Système urogénital

225 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 mâles tués à l'issue et 25 femelles réutilisées pour d'autres projets. Les mâles subissent une chirurgie stéréotaxique ouvrant la boîte crânienne pour injecter un vecteur viral supprimant le récepteur aux androgènes, puis des tests de comportement sexuel, d'anxiété, de locomotion et de fertilité. Les 25 femelles, utilisées comme animaux stimulus, subissent une gonadectomie et des injections de progestérone. Le porteur affirme que l'étude du comportement de reproduction ne peut se faire que sur "l'organisme entier" et signale des risques de douleur post-opératoire, d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à la chirurgie et à l'anesthésie.

Objectifs

Ce projet vise à identifer les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction et du comportement de reproduction chez la souris adulte mâle. La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Une reproduction réussie requiert la production de gamètes mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle afin d’optimiser la fécondation. Chez le mâle, la fonction de reproduction ainsi que le comportement de reproduction sont contrôlées par le cerveau sous l’action des androgènes. Des études précédentes ont démontré un rôle de la signalisation androgénique au sein du cerveau contrôlant la fonction de reproduction ainsi que l’expression du comportement de reproduction mâle. Ces études ont utilisé des souris dont la délétion du récépteur aux androgènes ciblait l’ensemble du tissu neural tout au long de la vie sans distinction du type cellulaire (i.e. cellules gliales versus neurones) ni de la région cérébrale. Ici, nous souhaitons décrypter plus en profondeur les phénotypes cellulaires et les régions cérébrales régulées par les androgènes dans la fonction et le comportement de reproduction mâle à l’âge adulte. Dans ce but, nous déléterons spécifiquement le récepteur aux androgènes au sein d’une région spécifique du cerveau, la region préoptique médiane, dans les cellules gliales ou neuronales à l’âge adulte puis nous étudierons la fonction et le comportement de reproduction suite à ces délétions.

Bénéfices attendus

Les perturbations hormonales au cours de la vie peuvent avoir un impact majeur sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction par le biais d’altérations des structures cérébrales impliqués dans ces réponses. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des mécanismes d’action sous-tendant cette régulation. Les modèles transgéniques utilisés nous permettront de comparer les mécanismes neuraux des deux voies de signalisation majeures impliquant les récepteurs des oestrogènes et des androgènes chez le mâle.

Procédures

Un nombre de 200 souris mâles subiront une chirurgie sous anéthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Après 3 semaines de rétablissement, les souris subiront différents tests de comportements sexuels, d’anxiété et de locomotion ainsi que des tests d’étude de leur fertilité. L’ensemble de ces tests n’a pas d’effet indésirable. Un lot de 25 souris femelles subira des gonadectomies sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 15 et 30 minutes maximum. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées de progestérone avant les tests de comportement sexuels.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isofluorane pendant lesquelles une ouverture de la boîte cranienne est réalisée afin d’injecter dans une région cérébrale donnée un vecteur viral qui nous permettra de déléter le récepteur aux androgènes (AR). Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : - Une hypothermie - Arrêt cardio-repsiratoire liée à l’anesthésie - Une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux - Une perte de poids rapide. La délétion de l’AR dans l’ensemble du système nerveux dès la conception n’entraîne pas d’effets indésirables : nous ne nous attendons donc pas à des nuisances ou des effets indésirables suite à la délétion restreinte de l’AR dans la région préoptique à l’age adulte.

Devenir

Au sein de cette demande d’autorisation de projet 200 animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem nécessaires à l’étude du role du récepteur aux androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Les animaux stimuli nécessaires à l’étude du comportement sexuel mâle (25 femelles) seront réutilisés pour des projets au sein de l’équipe de recherche ou par des collaborateurs afin de respecter la règles des 3Rs.

Remplacement

L’étude des fonctions et comportements de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite des modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction et les méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet. La souris est le modèle animal sélectionné afin de tirer profit des techniques récentes (transgénèse conditionnelle et transduction virale) pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 1125 animaux (225 souris adultes et 900 souriceaux) sur 4 procédures qui nous permettront d’étudier le rôle du récepteur des androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. Un même groupe d’animaux est utilisé pour plusieurs tests. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et immunohistochimiques. Nous péléverons également d’autres organes et les garderons pour de futures études ou nous les proposerons aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Au cours des chirurgies, les animaux seront anesthésiés par anésthésie gazeuse. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie, les animaux seront injectés en sous-cutané avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : - Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie - Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) - Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcents du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine. - Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité - Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcents du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées. Suite à l’observation de ces critères et au diagnostic d’une douleur ou d’un mal-être animal, celui-ci sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la litérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux utilisés sont issus d’accouplements réalisés au sein de notre établissement utilisateur et seront utilisés à l’âge adulte lorsque leur maturité sexuelle est atteinte (à partir de 8 semaines). Chaque souris est identifiée soit par tatouage soit par encoche aux oreilles.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue isolée en cages métaboliques sur des grilles pendant plusieurs jours, avec de l'eau acidifiée et des prélèvements sanguins pratiqués au coin de l'œil, une autre reçoit des injections quotidiennes puis des régimes déséquilibrés en ions, pour étudier une protéine rénale mutée dans une maladie rare, l'acidose tubulaire distale. Le porteur reconnaît que les prélèvements oculaires peuvent léser l'œil, que l'isolement et la contention en cage métabolique stressent les souris et que les régimes provoquent une aversion alimentaire et une perte de poids. Il affirme que la culture de cellules rénales ne peut fournir un système intégré équivalent, juge le recours aux souris "indispensable" et les met toutes à mort pour prélever leurs reins.

Objectifs

Le rein contrôle la composition en ions et en eau de l'organisme. Cette fonction est rendue possible grâce à des cellules qui forment de longs segments en forme de tubes dans le rein. Il existe plusieurs types de cellules tubulaires qui ont chacune des fonctions particulières. Certaines cellules appelées cellules intercalaires sécrètent des acides dans l’urine en formation. Ces dernières sont importantes lorsque l’organisme est surchargé en acide comme dans plusieurs situations : diabète, régime riche en protéines, troubles du métabolisme. Le nombre des cellules du canal collecteur varient en fonction des apports en ions. Cette augmentation a un rôle important puisque son défaut entraine une perturbation de la régulation de l’état acido-basique pour autant sa régulation n’est pas bien comprise. Ce projet propose d’étudier le rôle d’une protéine située sur la surface des cellules intercalaires. Elle est mutée chez des patients atteints d’une maladie rare : l’acidose tubulaire distale qui peut conduire jusqu’à de sévères atteintes rénales et un trouble de la composition en ions du sang. Le gène muté chez les patients sera invalidé chez la souris permettant d’avoir un modèle d’étude pour cette maladie rare. Le projet aura aussi pour objectif de déterminer l’importance de protéines membranaires pour la sécrétion acide par le rein et le comportement des cellules intercalaires. Il n’existe pas de modèle alternatif de cellules intercalaires en culture au laboratoire qui reproduisent l’ensemble des cellules tubulaires du canal collecteur. Ce projet nécessite l’utilisation de souris dont la composition cellulaire rénale est proche de l’homme. Nous mesurerons la fonction du rein chez ces souris ainsi que le contenu en ions du sang de ces animaux. La composition cellulaire des reins de ces souris sera également explorée.

Bénéfices attendus

Les régulations de la sécrétion acide et du nombre de cellules permettant cette sécrétion sont mal connues. Pourtant, elles jouent un rôle fondamental dans le maintien bien équilibré d’un organisme pour son contenu en eau et en ions, pour le maintien du pH sanguin et une pression artérielle constante. Ce projet permettra de mieux connaitre certains mécanismes du rein qui sont modifiés lors de maladies comme l’hypertension ou de troubles métaboliques comme le diabète. Plus spécifiquement, il permettra d’établir un lien formel entre des mutations observés chez des patients et l’acidose tubulaire distale. Il permettra également de développer un nouveau modèle de maladie rare rénale.

Procédures

Pour étudier la fonction rénale et la sécrétion acide, 80 souris seront installées individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) sur 2 périodes de 7 jours consécutifs permettant de récolter leurs urines. L’eau de boisson des souris sera acidifiée pendant 17 jours permettant de solliciter les cellules intercalaires rénales. Trois prélèvements sanguins avant et après le traitement acide pour chacune de ces 80 souris permettront de mesurer les concentrations en ions du sang. Ces prélèvements durent environ 10 secondes sont réalisés sous anesthésie locale. Un autre lot de 112 souris exprimant une molécule fluorescente qui doit être induite par une molécule chimique injectée aux animaux quotidiennement pendant 5 jours. Une fois la molécule fluorescent induite, les souris subiront différents traitements dans la nourriture ou la boisson pendant 3 à 15 jours perturbant certains équilibres ioniques de l’organisme.

Impact sur les animaux

Des prélèvements sanguins sont nécessaires et seront réalisés au coin de l’œil ce qui peut être entrainer un risque de lésion ou d’inflammation dans la zone autour de l’œil et entrainer une douleur. Certaines souris seront maintenues en cages métaboliques ce qui peut provoquer un inconfort car elles sont maintenues sur une grille pendant plusieurs jours. La cage métabolique étant transparente, les souris ne sont pas à l’abri de la lumière ce qui peut provoquer un stress car cette espèce évite la lumière directe. De plus, l’hébergement dans ces cages se fait de manière individuelle en isolant chacune des souris ce qui peut provoquer un stress car leurs contacts sociaux sont diminués. Dans la cage à métabolisme, l’administration d’un traitement acide dans l’eau de boisson entraine une modification transitoire du pH sanguin qui pourrait provoquer un inconfort à l’animal. Une molécule est injectée à certaines souris et cela implique que les souris soient contraintes pour effectuer l’injection. L’injection induit un stress et une douleur au point d’injection. Une modification des apports en ions dans la nourriture lors des procédures expérimentales sera effectuée. Elle peut provoquer une aversion transitoire pour la nourriture et entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer les tissus (reins) et d’en analyser le contenu en cellules et de quantifier l’abondance de plusieurs transporteurs ioniques.

Remplacement

Les modèles de cellules rénales en culture ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées ; ce projet nécessite un systèmes intégré multi-cellulaire reproduisant fidèlement le canal collecteur. Ce modèle n’existe pas à l’heure actuelle. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable. De plus, nous avons besoin dans ce projet de deux souches de souris génétiquement modifiée. Une première souche permettra d’étudier l’inactivation d’un gène retrouvé chez des patients atteints d’une maladie rare. Une deuxième souche permettra de suivre le devenir de cellules rénales en y exprimant une molécule fluorescente. Ces expériences ne sont pas envisageables dans un modèle plus simple tel que la culture de cellules.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures du contenu sanguin en ions, les protocoles ont été élaborés pour réduire au minimum le volume de sang prélevé et ainsi faire trois mesures sur les mêmes animaux à 2 semaines d’intervalle entre chaque mesure. Cela permet de réduire le nombre total de souris d’une procédure. L’administration du traitement acide dans l’eau de boisson et l’utilisation des cages à métabolisme pour mesurer la fonction rénale ont été déjà validées par plusieurs publications permettant d’anticiper parfaitement le nombre souris minimum nécessaire au projet. Le nombre de souris a également été calculé pour détecter des différents significatives entre les différents mesures histologiques et biochimiques faites sur les reins prélevés après mises à mort des animaux. En évitant d’avoir un groupe contrôle pour chaque groupe de traitement, nous avons également put réduire le nombre de souris à utiliser.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). En cas de perte de poids importante, un aliment hydraté sera proposé aux souris Pour la mesure des concentrations ioniques dans le sang, le prélèvement sanguin (90µl) sera fait sur souris vigiles avec un collyre anesthésiant et sera confié à une personne qualifiée et expérimentée pour ce type de prélèvement. Le prélèvement sera de 90µl et correspond à un faible volume par rapport au volume de sang total d’une souris. Le protocole d’utilisation des cages à métabolisme comporte un suivi quotidien des animaux avec une mesure du poids, de quantité de nourriture ingérée et du volume d’eau bue tous les jours. Avant les mesures, une période d’habituation à la cage est réalisée. En plus, une habituation à la nourriture en poudre est réalisée. Un enrichissement (cylindre en plastique opaque) est également proposé permettant à l’animal de se mettre dans un endroit à l’abri de la lumière. Le séjour dans les cages à métabolisme a été réduit au minimum.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du rein très semblable au rein humain. Nous savons également que la protéine participant à la sécrétion acide dans le rein et qui sera étudié dans ce projet est présente dans les mêmes cellules chez l’homme et la souris. L’organisation des cellules rénales est également identique chez l’homme et la souris. Les souris utilisées dans ce protocole seront des souris adultes car le projet porte sur l’étude de la fonction rénale d’un organisme adulte.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections biquotidiennes puis, au vingtième jour, seize prélèvements sanguins sériés en une journée pour doser une hormone, avant d'être tuées le lendemain par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde. Le porteur indique que ces manipulations peuvent provoquer douleur, perte de poids et perte de mobilité, atténuées par des analgésiques. Il affirme qu'il est "impossible" d'utiliser un modèle in vitro et que l'étude de la kisspeptine sur la reproduction "nécessite un système complexe et vivant".

Objectifs

Dans certains contextes physiologiques, les taux de prolactine (une hormone produite par les cellules lactotropes situées dans l’hypophyse) augmentent induisant ainsi une infertilité permettant le bon déroulement des processus physiologiques associés (notamment lors de la grossesse ou des périodes d’allaitement). Cependant, des phénomènes pathologiques peuvent également induire une augmentation importante des taux de prolactine sanguine, avec des valeurs supérieures à 25ng/ml (contre 5 à 10 ng/ml en situation non pathologique) et induisant alors une hyperprolactinémie. Parmi les symptômes associés, la fonction de reproduction se retrouve être le principal processus physiologique impacté. A ce jour, l’hyperprolactinémie est principalement traitée par des agonistes dopaminergiques La reproduction est principalement contrôlée au niveau du système nerveux central, notamment grâce à la kisspeptine, un neuropeptide produit et sécrété par des neurones spécifiques de l’hypothalamus. De nombreuses études rapportent un lien fonctionnel entre la prolactine et la kisspeptine dans le cerveau. L’une d’entre elle a d’ailleurs mis en évidence l’inhibition drastique de l’expression de kisspeptine en cas d’hyperproduction de prolactine, ce qui réduit la sécrétion de l'hormone gonadotrophique (GnRH) et, ainsi, un hypogonadisme hypogonadotrophique et l’infertilité. Dans notre laboratoire, nous avons produit un analogue de la kisspeptine (ayant une demi vie plus importante que la kisspeptine endogène) et qui a déjà démontré des effets positifs sur la reproduction des animaux d’élevages et les rongeurs. Nous suggérons alors d’utiliser cet analogue de la kisspeptine dans le traitement de l’hyperprolactinémie en utilisant un modèle de souris dans laquelle les taux de prolactine seront très nettement supérieurs à la normale (à l’aide de mini pompes osmotiques délivrant de la prolactine à haute dose de façon continue, pour mimer la pathologie). Dans ce modèle, déjà utilisé dans d’autres études, l’augmentation de la production de prolactine mime ce qui est observé en cas d’hyperprolactinémie hypophysaires avec notamment l’absence de fertilité, l’inhibition de l’expression de la kisspeptine et la baisse importante de la sécrétion des hormones liées à la reproduction.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à utiliser notre analogue de la kisspeptine, comme traitement d’une pathologie affectant la reproduction, l’hyperprolactinémie. En termes de bénéfices, le présent projet permettrait ainsi d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de notre molécule dans le traitement d’une pathologie humaine (mimé par un modèle murin), qui pourrait, in fine, être appliqué à d’autres pathologies associées à un dysfonctionnement de la reproduction chez l’Homme.

Procédures

Les 168 animaux inclus dans cette procédure seront soumis à des injections répétées, de façon biquotidienne tous les jours ou tous les 2 jours. Au 20ème jour après le début du protocole, des prélèvements de sang sériés seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection du traitement puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements afin de doser la concentration plasmatique d'une hormone cible. Au 21ème jour les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.

Impact sur les animaux

En termes de manipulation des animaux, les injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets tels que des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent être observés mais sont anticipées par l'injection d'analgésiques au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence.

Devenir

Afin de pouvoir réaliser des études immunohistochimiques sur tissus fixés, tout les animaux seront perfusés par la voie intracardiaque.

Remplacement

Il nous est impossible d'utiliser des modèles in vitro pour des études mécanistiques de ce type. L'étude de l'effet de l'analogue de la kisspeptine sur la fonction de reproduction en cas d’hyperprolactinémie nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu (effet de la molécule sur la sécrétion des hormones liées à la reproduction, effet sur l’expression de gènes cibles dans des tissus périphériques, …). Aussi, ce genre d’étude n’à, à ce jour, aucun équivalent qui n’emploi pas de modèle animal.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, nous aurons besoin de 7 animaux par groupes afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Avec la formation de 24 groupes nous aurons donc besoin de 168 animaux au total.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi, une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les chirurgies, injections ou prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements sanguins. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de nourriture appétente sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin.

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction et les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront, in fine, de poursuivre avec des expérimentations sur l'espèce humaine et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse L'approche expérimentale nécessite un système reproducteur complètement développé et mature, les animaux employés devront donc avoir atteint la maturité sexuelle, avec un âge minimal de 9 semaines

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 mâles tués à l'issue et 60 femelles réutilisées dans d'autres projets de l'équipe. Les souris subissent une gonadectomie sous anesthésie avec pose d'implants hormonaux, puis des tests de comportement de reproduction, les femelles utilisées pour déclencher le comportement des mâles, ceux-ci étant ensuite tués pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des atteintes possibles allant du dos courbé et de la perte de poids rapide à l'état de choc et à la détresse respiratoire, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les bénéfices se limitent à mieux comprendre l'action des hormones sexuelles sur le comportement, et le porteur affirme que l'étude ne peut se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Pour une reproduction réussie, il faut non seulement une production de gamète (oocytes et spermatozoides) mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle optimisant ainsi la rencontre des partenaires sexuels et la fécondation. Chez le mâle, le comportement de reproduction est contrôlé par le cerveau sous l’action des hormones sexuelles : androgènes (testostérone) et des oestrogènes (oestradiol). Différentes études sur des modèles de souris ne possédant pas les récépteurs de ces hormones sexuelles dans le cerveau ont permis de montrer le rôle de la testostérone et de l’oestradiol dans la régulation du comportement sexuel mâle. Néanmoins, la manière dont les hormones agissent spécifiquement sur le cerveau restent encore à identifier. Dans cette étude, nous souhaitons donc identifier les modes d’actions et les cibles cellulaires dans le cerveau des androgènes et des oestrogènes Plus particulièrement, nous étudirons les effets de la délétion génétique des récepteurs des hormones sexuelles au sein du cerveau sur les structures cérébrales régulant le comportement sexuel mâle.

Bénéfices attendus

Au cours de la vie, notre corps et nos fonctions biologiques sont soumis à des variations hormonales pouvant avoir un impact sur notre système reproducteur et sur notre cerveau. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des effets des variations des hormones sexuelles testosterone et oestradiol sur la fonction de reproduction mâle spécifiquement. Les modèles animaux transgéniques utilisés nous permettront de comparer les effets d'une absence de signalisation des hormones sexuelles, oetsradiol et testosterone, sur le comportement de reproduction chez le mâle.

Procédures

Les souris utilisées au sein de ce projet subiront une chirurgie gonadectomie et pose d’implants sous-cutanée (180 animaux) sous anesthésie générale avec réveil et analgésique d’une durée maximale de 30 minutes. Ensuite, l’ensemble des souris de cette demande d’autorisation de projet entreront dans un protocole de tests de comportement de reproduction. Pour les femelles stimuli (60 animaux), des injections sous-cutanées seront pratiquées quelques heures avant les tests de comportement de reproduction.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isoflurane pendant lesquelles les gonades seront retirés et un implant contenant des hormones sexuelles estradiol/testostérone sera posé en sous-cutané. Les éventuels symptômes à court et à long terme liés à cette procédure chirurgicale sont : Apparence et position anormale (poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie); Comportements anormaux (aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation)); Une perte de poids rapide; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité; Difficulté respiratoire. Certains animaux subiront également des injections sous-cutanées pouvant entrainer un stress lié à la contention et aux injections.

Devenir

L’ensemble des mâles adultes (120 animaux) de cette demande d’autorisation de projet seront euthanasié à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des cibles moléculaires des signalisations androgénique et oestrogénique impliquées dans la plasticité cérébrale controlant l’expression du comportement de reproduction chez le mâle adulte. L’ensemble des femelles adultes (60 animaux) utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe.

Remplacement

L’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite donc l’utilisation de modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau. Des animaux vivants sont donc nécessaires pour ce projet afin de réaliser des analyses comportementales et neuroendocrines sur des souris transgéniques dont les récepteurs aux différentes hormones stéroidiennes sont délétés dans le système nerveux. Ainsi des méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 180 animaux sur 2 procédures qui nous permettrons d’étudier les cibles moléculaires des récepteurs aux hormones sexuelles, androgènes et oestrogènes, impliquées dans le contrôle central du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Nous péléverons également d’autres organes et les garderont pour de futures études ou afin de les proposer aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie sous anesthésie avec réveil, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie ; Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) ; Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcent du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine ; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcent du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la littérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (à partir de 8 semaines). En effet, le but de ce projet est d’étudier les effets de l’invalidation des différents récepteurs des hormones stéroidiennes sur la neuroplasticité des structures cérébrales associés à la régulation des comportements de reproduction chez la souris mâle adulte.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections provoquant une blessure des cellules filtrantes du rein, une partie étant gardée jusqu'à 32 jours au risque de développer une insuffisance rénale, pour étudier l'influence du rythme circadien sur la réparation rénale. Le porteur annonce une hématurie et une perte de poids possibles, les souris étant tuées par perfusion intracardiaque ou asphyxie pour analyser leurs reins. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier le fonctionnement d'un organe entier, les pistes thérapeutiques restant à ouvrir.

Objectifs

Le rein assure des fonctions cruciales qui permettent de filtrer le sang afin d'éliminer les déchets de l'organisme dans les urines. La filtration rénale dépend de cellules spécialisées nommées podocytes. Ces cellules sont blessées chez 90% des patients souffrant de maladies chroniques rénales. Des résultats récents suggèrent que le rythme circadien joue un rôle important pour permettre aux podocytes de se réparer suite à une blessure. Dans ce projet, nous allons déterminer comment le rythme circadien influence la capacité des podocytes à répondre à une blessure. Les résultats obtenus grâce à ce projet fourniront des connaissances cruciales pour le développement de stratégies thérapeutiques permettant de traiter les patients atteints de maladies rénales.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet permettront d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour favoriser la protection et la réparation des podocytes face aux blessures accumulées au cours de la vie adulte. Ce travail permettra à terme de tester des approches thérapeutiques innovantes visant à stimuler la capacité des podocytes à répondre à une blessure.

Procédures

Pour les analyses moléculaires (séquençage), les animaux recevront 3 injection intrapéritonéales (1 injection par jour pendant 3 jours consécutifs). Ils vont ensuite recevoir une injection intraveineuse. Ils seront euthanasiés 5 jours après l'injection intraveineuse par perfusion intra-cardiaque après avoir reçu 2 injections intrapéritonéales (analgésie et anesthésie). Pour les analyses histologiques, les animaux vont recevoir une injection intraveineuse. Ils seront euthanasiés 18 ou 32 jours après cette injection un automate par asphyxie au CO2. Durée des injections intrapéritonéales: environ 3 secondes. Durée des injections intraveineuses: environ 5 secondes. Durée des perfusions intracardiaques: environ 5 minutes. Les collectes d’urines se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris. Si les souris n’urinent pas lors de la préhension, elles seront placées individuellement, pendant 2 à 3h, dans des boîtes en plastique dans lesquels nous avons percé de petits trous pour permettre une bonne respiration. Ces boîtes sont dépourvues de litière, boisson et aliment, et le fond a été recouvert avec des plaques en plastiques type « 96 puits ». A l’issue de cette période, les animaux seront replacés dans leurs cages d’origine avec leurs congénères et l’urine excrétée par miction spontanée de l’animal sera alors collectée dans les puits.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. L'injection intraveineuse va entrainer une blessure des podocytes. Cette blessure peut avoir des conséquences sur l'état de santé général des souris.Toutefois, les animaux seront euthanasiés 5 jours après l’injection pour les analyses moléculaires, un temps beaucoup trop court pour développer des symptômes suite à une insuffisance rénale. Pour les analyses histologiques, les animaux seront maintenus vivant jusqu’à 32 jours suite à la blessure, et seront donc susceptibles de développer une insuffisance rénale caractérisée par une hématurie. Une perte de poids transitoire est fréquemment observée dans les 10 jours qui suivent l'injection intraveineuse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre d'analyser par séquençage et histologiquement les résultats obtenus.

Remplacement

Bien que les techniques de culture cellulaire aient fortement évoluées, les études in vitro ne permettent pas d’étudier des processus biologiques complexes. Seuls les modèles animaux permettent d’aborder des questions relatives au fonctionnement d’un organe dans son ensemble et à l’influence de l’environnement. Aussi, par définition, notre objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Aussi, pour les analyses moléculaires, les animaux seront soumis à l'expérimentation de manière séquentielle, ce qui nous permettra de stopper cette expérimentation dès que nous aurons collecté des échantillons de qualité́ suffisante pour réaliser un séquençage et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un maximum de 104 animaux.

Raffinement

Pour les analyses moléculaires (séquençage), les animaux sont euthanasiés par exsanguination. Ces animaux sont tout d’abord anesthésiés profondément par administration d’un mélange d’anesthésique et de sédatif. Avant toute intervention, la profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de réflexe de retrait suite au mincement des orteils. Cette approche garantit que l’animal ne souffrira pas pendant la perfusion. De plus, les animaux seront analgésiés afin de réduire au maximum la douleur potentiellement subie par les animaux. Pour les analyses histologiques, l’évolution de la dysfonction de la filtration rénale sera surveillée étroitement dès le début de l'expérimentation. Aussi, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par l'expérimentation grâce à l’utilisation d’une grille de score. Si un problème est détecté́ sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

La réalisation de ce projet permettra de comprendre comment le rythme circadien influence la réponse des podocytes au stress. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’Homme. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.

24 moutons et cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée et six tués à l'issue. Ils subissent des prélèvements sanguins très fréquents, jusqu'à dix-neuf par jour, et la pose de cathéters veineux et de sondes urinaires, pour étudier le devenir de molécules pharmacologiques chez ces espèces. Le porteur indique que les moutons privés d'accès veineux sont réformés puis, selon leur état, euthanasiés pour des travaux pratiques d'autopsie ou réutilisés pour des exercices de contention, tandis que les cochons sont tués mais réutilisés autant que possible pour l'entraînement chirurgical. Il conclut que la complexité des organismes impose une étude in vivo.

Objectifs

Que ce soit pour le développement de nouvelles méthodes d’investigation clinique pour l’homme ou l’animal en médecine vétérinaire ou que ce soit pour l’évaluation de molécules pharmacologiques, il est nécessaire de procéder en deux phases : - le développement préclinique, - puis le développement clinique. Ici, nous nous intéressons uniquement à la phase préclinique. Le développement préclinique a, entre autres, pour objectif de définir l’activité pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique des molécules étudiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de développer de nouvelles méthodes d’investigation cliniques utiles à la fois en médecine vétérinaire (notament sur les espèces de rentes qui sont souvent négligées) et en recherche préclinique. Ce projet permettra également d’identifier les effets pharmacologiques des molécules étudiées ou leur devenir chez le mouton ou le porc, ainsi que d’évaluer leur toxicité éventuelle. Ce projet devrait donc permettre à long terme d’améliorer les soins cliniques apportés aux animaux d’élevage et fournir des informations précliniques (grace aux données pharmacocinétiques ou pharmacodynamiques) qui peuvent être utilisées par la suite par l’ensemble de la communauté scientifique.

Procédures

Des prélèvements sanguins fréquents sont prévus. Notre protocole prévoit de réaliser au maximum 19 prélèvements de 3 ml par jour. Ceci représente 57 ml de sang prélevés par animal par jour ce qui correspond à moins de 2% du volume sanguin du mouton. Des prélèvements d'urine peuvent être nécessaires et se feront à l'aide d'une sonde urinaire préalablement mise en place. Les prélèvements sanguins ou urinaires ne durent pas plus de 30 secondes chacun y compris le temps de rinçage du cathéter pour les prélèvements sanguins.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont classés selon leur fréquence d’apparition. Les mesures correctives mises en place sont précisées. Catheter veineux : - Rare (moins de 10 cas/an dans notre structure): Risque de thrombose du catheter. En l'absence d'arguments bibliographiques, il n’est pas possible de proposer une recommandation concernant l’utilisation d’un verrou héparine, ou d’un verrou au sérum physiologique seul le rinçage régulier et biquotidien avec du serum physiologique hépariné semble efficace à titre préventif. Si cet événement survient, le cathéter est retiré. Soit un nouveau cathéter est mis en place sur un autre site sous anesthésie/tranquilisation, soit l’animal est exclu de l’étude. Dans tous les cas l’animal reste sous surveillance pendant plusieurs jours. - Assez Rare (Moins 1 cas/an dans notre structure): Inflammation locale ou infection. Afin d’éviter cela, toutes les précautions d’aseptie et d’antisepsie lors de manipulation du cathéter sont mises en place. Avant la manipulation du cathéter, un traitement hygiénique (gants et bouchon du catheter) par friction désinfectante à l'aide d'un gel ou d’une solution hydro-alcoolique est réalisé. Le site d’insertion du cathéter est examiné au moins une fois par jour à la recherche de signes locaux. La réfection du pansement est réalisée uniquement s’il est décollé ou souillé. Le cathéter est retiré en cas de complication locale ou de suspicion d’infection systémique. Effet sur l’animal : gène et douleur au niveau du site de l’affection et signes généraux possibles. Lors de la survenue de cette affection, l’animal est exclu de l’étude, traité et placé sous surveillance. - Très Rare : phlébite suite à la pose du cathéter veineux. Effet sur l’animal : gène et douleur au niveau du site de l’affection et signes généraux possibles. Dans ce cas l’animal est exclu de l’étude, traité et placé sous surveillance. Dans les cas les plus graves l’animal est euthanasié. Sonde urinaire : - Risque d’infection urinaire : La sonde est retirée, l’animal est traité et placé sous surveillance. - Risque d’arrachement de la sonde : rare. L’animal est traité et placé sous surveillance. Afin de limiter les risques d’arrachement les sondes urinaires sont suturées lors de la pose. Les moutons peuvent rester en groupe mais les porcs sont placés en cage individuelles tout en leur permettant de conserver des interractions sociales avec leurs congénères placés dans les cages adjacentes.

Devenir

Pour les moutons : Les animaux n’ayant plus d’accès vasculaires jugulaires ne peuvent être réutilisés et sont donc réformés. Parmi ces animaux réformés, certains (en accord avec le vétérinaire responsable) sont euthanasiés puis utilisés à des fins pédagogiques (TP d’autopsie). Les animaux n’ayant plus d’accès vasculaires jugulaires ne peuvent être réutilisés et sont donc réformés. Parmi ces animaux réformés, ceux présentant un bon état de santé peuvent être ré-utilisés à des fins pédagogiques (TP contention, TP tonte). Les animaux non réformés peuvent être ré-utilisés en expérimentation après une période de repos d’au moins trois semaines avec un suivi médical. L’avis d’un vétérnaire sera requis avant toute réutilisation. Pour les porcs : Les animaux sont tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Toutefois, nous ferons en sorte qu'un maximum d'animaux soient réutilisés, notamment à des fins pédagogique (TP autopsie, entrainement à des gestes chirurgicaux spécifiques, …).

Remplacement

La finalisation de méthodes d’investigation cliniques ou l’application de méthodes d’investigation clinique d’une espèce à une autre ne peuvent être réalisées par définition qu’in vivo. Les effets des molécules pharmacologiques étudiées peuvent être évaluées au préalable par l’obtention de données in vivo ou ex vivo. Cependant, du fait de la complexité des organismes, les effets multiples sur plusieurs organes ne peuvent être étudiés qu’in vivo. Les études in vivo permettent ainsi une analyse et une prédiction plus fiable de la pharmacocinétique animale et également humaine d'après des données d'études scientifiques. Néanmoins, avant nos études, les caractéristiques physico-chimiques des produits sont évaluées in vitro et une recherche bibliographique approfondie est menée.

Réduction

Nous utilisons le nombre le plus réduit possible d’animaux notamment en réalisant lorsque cela est possible des essais croisés avec des périodes de washout. Les études de pharmacocinétique sur animaux s’effectuent habituellement (selon la littérature) avec des groupes de 6 à 8 animaux par test. Une approche statistique permet de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire pour l'étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés et maintenus en groupe tant que c'est possible. Ils ne sont isolés que lorsqu'ils sont équipés de cathéters qu'un congénère pourrait détériorer. Auquel cas on maintient entre eux un contact visuel et olfactif et notre équipe continue à entretenir un contact social. Les catheters sont entretenus régulièrement pour éviter qu'ils ne se bouchent. Toutes les phases douloureuses sont anticipées par des traitements analgésiques. Au terme des protocoles, un examen clinique permet de déterminer si les animaux sont réutilisables pour un autre protocole. Nous veillons à limiter le nombre d'utilisations, pour éviter de trop solliciter les animaux qui sont soit placés, soit inclus dans un protocole qui termine par l'euthanasie. Par ailleurs, le plan de prélèvements sanguins est conçu de sorte à ne jamais prélever un volume de sang supérieur à 7,5% du volume circulant de l'animal. De même, les volumes administrés ne dépasseront pas les recommandations communément admises dans "A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes". Les points limites spécifiques sont repris dans une grille de scoring de la douleur. Cette grille est élaborée à partir de critères d'observation des animaux d'une part (porcs : posture, activité et interraction avec congénères / ovins: idem +rumination) et de critères de mesures objectives comme la prise de boisson, de nouriture, la température corporelle, la prise de poids, les paramètres physiologiques (fréquence respiratoire, fécès). Au niveau des sites d'implantation des cathéters les signes de chaleur ou de douleur et l'évaluation de son intensité est réalisée par du personnel formé. En cas de doute le vétérnaire est imédiatement informé et passe dans l'heure qui suit. En cas d'hyperthermie les animaux sont immédiatement traités par des anti-pyrétiques ou des anti-inflammatoires. Les points limites conduisant à l'éviction de l'animal sont : complications liées à la mises en place des cathéters et de la sonde urinaire comme de la fièvre ne retrocédant pas aux anti-pyrétiques dans les 48h (ou moins si très élevée ou si d'autres signes de douleur), abcès ne régressant pas suite au traitement, déshydratation, léthargie ou prostration persistante associée aux autres signes. Ces situations ne sont que très rarement rencontrées dans ce type d'étude.

Choix des espèces

Les études de pharmocinétique ou de pharmacodynamie réalisées in vivo et ex vivo permettent d’orienter les conclusions et de mieux cibler des molécules intéressantes en santé humaine et animale. Cependant, du fait de la complexité des organismes, l’obtention de résultats précis et fiables nécessite obligatoirement de mettre en place un modèle animal. Par ailleurs, le choix d’animaux de grande taille (tels que le porc et le mouton) permet d’évaluer les effets de molécules d’intérets dans ces espèces qui peuvent constituer les espèces cibles. Ce choix permet également de faciliter les corrélations entre l’animal et l’humain du fait d’un poids similaire (mouton de 60 kg avec un volume sanguin proche de celui de l’homme) ainsi que parfois d’une physiologie plus proche en particulier chez le porc. Par exemple pour l’étude de molécules ayant une distribution hépatique, il est important de vérifier la physiologie de la libération de la bile dans le modèle animal. Or, la composition de la bile chez le porc est très similaire à celle de l’Homme. De même, la physiologie rénale du porc ressemble fortement à celle de l’Homme.