine est la cible de l’étude de façon à remplacer l’utilisation de l’hormone eCG dans le cadre du traitement d’induction et de synchronisation des ovulations utilisé en élevage afin de pratiquer l’insémination animale. De façon à tester l’efficacité d’hormones gonadotropes pour contrôler le cycle oestrien des brebis, le projet utilisera des brebis adultes, sexuellement matures et ayant déjà agnelé lors d’une reproduction antérieure.

90 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées en élevage. Chaque animal subit cinq anesthésies générales de 45 minutes en 48 heures, séquence répétée deux mois plus tard, avec des jeûnes de 29 puis 18 heures, pour suivre par IRM la rétention d'un gel contraceptif destiné aux femmes. Le porteur présente ce gel comme une "alternative révolutionnaire" affichant "100 % d'efficacité in vitro" et justifie la brebis par la proximité de son col utérin avec celui de la femme. Il affirme que le comportement du gel dans le tractus ne peut être appréhendé in vitro et nécessite une validation chez l'animal vivant.

Objectifs

La présente demande s’intègre dans un projet plus vaste visant à développer un gel contraceptif d’origine naturelle (non hormonal) à destination des femmes, comme alternative aux méthodes hormonales existantes. En effet, celles-ci provoquent des effets secondaires et/ou del'inconfort, tels que prise de poids, diminution de la libido, augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de dépression. Malheureusement, les contraceptifs non hormonaux existants sont souvent peu pratiques. Ce projet propose de développer in vitro, puis de tester in vivo chez la brebis, un gel à déposer au niveau du col de l’utérus, qui en interagissant avec le mucus, formerait un bouchon empéchant le passage des spermatozoïdes. L’objectif ici est de mieux comprendre le comportement du gel contraceptif une fois introduit dans le vagin de la brebis. En effet, le comportement du gel dans le tractus reproducteur de l’animal est étroitement lié à son efficacité. Cette expérimentation cherche à répondre à 2 questions : 1- quel est le temps de rétention du gel dans le tractus reproducteur, et en quelles quantités ? 2- quelle est la localisation exacte du gel au cours du temps ? En effet l’hypothèse est que plus le gel est proche du col de l’utérus (voire dans le col), plus il sera efficace. Pour ce faire, la technique d’IRM sera utilisée. En effet, cette méthode non invasive permet de suivre le même animal au cours du temps, et ainsi de réduire la variabilité individuelle. Elle permet aussi de quantifier le gel, et d’avoir accès à l’intégralité du tractus reproducteur de la brebis, avec des images de haute qualité. De plus, la morphologie du col de l’utérus de la brebis ne permet pas d’y insérer des outils d’imagerie tels qu’échographe, fibre optique. La seule contrainte de cette méthode est qu’elle nécessite d’anesthésier les brebis avant de les passer à l’IRM, ce qui implique plusieurs anesthésies dans une même journée si l’on souhaite suivre l’évolution dans le temps du comportement du gel dans le tractus. Le gel contraceptif est constitué du polymère et d'excipients différents. Il existe donc de nombreuses possibilités de formulations différentes. Il s'agit ici de tester des gels avec des propriétés physiques, mécaniques et adhésives variables, et d'identifier la ou les formulations les plus adaptées.

Bénéfices attendus

Le gel contraceptif développé dans ce projet est présenté comme une alternative révolutionnaire aux méthodes actuellement existantes : hormonales (avec tous les effets secondaires connus), non hormonales (qui présentent elles aussi des inconvénients), et les méthodes dites non-techniques (qui ont une efficacité relative). Ce gel est en effet très efficace (100% d’efficacité in vitro annoncée), sans hormones, peu invasif et très pratique d’utilisation. Il représente donc une solution de choix pour les millions de femmes qui ne peuvent et ne veulent pas utiliser d’hormones. La partie développée ici permettra de mieux comprendre la cinétique du gel une fois appliqué dans le tractus, et ainsi de renforcer son efficacité, ainsi que sa sécurité d’utilisation (s’assurer que le gel est bien résorbé ou rejeté au bout d’un certain temps).

Procédures

5 anesthésies générales (d'une durée de 45 minutes) en 2 semaines, dont 4 sur 48 heures, espacées d'au moins 3 heures. Ceci répété une fois, après 2 mois de repos. Deux périodes de mise à jeun de 29 et 18 heures respectivement, répétées à 2 mois d'intervalle.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 5 anesthésies générales, entrecoupées de réveils, sur une période de 48 heures. Le temps de récupération peut être plus long au fur et à mesure de l’avancement de l’expérimentation. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse. Les animaux seront à jeun durant 29 heures pour la première journée de mesures. Du foin leur sera distribué le soir de cette première journée. Puis ils seront de nouveau à jeun pendant 18 heures la deuxième journée.

Devenir

Les animaux retournent à l'élevage à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’un produit destiné à l’usage chez l’Homme doit d’abord se faire sur animaux, lorsque cela est éthiquement admissible. Dans notre cas, l’efficacité du gel testé a été évaluée in vitro. Elle doit maintenant être confirmée in vivo, avant de pouvoir démarrer une phase d’essai chez la femme. Chaque formulation à tester sera au préalable évaluée in vitro pour la rhéologie, puis ex vivo sur des tractus pour les caractéristiques d'adhésion, et pour finir in vivo en version colorée et visualisation à l'endoscope. La concentration optimale de l’agent de contraste sera déterminée in vitro en amont. Le comportement du gel dans le tractus reproducteur, en tenant compte du mouvement de l’animal, des contractions naturelles du tractus, ne peut être appréhendé in vitro, et nécessite une validation in vivo.vo.

Réduction

L’utilisation de l’imagerie de façon répétée permet de limiter la variabilité individuelle, et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Une étude effectuée en 2012 visant à suivre la rétention de crême vaginale dans la brebis par scintigraphie gamma et par IRM chez la femme, a montré qu’un effectif de 6 brebis ou femmes par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences. Les animaux seront leurs propres témoins et suivis durant 4 périodes successives. L’intensité du signal du produit de contraste inclus dans le gel contraceptif sera mesurée par IRM pour ces 4 répétitions par animal. Les données seront analysées par un test non paramétrique. Un logiciel spécialement dédié au calcul d’effectifs pour tests statistiques, en tablant sur une diminution de 25 % du signal entre les périodes d’analyse, un risque alpha de 0.05 et une puissance de 95 %, nous donne le nombre requis d’animaux de 5 par lot. Pour assurer la réussite de l’essai, nous avons choisi la valeur de 6 brebis par lot.

Raffinement

L’IRM est un outil de choix pour investiguer de façon précise et non invasive des questions au niveau de l’organe ou du tractus entier. D’autres techniques ne nécessitant pas d’endormir les animaux ont déjà été testées, tels qu’utilisation d’un gel coloré et observation à l’endoscope, marquage fluorescent du gel et visualisation par endomicroscopie. Cependant, elles ne permettent pas de quantifier précisément le gel, ni de visualiser l’intérieur du col de l’utérus, ou d’avoir une vue d’ensemble du tractus génital. Les animaux seront maintenus en groupe, manipulés dans le calme. La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie chez des modèles ovins. Etant donné la succession des différentes anesthésies sur 48H, les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 16h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction par voie intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de produit anesthésiant pour obtenir une myorelaxation suffisante avant intubation orotrachéale. Postimagerie – Les animaux sont logés en cases collectives sur paille.

Choix des espèces

La brebis est un bon modèle pour notre étude. En effet, malgré que la morphologie du col de l'utérus de la brebis est plus complexe que celui de la femme, ces 2 espèces ont plusieurs points communs : ce sont toutes les deux des espèces à dépôt de semence au niveau du vagin, la sélection des spermatozoïdes se fait en grande partie par le mucus cervical, la longueur du vagin et le diamètre cervical sont proches. De plus, la brebis a déjà été utilisée à plusieurs reprises comme modèle pour tester des dispositifs contraceptifs; une équipe a montré en 2012 que des données récoltées chez la brebis sont comparables à celles obtenues chez la femme. La vache et la jument ne sont pas des modèles pertinents car ce sont des espèces à dépôt de semence intra-utérine pour les bovins, et les individus sont trop lourds et volumineux pour passer à l'IRM. Brebis adultes multipares pouvant être synchronisées.

180 animaux non-humains, 90 cochons et 90 moutons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des anesthésies générales et des interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures pour l'implantation de dispositifs médicaux, avant une autopsie et une analyse des tissus. Le projet évalue des dispositifs et techniques chirurgicales pour la santé gynécologique et obstétricale des femmes. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et d'"incontournable", en le présentant comme une obligation réglementaire pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités et domaines de la médecine s’intéressant à diagnostiquer, soigner et guérir les troubles, désordres, pathologies ainsi que leurs suites, comme les affections gynécologiques et de la sphère génitale (organes génitaux internes et externes et appareil suspenseur), les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité, les pathologies de la glande mammaire comme le cancer du sein et ses conséquences, ou à assurer le suivi des cycles hormonaux ou de certains états physiologiques comme la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques chirugicales en faveur de la santé de la Femme, pour le diagnostic et le traitement des pathologies gynécologiques et obstétricales par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patientes, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections par le recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. La réponse tissulaire, les cycles hormonaux et les modifications anatomo-physiologiques correspondantes en particulier durant la grossesse ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patientes représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s'assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de la femme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles. L'atteinte de l’objectif scientifique passe par l'utilisation d'animaux ayant une anatomie et/ou un contexte clinique (création de défect, modèle lésionnel) comparables à ceux observés chez la Femme.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie cérébrale, des tests sanguins après jeûne, un examen vaginal quotidien pour les femelles, et sont hébergées seules du début à la fin du projet. Le porteur reconnaît que l'isolement et le jeûne sont des sources de stress et de perte de poids. Il affirme que les interactions entre le cerveau et les organes ne peuvent être modélisées in vitro, l'objectif restant de comprendre le rôle d'un gène dans l'obésité.

Objectifs

Dans le cerveau, un liquide stérile circule dans des cavités appelées ventricules. Dans une region particulière du cerveau, la paroi du ventricule est constituée de cellules particulières que l’on nomme tanycytes. Or, les tanycytes jouent un role dans la balance énergétique, à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et et la dépense de calories, qui détermine le poids corporel. Ce rôle est particulièrement intéressant dans un contexte d’épidémie mondiale d’obésité. En outre, ces cellules produisent une molécule appelée Tbx3, dont le dysfonctionnement dans d’autres types cellulaires est connu pour favoriser le développement de l’obésité et du diabète. Cependant, le rôle de Tbx3 dans les tanycytes est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est d’empêcher la production de Tbx3 par les tanycytes, afin d’en étudier les conséquences sur le poids, la prise alimentaire et le contrôle de la glycémie (taux de sucre dans le sang), en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons également en étudier les effets sur la maturité et le comportement sexuels, qui sont des fonctions biologiques influencées par les tanycytes.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de Tbx3 dans les tanycytes dans le développement de l'obésité et du diabète, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, les tanycytes sont présents aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration de la fonction des tanycytes pour lutter contre l’obésité, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Les 400 souris de ce projet sont concernées par l’ensemble des gestes suivants (sauf indication contraire) : 1) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 2) Examen vaginal : cet examen d’une durée d’environ 10 secondes, légèrement invasif, est réalisé quotidiennement pendant 2 semaines, sur des souris adultes vigiles. Seules les femelles sont concernées, pour des raisons évidentes. 3) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite l’immobilisation de la souris dans un appareil, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris ne subiront cette analyse qu’une fois au cours de leur vie. 4) Tests sanguins : après un jeûne de 3 heures, les souris reçoivent une injection, puis 7 prélèvements sanguins (espacés d’au moins 15 min). Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Deux tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’une semaine. 5) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle. L’isolement débutera une semaine avant la chirurgie et se pousuivra jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement individuel des animaux peut être sour ce de stress. Un stress d’immobilisation est également à prévoir lors de l’analyse de la composition corporelle. Les tests sanguins nécessitent au préalable un jeûne de 3 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins réalisés à l’extrémité de la queue peuvent générer une légère douleur et un inconfort. Enfin, des douleurs post-opératoires sont attendues après la neurochirurgie.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour des pour réaliser des études moléculaires et biochimiques sur certains organes.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de Tbx3 dans les tanycytes sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle, la régulation de la glycémie, le cycle menstruel et les comportements sexuels. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec différents organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante d’une communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire et sexuel nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé nos différentes expériences sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines et seront habitués pendant au moins 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres, de sorte que chaque souris garde un contact visuel avec ses congénères. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les tanycytes sont un type cellulaire présent à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui renforce le potentiel translationnel de nos résultats. Toutes les souris de cette étude arriveront dans notre animalerie juste après leur sevrage (3 semaines). Pour certaines souris, les expériences débuteront au début de leur adolescence (4 semaines) alors que pour d’autres, nous attendrons l’âge adulte (9 semaines), afin de différencier les résultats obtenus à ces différents stades de développement.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour surexprimer la télomérase et développer une maladie rénale, elles reçoivent de la doxycycline dans l'eau de boisson puis des injections intra-péritonéales quotidiennes d'un inhibiteur pendant sept à vingt et un jours, avant mise à mort pour prélever les reins. Le projet cherche à savoir si une protéine, le TGF-b, intervient dans l'effet d'une autre cible sur la progression de la maladie, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que la complexité de la maladie interdit une étude sur cellules et conclut que l'objectif "nécessite le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

La hyalinose segmentaire et focale (HSF) est une maladie rénale chronique très agressive, de progression rapide et associée à un mauvais pronostique. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique pour cette pathologie rénale, et les patients souffrant de HSF suivent par défaut les mêmes protocoles thérapeutiques que ceux utilisés pour traiter les autres maladies rénales chroniques. Toutefois, les patients atteints de HSF présentent une faible réponse à ces traitements, leur fonction rénale ne s’améliore pas, et la grande majorité d’entre eux développent une insuffisance rénale terminale les obligeant à subir des dialyses puis des greffes de rein pour pouvoir survivre. Les causes de la HSF sont inconnues, mais des facteurs génétiques et cliniques sont associés au développement de cette maladie, tels qu’une inflammation anormalement maintenue, la consommation de médicaments, et un large spectre d’infections virales incluant le VIH. Aussi, les évènements moléculaires associés à l’initiation et à la progression de cette maladie restent méconnus. Toutefois, des études précédentes ont montré qu’une voie de signalisation importante pour la physiopathologie de la HSF impliquait la télomérase. En effet, l’augmentation anormale de l’expression de la télomérase chez la souris provoque un dysfonctionnement de la fonction de filtration rein qui montre alors les caractéristiques histologiques de la HSF. Ces souris permettant de surexprimer la télomérase représentent donc un modèle robuste de la HSF. Aussi, l’étude de ces souris a montré que le ciblage pharmaceutique de la protéine X (pX) permet de limiter les effets néfastes de la télomérase sur le rein. Cet effet bénéfique de la modulation de pX sur la progression de la HSF apparaît être associée à une stimulation du processus de sénescence dans le rein et à une augmentation du facteur de croissance transformant-b (TGF-b). TGF-b est une molécule décrite comme une cible de pX qui augmente la sénescence dans différents organes. Dans ce projet, nous allons déterminer si l’augmentation de TGF-b est nécessaire pour l’effet thérapeutique observé lors de la diminution de pX chez les souris surexprimant la télomérase. Pour ce faire, nous allons tester l’effet de deux inhibiteurs de TGF-b sur la progression de la HSF chez des souris invalidées pour pX et surexprimant la télomérase. Ce travail permettra de mettre en évidence de nouvelles stratégies pour le traitement des patients atteints de HSF.

Bénéfices attendus

La télomérase est surexprimée dans le rein des patients souffrant de la hyalinose segmentaire et focale, une pathologie rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale, et caractérisée par la reprogrammation des cellules rénales responsables de la filtration du sang, les podocytes, en cellules dédifférenciées et prolifératives. Nos résultats montrent que l’invalidation ou l’inhibition pharmaceutique de pX permet de restreindre les fonctions non-canoniques de la télomérase et ainsi d’empêcher la dérégulation des podocytes induite par la surexpression de la télomérase chez la souris adulte. Le projet présenté dans ce PEA permettra de déterminer si la modulation de pX réfrène la progression de la hyalinose segmentaire et focale via une stimulation de TGF-b dans ce contexte. Ce travail permettra d'ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber l'activité́ pro-proliférative de la télomérase dans une pathologie rénale associée à la prolifération des podocytes.

Procédures

Les animaux vont être taités à la doxycycline dans l’eau de boisson. Cette eau de boisson est additionnée de sucre afin d'atténuer le goût amer de la doxycycline et de favoriser l’hydratation des animaux. Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale d’inibiteur de TGF-b toutes les 24h dès le début du traitement à la doxycycline. Les injections seront effectuées alternativement à droite et à gauche de la ligne médiane abdominale. Les animaux seront injectés avec l’inhibiteur pendant 7 jours, 14 jours ou 21 jours. A l’issue de ces injections, les animaux seront sacrifiés et les reins seront collectés pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

La protéine pX est exprimée dans toutes les cellules du corps, mais avec des niveaux différents en fonction des organes ainsi qu’en fonction des types cellulaires au sein d’un même organe. L’organe montrant la plus forte expression de pX est le testicule. Ainsi, les souris mâles qui n’ont plus de protéine pX montrent des performances de reproduction amoindris. Cependant, aucun phénotype dommageable n’est observé chez ces animaux qui n’ont plus de protéine pX (femelles et mâles). Deux caractéristiques physiologiques observables sont associées à l’augmentation de l’expression de la télomérase chez la souris adulte : 1) La pousse accélérée des poils, suivi par leur perte. Ce phénotype n’a aucun impact sur le bien-être des animaux, et l’hébergement des animaux en groupes de 2 à 4 souris par cages favorise le maintien de la température corporelle des souris malgré la diminution de la densité des poils. Aussi, l’ajout systématique de carrés de coton dans les cages permet aux animaux de faire un nid, et ainsi favorise le maintien de la température corporelle. 2) La perturbation des cellules du rein, associée à un dysfonctionnement de la filtration rénale et au développement de la HSF.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de cette procédure expérimentale afin de permettre l'analyse histologique et moléculaire de leurs reins.

Remplacement

Ce projet d’expérimentation animale s’appuie sur des études préalables réalisées in vitro décrivant les processus moléculaires associant pX, TGF-b et le processus de sénescence cellulaire. Cependant, la HSF est un processus pathologique complexe, et l’étude du rôle de TGF-b sur la progression de cette maladie ne peut pas être réalisé sur des cellules en culture. Ainsi, par définition, cet objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Deux groupes de souris témoins (génotype sauvage et génotype i-TERTci) sont prévus afin d’évaluer les potentiels effets secondaires des inhibiteurs utilisés. Nous commencerons par réaliser le protocole sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Le protocole expérimental ne sera réalisé sur ces groupes que si nous notons un effet significatif des inhibiteurs employés sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Ainsi, pour réaliser ce projet, nous utiliserons un minimum de 90 animaux, et un maximum de 270 animaux.

Raffinement

L’évolution de la pathologie rénale sera surveillée étroitement dès le début des procédures. Aussi, dans le but de limiter l'impact de l’expression forte de la télomérase sur l’état général des animaux, et conformément à la réglementation éthique en vigueur qui impose de mettre en place les mesures permettant d’augmenter autant que possible le bien-être des animaux de laboratoire, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par les procédures expérimentales décrites dans ce projet grâce à l’utilisation d’une grilles de score. Si un problème est détecté sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

Le modèle murin i-TERTci utilisé dans ce projet, est un modèle de souris génétiquement modifiées déjà disponible au sein de notre animalerie qui présente les caractéristiques de la hyalinose segmentaire et focale (HSF) décrite chez l’Homme. Ce modèle est croisé avec des souris invalidée pour pX, et nos résultats montrent que cette invalidation restreint l’initiation et la progression de la HSF chez les souris i-TERTci. Les souris représentent un modèle de choix du fait des nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiées déjà générées dans les différents laboratoires mondiaux permettant de répondre aux questions scientifiques posées dans le présent projet. Pour ce PEA, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, d’après nos résultats préliminaires, c’est dans cette classe d’âge que la pénétrance du phénotype chez les souris i-TERTci est la plus élevée.