Système urogénital

420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie pour maintenir la lignée ou dirigés vers d'autres projets. Il s'agit d'élever une souche de rats spontanément diabétiques, la lignée GK, dont les individus développent hyperglycémie, polyurie et complications tardives comme des neuropathies ou des néphropathies. Le titre du projet qualifie lui-même ce phénotype de "dommageable". Le porteur destine la descendance à des recherches sur le diabète, la dysfonction érectile ou le syndrome des ovaires polykystiques, et décrit la souche comme "non remplaçable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de maintenir et faire prospérer une lignée de rat spontanément diabétique afin de pouvoir réaliser les expérimentations indispensables à l’activité du laboratoire en matière d’exploration préclinique dans les domaines de la dysfonction sexuelle mâle et femelle et des pathologies aux troubles métaboliques.

Bénéfices attendus

L’élevage de rats GK au phénotype particulier permettra l’exploration pré-clinique dans plusieurs domaines (métabolique, santé féminine, dysfonctionnement érectile) afin de sélectionner et tester l’efficacité de candidats médicaments afin de traiter ces troubles.

Procédures

La mesure de la glycémie nécessite une goutte de sang, prélevée à la queue du rat ou bien au niveau de la joue, sur une bandelette afin d’être lue dans un appareil de lecture adéquate. Ce prélèvement sera effectué au maximum une fois par mois, pendant une durée de 30 secondes à 1 minute maximum, chez les rats mâles de 9 semaines afin de choisir les reproducteurs.

Impact sur les animaux

Ces rats sont des rats diabétiques non obèses avec une hyperglycémie, une hypoinsulinémie et une polyurie. Ils peuvent aussi développer des complications tardives comme une rétinopathie, une microangiopathie, neuropathie ou une nephropathie, ou encore une inflammation des intestins qui peut mener à des diarrhées.

Devenir

À l’issue de cette procédure d’élevage, les animaux ont la possibilité d’être maintenu en élevage pour continuer de maintenir la lignée ou pourront être réutilisé le cas échéant sur d’autres des projets portant sur des études sur le diabète, mais aussi la dysfonction uro-génito-sexuelles ou le syndrome des ovaires polykystiques.

Remplacement

Le rat GK (Goto-Kakizaki) est une souche de rat présentant un diabète de type 2 sans obésité. Il s’agit d’un modèle précieux pour les études sur le diabète, mais aussi la dysfonction érectile, l’hyperactivité vésicale ou le syndrome des ovaires polykystiques. Dans ce contexte, l’élevage de rats GK permet une recherche préclinique pour pouvoir évaluer l’efficacité et sélectionner des candidats médicaments innovants pouvant présenter un intérêt dans le traitement de ces pathologies liées à l’expression naturelle du diabète de type II chez cette souche de rat. L’érection ou la miction sont des processus physiologiques nécessitant la coordination de plusieurs mécanismes physiologiques, ainsi, un modèle animal est requis pour pouvoir les étudier et évaluer l’érection et l’effet potentiellement bénéfique d’un nouveau médicament. De plus la souche de rat GK a été démontrée comme un modèle reproduisant les caractéristiques du diabète chez l’homme, incluant notamment une dysfonction érectile et une hyperactivité vésicale ayant fait l’objet d’un publication scientifique. De plus, il a été montré récemment que les rates GK développent spontanément un syndrome des ovaires polykystiques. L’éthiologie de cette pathologie est encore inconnue, et un modèle animal spontané est le meilleur outil pour les recherches scientifiques sur cette maladie. Ainsi le rat GK n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe qui ne peut pas être reproduit à l’aide d’une lignée cellulaire ou de modélisation informatique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera maintenu au minimum et ajusté en fonction des demandes des équipes utilisatrices et du bon maintien de la lignée de manière à pouvoir renouveler les reproducteurs sans consanguinité.. De plus, le rat GK étant un modèle de plusieurs pathologies (syndrome des ovaires polykistiques, dysfonction érectile, urologie, diabète), la descendance mâle et femelle pourra être utilisée dans des projets incluants les procédures expérimentales correspondantes.

Raffinement

Une semaine d’habituation minimum est laissée aux animaux avant de pouvoir les regrouper en cages d’accouplement. Ils sont hébergés en groupe sociaux de 2 ou 3 (en fonction de leur poids/croissance,

Choix des espèces

Afin de limiter l’utilisation de gros animaux tels que le chien, les rongeurs et plus particulièrement le rat est l’espèce animale la plus largement utilisée dans le domaine de la médecine uro-génito-sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité uro-génito-sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et chez l’homme. De plus le rat GK est un modèle spontané de diabète de type 2 et des pathologies uro-génito-sexuelles associées, ainsi que du syndrome des ovaires polykistiques. Les animaux mis en reproduction sont agés au minimum de 9 semaines afin d’avoir atteint leur maturité sexuelle. Le sevrage est effectué entre 4 et 5 semaines, selon le nombre et la taille des petits.

40 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacées à l'issue. Chacune reçoit une éponge vaginale posée douze jours, une injection intramusculaire d'hormone puis une prise de sang à la jugulaire, le porteur signalant un stress de contention et un possible hématome. Leur sang sert à préparer du sérum de brebis en œstrus, un composant du milieu de fécondation in vitro d'ovocytes de brebis. Le porteur affirme qu'aucun protocole sans sérum n'est efficace et rattache l'ensemble à des perspectives lointaines de restauration de la fertilité chez la femme.

Objectifs

L’objectif est de préparer du sérum de brebis en œstrus, qui est un composant du milieu de fécondation in vitro (FIV) des ovocytes ovins. Cette technologie sera mise en œuvre au laboratoire dans le cadre d’un programme de recherche ne faisant pas appel à d’autres animaux expérimentaux (ovocytes obtenus à partir d’ovaires collectés post-mortem sur des animaux abattus dans des abattoirs commerciaux). Le programme de recherche vise à optimiser la qualité des ovocytes cultivés in vitro par l’addition de facteurs biologiques (notamment des facteurs de croissance ou des hormones) dans le milieu de culture des ovocytes. Après cette étape, la FIV permet de vérifier l’aptitude des ovocytes à être fécondés et à évoluer en embryons, deux indicateurs de leur qualité.

Bénéfices attendus

Le projet scientifique global contribuera à la mise au point de la culture in vitro des ovocytes de brebis, une espèce qui présente des similarités avec l’espèce humaine (en termes de taille des ovocytes, nombre d’ovulations, chronologie de la croissance des ovocytes dans l’ovaire et du développement des embryons). A court terme, il s’agit d’obtenir, à partir d’ovocytes présents dans l’ovaire mais bien en amont de l’ovulation, des ovocytes fécondables et capables d’évoluer en embryons. Le projet s’insère dans le développement à moyen terme de stratégies de restauration de la fertilité chez la femme : soit en produisant des embryons à partir des ovocytes contenus dans des biopsies ovariennes cryoconservées (conservation qui est proposée aux patientes avant un traitement potentiellement toxique pour les ovocytes), soit en stimulant in vitro la maturation d’ovocytes qui n’ont pas atteint in vivo le stade désiré en dépit d’un traitement de stimulation ovarienne (pour des patientes présentant des troubles de l’ovulation par exemple).

Procédures

Après une pose d’éponge vaginale pendant 12 jours suivie d’une injection intramusculaire de PMSG, chaque animal sera soumis à une prise de sang. Chaque opération a une durée inférieure à une minute.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lié à une contention brève (de l’ordre de la minute) et ressentiront la piqûre de l’aiguille lors de la prise de sang ou de l'injection intramusculaire. La prise de sang peut entraîner un hématome.

Devenir

Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.

Remplacement

La très grande majorité des protocoles rapportés dans la littérature mentionne l’addition de serum de brebis au moment de la fécondation in vitro ou lors d’une étape précédente dans l’espèce ovine (24/25 références). Une équipe espagnole a publié un protocole sans sérum, mais rapporte un taux de développement embryonnaire le plus faible de l’ensemble des 25 études (12% seulement des ovocytes génèrent des embryons atteignant le stade de blastocystes). A ce jour, il n’y a donc pas d’alternative efficace à l’utilisation de serum pour la production in vitro d’embryons ovins.

Réduction

Un prélèvement de de 4 à 5 mL de sang sera réalisée sur deux lots de 20 brebis, pour constituer deux pools de 40 mL de sérum. Il est prévu de pratiquer environ 80 fécondations in vitro sur quatre ans (soit une toutes les deux à trois semaines). Ceci requiert 80 mL de sérum, soit 160 mL de sang. Pour la reproductibilité expérimentale, il faut utiliser le même serum pour chaque série d’expériences, donc limiter le nombre de serums différents sur l’ensemble du projet. Nous prévoyons donc de préparer 2 fois 40 mL de serum, qui sera ensuite aliquoté et congelé. Une variabilité entre individus est observée dans l’efficacité du serum sur la production d’embryons par fécondation in vitro. Pour éviter le risque que le sérum constitué s’avère peu efficace et de ce fait inutilisable, nous faisons le choix - de réaliser les prélèvements sur des animaux du troupeau de l’établissement utilisateur au moment où ils vont être mis à la reproduction. Ils ont en effet reçu dans cette optique un traitement hormonal de synchronisation des chaleurs qui va réduire le nombre d’individus présentant un sérum pauvre en hormones sexuelles et potentiellement peu efficace en fécondation in vitro. - de constituer des pools de sérum à partir de 20 animaux chacun. Ce nombre d’individus représentés dans le pool va limiter la variabilité de la composition du sérum. Remarque 1 : Le prélèvement de 10 mL de sang sur 20 animaux pour constituer un pool unique a été envisagé, mais nécéssiterait une contention plus longue de chaque animal et le prélèvement risquerait d’être plus difficile. Remarque 2 : Le serum collecté peut se conserver plusieurs années au congélateur ; il pourra donc être utilisé même en cas de retard dans l’avancée du programme de recherche.

Raffinement

Les brebis seront dans leurs conditions d’élevage habituelles dans un bâtiment d’élevage conventionnel, en case collective à clairvoies sur litière paillée. La pose d’éponge, l’injection intramusculaire et le prélèvement de sang se feront en présence de congénères pour éviter le stress dû à l’isolement. La contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Les opérations, et particulièrement le prélèvement de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. L'animal sera récompensé par des granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Un baume végétal aux propriétés décongestionnantes, antiseptiques et cicatrisantes sera appliqué en massage sur la veine pour prévenir la douleur post-procédure et une infection éventuelle. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale.

Choix des espèces

Le sang est collecté sur des brebis en vue de préparer du sérum pour la mise en œuvre de la fécondation in vitro d’ovocytes dans cette espèce. Afin de collecter le sang de brebis en oestrus, le prélèvement sanguin sera réalisée sur des brebis adultes de l’élevage de l’établissement au moment de leur mise à la reproduction.

Gardées en vie puis réutilisées pour d'autres protocoles après examen vétérinaire, 46 ponettes vont être inséminées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour vérifier qu'une semence dont la charge bactérienne est réduite par centrifugation, sans antibiotiques, reste aussi fertile. Chacune reçoit une injection pour déclencher l'ovulation, une insémination par le col de l'utérus et six échographies par voie rectale. Après le diagnostic de gestation à 14 jours, 13 juments du groupe sans antibiotique reçoivent une injection de prostaglandines F2 alpha avant de rejoindre le lot témoin, sans que le porteur précise ce que devient leur gestation. Il écrit que la manipulation "peut engendrer du stress", puis que les ponettes, habituées, vivent les procédures "sans stress".

Objectifs

L’antibiorésistance, en partie due à l’usage intensif des antibiotiques tant en médecine vétérinaire qu’en médecine humaine est devenue un véritable challenge de santé publique et une utilisation raisonnée des antibiotiques après identification de l’agent et de sa sensibilité aux substances envisagées est désormais recommandée. L’insémination artificielle, qui est largement répandue chez le cheval est un domaine où les antibiotiques sont largement utilisés en dehors de ces recommandations avec l’adjonction (quasi) systématique d’antibiotiques dans les dilueurs de semence. Après l’insémination, la plus grande partie du volume de semence déposé dans la lumière de l’utérus reflue vers l’extérieur. En conséquence, non seulement le tractus génital de la jument mais également l’environnement extérieur sont exposés aux antibiotiques à des doses sub-thérapeutiques favorables au développement d’antibiorésistances. La centrifugation du sperme dans une substance colloïde en simple couche permet de sélectionner les spermatozoïdes de qualité supérieure mais s’est également montrée efficace en laboratoire pour diminuer fortement la charge bactérienne dans les doses d’insémination. L'objectif du projet est de réaliser l’étape finale de validation de la technique qui passe par un test de fertilité des juments après insémination par de la semence équine traitée et qui permettra de démontrer l’absence d’impact négatif in vivo et donc de promouvoir cette technique comme alternative aux antibiotiques dans les milieux de dilution du sperme équin.

Bénéfices attendus

Les résultats de l’étude pilote menée sur des porcs montrent qu’il n’y avait pas de différence dans les taux de mise-bas entre le groupe controle et le groupe dont la semence a été centrifugée, ce qui indique l’absence d’effet délétère du traitement sur la semence porcine . En conséquence, les résultats attendus de notre test de fertilité sont les suivants : • Pas de différence de taux de gestation entre le groupe controle et le groupe dont la semence a été centrifugée • Pas de différence du nombre d’infections utérines post-insémination • Pas d’impact sur le taux de gestation lors du cycle suivant Ils devraient permettre de démontrer in vivo que la centrifugation peut être recommandée comme alternative à l’addition d’antibiotiques dans les dileurs de sperme équin. Alors que l’utilisation des antibiotiques dans les dilueurs est exigée dans certains pays, les résultats de cette étude fourniront les arguments scientifiques qui pourront servir de base aux actions visant à faire changer ces réglementations.

Procédures

Chaque ponette aura une injection (10 secondes) pour induire l'ovulation. Puis une insemination artificelle (30 secondes). L'echographie est un acte qui ce deroule en 2 à 3mn. Ce geste d'imagerie sera repeté 6 fois par animal.

Impact sur les animaux

La manipulation peut engendrer du stress. Les échographies sont réalisées par introduction de la sonde dans le rectum : une gêne temporaire est donc occasionnée. L’injection pour induire l’ovulation génère une douleur transitoire au site d’injection. Lors du cathétérisme du col, l’introduction du catheter d’insémination au niveau du col peut induire une gêne temporaire..

Devenir

Tout les animaux sont gardés en vie et réutilisé pour d'autres protocoles après examens vétérinaires.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant d’évaluer la fertilité des femelles après insémination, nous ne pouvons pas REMPLACER l’utilisation des ponettes par un autre modèle.

Réduction

L’étude sera réalisée en 2023 sur 46 ponettes réparties de la manière suivante: 23 ponettes avec milieu sans antibiotique et 23 avec milieu contenant des antibiotiques. Puis 13 du lots avec milieu sans antibiotique, qui, après le diagnostic de gestation à 14 jours, rentreront dans le lot témoin après injection de prostaglandines F2 alpha, cloprostenol. Un test de puissance a permis de déterminer que 23 juments par groupe permettraient de comparer les fertilités des jument.

Raffinement

Les étalons et les juments sont logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec accès au pâturage, en visibilité et contact des congénères pour rendre le plus agréable possible leur séjour durant les expérimentations. Les ponettes voient plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent de près leur comportement et en particulier les signes de stress ou d’inconfort (oreilles en arrière, naseaux dilatés, etc). L’enrichissement du milieu est assuré par des brosses, des jeux, des bouts de bois à ronger. Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux (méthode Pat Parelli) : les animaux sont habitués aux différentes procédures et les vivent sans stress. Une étude pilote chez le porc a démontré l’absence d’effets néfastes (colloïde) de cette méthode de préparation des doses sur la fertilité.

Choix des espèces

Le but de l’expérience est de s’affranchir de l’antibioterapie sur les inséminations artificielles réalisées chez les équins, donc impossible de choisir un autre modèle pour répondre à la question Les animaux utilisés seront tous pubères, puisqu'il faut qu'ils soient capables de se reproduire.

Immobilisés dans un couloir de contention par un licol et des sangles passées sous le ventre, les lamas subissent une prise de sang finale de 250 à 400 ml, après six injections d'antigènes et d'adjuvant en général, huit au plus, le tout sans anesthésie. 375 lamas, classés parmi les autres mammifères, vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger, puis 200 restent à l'élevage et 175, mâles et autres femelles, sont placés chez des détenteurs. Le porteur décrit une "prestation de services" : produire des anticorps "à la demande de clients", qui mènent leurs propres recherches thérapeutiques. Il indique que les injections peuvent provoquer des "douleurs aiguës transitoires", et que l'impact léger des procédures "ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal.

Bénéfices attendus

Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée.

Procédures

Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile.

Impact sur les animaux

L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.

Devenir

Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.

Remplacement

Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.

Réduction

En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces.

Raffinement

Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens.

Choix des espèces

Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.

30 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes maintenues dans l'élevage et réutilisables ensuite. Chaque chèvre reçoit deux injections dans le muscle, avec des prélèvements de lait faits à la traite, pour mettre au point un dispositif à puce RFID détectant automatiquement les chaleurs. Le porteur décrit une douleur légère de quelques secondes à l'injection et un stress léger à la contention. Il présente ce dispositif comme un moyen de faciliter l'insémination après "effet mâle" et de réduire le recours aux hormones dans l'élevage caprin.

Objectifs

Chez les ovins et caprins, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel, en général de février à juillet. Cette saisonnalité de la reproduction conduit à des variations annuelles dans la disponibilité des produits (lait/viande), la reproduction hors saison sexuelle (désaisonnement) est alors une solution pour maintenir l’offre toute l’année. Le traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations est aujourd’hui la pratique la plus efficace pour désaisonner la reproduction. Or, le contexte sociétal et réglementaire incite fortement à la recherche de méthodes alternatives réduisant voire excluant l’utilisation d’hormones, pour synchroniser les chaleurs des femelles. La pratique de « l’effet mâle » est une solution alternative permettant l’Insémination Animale (IA) hors saison sexuelle. En effet, « l’effet mâle » consiste à induire l’activité ovulatoire des femelles en anoestrus saisonnier (repos sexuel) par leur exposition à des mâles sexuellement actifs. Toutefois, son utilisation en élevage est freinée par la moindre synchronisation des chaleurs obtenue (en comparaison à celle obtenue après un traitement hormonal). C’est pourquoi la détection des chaleurs est recommandée après « effet mâle », afin d’inséminer les femelles au bon moment du cycle sexuel et obtenir une fertilité satisfaisante. Or cette détection est chronophage pour les éleveurs. L’objectif du projet est de développer un dispositif permettant d’automatiser la méthode de détection des chaleurs préconisée sur le terrain afin de pratiquer l’IA.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à faciliter la mise en oeuvre par les éleveurs caprins d’une mise à la reproduction des chèvres par insémination animale (IA) après induction et synchronisation des chaleurs par « effet mâle ». Nous développons un dispositif simple et utilisable sur le terrain, permettant de détecter la boucle d'identification réglementaire portée par les chèvres à l’oreille (boucle contenant une puce RFID = identification par radio-fréquence) afin d'automatiser la détection des chaleurs et ainsi déterminer le moment d’IA optimum pour une bonne fertilité. En effet, Les chèvres en chaleurs sont attirées par les boucs : ceux-ci sont placés derrière une barrière avec l'antenne de lecture du dispositif, ce qui permet d'enregistrer automatiquement toutes les visites (nombre et durée) des chèvres en chaleurs auprès des boucs.

Procédures

Trente chèvres recevront chacune 2 injections par voie intra-musculaire à la base de l'encolure (une injection dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Lors des injections par voie intra-musculaire (au total 2 injections/chèvre), les chèvres pourront ressentir une douleur légère de très courte durée (quelques secondes), sans altération de leur état général (parfois, un hématome peut se former, régressant spontanément). Un stress léger pourra être ressenti par les chèvres lors de la contention pour les injections.

Devenir

Tous les animaux restent dans l'élevage. Ils pourront être réutilisés dans d'autres projets sous réserve d'un avis favorable du vétérinaire sanitaire de l'établissement utilisateur.

Remplacement

Ce projet concerne la détection des chaleurs lors de la mise à la reproduction de chèvres en conditions d’élevage. Il ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le projet utilisera 30 chèvres. Dans la conduite habituelle de l’élevage caprin de l’établissement utilisateur, un lot physique est un groupe de chèvres élevées ensembles dans un même enclos et mises à la reproduction au même moment. L’effectif de 30 chèvres/lot est donc choisi en fonction du nombre de chèvres habituellement hébergées/lot physique. Nous décrirons la cinétique des venues en chaleur de ces 30 chèvres.

Raffinement

Les chèvres seront dans leurs conditions d’élevage habituelles (en groupes) dans un bâtiment d’élevage conventionnel sur litière paillée (respectant une surface minimale de 1.5 m²/chèvre) et feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée du protocole. Le milieu d’élevage est enrichi avec une brosse rotative par lot, des tapis (Grat'o gratte®) positionnés sur les claies pour se gratter les flancs et des disques suspendus à mordiller. Pour les injections par voie intra-musculaire (concernant 30 chèvres), la contention sera faite par des expérimentateurs animaliers, dont la présence journalière répétée en interaction positive (alimentation, traite, soins) est associée à une diminution du comportement de fuite des chèvres et donc de leur stress face à la contention. Les prélèvements de lait seront faits manuellement en salle de traite, ne nécessitant pas de contention supplémentaire. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera aussi réalisée. En cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé sur 48 h, anorexie, perte de poids >15%...) un traitement adapté (antidouleurs, antiinflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale ou avec son intervention si nécessaire.

Choix des espèces

Les caprins sont la cible d'application en élevage de ce dispositif de détection automatisée des chaleurs. Les animaux seront des chèvres adultes primipares et multipares en lactation.

1 204 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour inactiver le gène foxl2 et étudier son rôle dans la différenciation sexuelle. Le protocole produit des oeufs microinjectés, génotype les alevins par prélèvement d'un fragment de nageoire, puis croise les individus pour obtenir des lignées mutantes analysées après mise à mort. Le porteur indique attendre peu de souffrance, l'inactivation d'un gène gonadique provoquant surtout une inversion sexuelle, et tue tous les animaux pour prélever leurs gonades. Il présente cette recherche fondamentale comme pouvant ouvrir des applications de "contrôle sexuel" en aquaculture des salmonidés.

Objectifs

La duplication ancestrale et complète du génome des salmonidés a profondément façonné́ la structure et le contenu en gènes des génomes des salmonidés. L’évolution de la fonction des gènes issus de cette duplication est importante à la fois d’un point de vue fondamental et finalisé. Ce projet a pour but d’explorer dans quelle mesure ces gènes dupliqués peuvent être redondants au niveau de leur fonction en utilisant, comme un cas d’étude, une approche d'inactivation ciblée d’un gène dupliqué et conservé en deux copies chez la truite arc-en-ciel, le gène foxl2. Ce gène est un gène conservé qui est impliqué́ dans le développement ovarien et la différenciation du sexe chez les vertébrés. Le projet génèrera des lignées de truite arc-en-ciel chez lesquelles les deux copies du gène foxl2 seront inactivés soit individuellement, soit simultanément, et ce de façon à comprendre quels sont les rôles respectifs de chaque copie dans la différentiation et le développement de l’ovaire.

Bénéfices attendus

Les connaissances générées par ce projet nous permettront de mieux comprendre l’évolution des gènes dupliqués chez la truite arc-en-ciel. Ces résultats sont particulièrement importants d’un point de vue de la connaissance de l’évolution des gènes pour mieux comprendre le rôle des gènes en copies dupliquées chez les salmonidés. Sur le plan plus finalisé, une meilleure connaissance du devenir de ces gènes en double copie chez les salmonidés peut avoir de nombreux résultats pratiques à moyen et long terme. Par exemple, cette information peut être cruciale pour des programmes de sélection qui cibleraient une seule copie de ces gènes dupliqués. De plus, comme foxl2 est un gène clé pour la différenciation ovarienne chez les vertébrés, sa caractérisation fonctionnelle précise chez les salmonidés pourrait ouvrir de nouvelles opportunités pour un meilleur contrôle sexuel chez les salmonidés.

Procédures

Trois femelles et deux mâles seront utilisés pour la production d’œufs (3 fois 5 minutes) qui seront microinjectés pour générer 3 lignées de poissons. Ces animaux seront génotypés pour à partir d’un fragment de nageoire (une fois 1-2 minutes sur chaque individu) pour sélectioner des lots de 20 géniteurs présentant des mutations perte de fonction. Ces géniteurs seront marqués individuellement (une fois 2 minutes par individu). Différents croisements seront ensuite réalisés à partir de ces animaux pour produire des lignées non mosaiques puis homozygotes qui seront analysées aprés euthanasie sur la base de leur phenotype sexuel (macroscopique, histologique et moléculaire) et génotype (pour la mutation et pour leur sexe genotypique).

Impact sur les animaux

Le gène foxl2 est connu pour son rôle dans la différenciation et le développement ovarien. C’est un gène gonadique dont l’inactivation est peu susceptible d'induire de la souffrance, de l’angoisse ou du stress dans les lignées mutantes que nous souhaitons construire chez la truite arc-en-ciel. A notre connaissance, toutes les inactivations de foxl2 effectuées jusqu’à maintenant montrent que foxl2 est un gène clé́ pour la différenciation des cellules de la granulosa et pour le maintien des ovaires avec un phénotype d’inversion sexuelle partielle ou complète des gonades. C’est par exemple le cas chez le tilapia du Nil qui est la seule espèce de poisson où ce gène a été́ inactivé, et ou le phénotype rapporté chez les femelles mutantes homozygotes est une inversion sexuelle complète. Aucune différence dans l'histologie gonadique n'a été́ trouvée entre les animaux contrôles, les animaux mutés à l’état hétérozygote (pas d’inversion du sexe) et les mutants homozygotes (complètement inversés). Nous nous ne nous attendons donc pas sur la base des analyses de la littérature à ce que ces mutations chez la truite conduisent à une souffrance physiologique ou un stress. Nous serons néanmoins attentifs à des éventuels phénotypes dommageables par une observation régulière des poissons issus de ces lignées mutées, en recherchant notamment des critères phénotypiques comme l'apparition d'un gonflement abdominal, ou comportementaux (nage, alimentation, position dans le bac) afin de réajuster notre protocole éthique si un phénotype dommageable ou de stress était observé.

Devenir

Aprés chaque procédure tous les animaux utilisés seront euthanasiés et les animaux euthanasiés des lignées finales non mosaiques seront eux utilisées pour des prélèvements d'organes nécessaires aux analyses (gonades pour analyses histologiques et moléculaires).

Remplacement

L’objectif de ce projet est d'explorer l'effet de ces différentes mutations foxl2 sur le phénotype sexuel adulte. La gonade étant un organe complexe et aucune alternative in vitro ou in silico pour ce type de recherche n'est actuellement disponible.

Réduction

Les effectifs de poissons expérimentaux (femelles pour la production d’œufs, embryons injectés et alevins génotypés) seront réduits au maximum et nous favoriserons le génotypage précoce des individus potentiellement porteurs de mutations, à un stade embryonnaire non autonome (alevins avant la première prise alimentaire). Ce génotypage précoce permettra de ne conserver que 10 à 20 individus par lignée porteuse de mutation(s) à l'âge adulte.

Raffinement

Les procédures de raffinement seront basées sur l'utilisation appropriée des anesthésiques pendant toute la procédure d'échantillonnage (par exemple, une anesthésie non létale avec de la tricaïne avant tout échantillonnage ou manipulation des poissons). Les animaux seront enlevés dans les conditions optimales de l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Tous les prélèvements se feront selon des procédures établies et approuvées par la structure bien-être. Nous nous ne nous attendons donc pas sur la base des analyses de la littérature à ce que ces mutations chez la truite conduisent à une souffrance physiologique ou un stress. Nous serons néamoins attentifs à des éventuels phénotypes dommageables par une observation régulière des poissons issus de ces lignées mutées, en recherchant notament des critères phénotypiques comme l'apparition d'un gonflement abdominal, ou comportementaux (nage, alimentation, position dans le bac) afin de réajuster notre protocole éthique si un phénotype dommageable ou de stress était observé.

Choix des espèces

Notre étude portant sur le devenir des gènes issus de la duplication specifique du génome des Salmonidés, la truite est donc une des espèces sur laquelle nous pouvons développer ce projet. Cette espèce est une espèce robuste dont l'élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture (et dans nos installations expérimentales). L'espèce est grégaire et supporte des densités d'élevage importantes. C’est une des espèces de salmonidés les plus élevés avec le Saumon Atlantique. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). La production des oeufs se fera à partir de femelles sexuellement matures et ovulantes. Les génotypages se feront au stade oeillé ou alevin. Ils seront réalisés le plus tôt possible pour limiter le nombre de prélèvements sur des animaux au stade autonome.