Troubles nerveux
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- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de l’aftin 5 dans le traitement de la tauopathie chez la souris rTg4510
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque l'agrégation de la protéine tau et un déclin cognitif dès cinq mois, et reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 28 jours, en alternant les flancs pour limiter l'inflammation aux points de piqûre. S'y ajoutent un passage de dix minutes dans un labyrinthe en croix et jusqu'à trois passages quotidiens de dix minutes en champ ouvert pendant cinq jours consécutifs, avant le prélèvement des cerveaux. Le porteur rappelle que la plupart des composés testés jusqu'ici ont échoué en essai clinique faute d'effet sur le déclin cognitif des patients, et qualifie néanmoins sa molécule de "très prometteuse" si l'effet se confirmait chez la souris.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est la première cause mondiale de démence et est un problème de santé publique majeur. En 2019, 30 millions de personnes étaient atteinte de cette pathologie dans le monde. Elle se caractérise par un déclin cognitif progressif se traduisant par des pertes de mémoire et finalement l’installation d’une démence après plusieurs années. Au niveau cellulaire, l’un des marqueurs principaux de la maladie est l’agrégation anormale d'une protéine (la protéine tau) sur laquelle nous nous focalisons dans le cadre de ce projet. Cette agrégation, autrement appelée tauopathie se solde par la mort des neurones, cause du déclin cognitif chez les patients. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire chez la souris adulte montrent que la molécule 1) est distribuée au sein du cerveau, 2) restaure les troubles cognitifs associés au vieillissement, 3) prévient les troubles de la formation de nouveaux neurones, 4) améliore la connectivité entre les neurones. Nous avons montré que cette molécule a également un effet bénéfique au niveau de la vascularisation cérébrale. L’ensemble de ces résultats prometteurs nous a conduits à émettre l’hypothèse que cette molécule pourrait atténuer la tauopathie dans un contexte de maladie d’Alzheimer. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d'un composés dans un modèle de souris transgénique par l’étude de ces propriétés sur la tauopathie et de son effet pro-cognitif. Si nous établissions la preuve de son efficacité, cette molécule pourrait devenir un potentiel médicament dans le contexte de la maladie d’Alzheimer pour laquelle aucun traitement n’existe jusqu’alors.
Bénéfices attendus
Ce projet, qui a pour objectif d’évaluer un candidat médicament, pourrait apporter de nouvelles perspectives thérapeutiques si l’effet de la molécule testée était confirmé sur la tauopathie et se traduisait par une amélioration cognitive chez les souris transgéniques. Si la molécule testée permettait d’envisager un arrêt de l’évolution ou une amélioration du déclin cognitif, cette molécule serait très prometteuse car bon nombre de composés testés jusqu’alors ont échoués en essai clinique ces dernières années par manque d’effet significatif sur le déclin cognitif chez les patients.
Procédures
Les animaux seront injectés quotidiennement avec la molécule développée, en intra-péritonéal. Pour limiter l'apparition d'une inflammation au point d’injection, les injections se feront alternativement dans le flanc droit et dans le flanc gauche de l’animal. Enfin, les animaux participeront à des tests cognitifs pour lesquels ils seront préparés par une acclimatation préalable afin de réduire leur stress potentiel. Pour les tests comportementaux, les souris seront placées 1 fois dans un labyrinthe en forme de croix pendant 10 minutes. Pour d’autres tests comportementaux, les souris seront placées, individuellement dans une boite (openfield) pendant 10 minutes, 1 à 3 fois par jour pendant 5 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les souris seront injectées quotidiennement avec la molécule pendant 28 jours. Ces injections qui nécessitent de manipuler l'animal ce qui peut induire un stress ponctuel de quelques minutes et une douleur légère au point d'injection. Enfin, une perte de poids pourrait être associée au traitement. La répétition des injections quotidiennes pendant 28 jours pourrait également conduire à des nuisances additionnelles pour les souris (perte de poids / répétition d'un stress potentiel). C'est pourquoi le dégré de gravité de cette procédure est modérée. A l'âge de 5 mois, les signes cognitifs observés n'altèrent pas gravement l'état général des animaux.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux seront prélevés pour valider l’action de la molécule. Ainsi, à la fin de l’étude, l’effet pro-cognitif de la molécule pourra être déterminé dans le cadre de tauopathies.
Remplacement
L’étude de l’effet de la molécule sur la tauopathie pourrait être menée sur des cellules en culture mais cette alternative ne permettrait pas de mettre en evidence l’effet pro-cognitif du composé qui représente un aspect fondamental de cette étude.
Réduction
Pour ce projet, des animaux transgéniques et des animaux controles seront testés à l'aide de tests comportementaux. Pour ce type d'expérimentation, les effectifs nécessaires pour obtenir des statistiques robustes ont été déterminés par un test statistique via un logiciel spécialisé. Ainsi, grâce a ce logiciel, nous nous sommes assurés de pouvoir obtenir des résultats statistiques exploitables en employant un nombre d'animaux minimal. Au cours du projet, des analyses statistiques intermédiaires seront réalisées et si les résultats des expériences sont déjà robustes, cela nous permettrait de réduire encore le nombre de souris déterminé au départ.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement 2 à 3 minutes par les mêmes expérimentateurs pendant 7 jours avant le début des expérimentations. Ces mêmes expérimentateurs feront les injections et les tests comportementaux tout au long du projet. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettront de garantir leur bien-être. Une grille d'évaluation permettra de suivre l'état général des animaux. En cas de dégradation de cet état général, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter de prolonger une éventuelle souffrance.
Choix des espèces
Le modèle de souris transgéniques a été choisi pour ce projet du fait de sa pertinence scientifique pour l’étude de notre molécule et de l’expertise du laboratoire partenaire sur ce modèle. En effet, depuis plusieurs années, le modèle est implanté dans ce laboratoire et fait l’objet de nombreuses caractérisations de la tauopathie. Le laboratoire dispose d’une banque de réactifs qui permettent de caractériser très précisément l’évolution de la pathologie dans ce modèle. Ainsi, les partenaires sont capables grâce à leurs outils d’évaluer au mieux les effets de la molécule testée. De plus, ce modèle de souris transgéniques fait l’objet de nombreuses publications scientifiques montrant un déclin cognitif dès 5 mois chez les animaux transgéniques ce qui valide le recours à ce modèle pour étudier l’effet pro-cognitif de notre composé.
Développement de nanomédicaments vectorisés à base d’ARN comme nouvelle thérapie pour la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une hypothermie maintenue trois à cinq heures pour 84 souris, une chirurgie d'injection directe dans le cerveau pour 360 autres, des injections intraveineuses répétées pour 876 : 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort quatorze ou soixante jours après le traitement. Une partie porte des mutations modèles de la maladie d'Alzheimer, avec déficit moteur, perte de mémoire spatiale, anxiété, anomalies de posture et difficultés à s'alimenter. Le projet teste des fragments d'anticorps censés faire passer des oligonucléotides à travers la barrière qui protège le cerveau. Le porteur annonce des tests comportementaux sans dire lesquels, et se réserve "le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) reste la cause la plus fréquente de démence. La thérapie génique basée sur les oligonucléotides a montré un grand potentiel thérapeutique car elle peut réguler potentiellement n'importe quel gène spécifiquement ciblé. Cependant, plus de 98% des médicaments développés pour des applications cérébrales ne parviennent pas à traverser la barrière hématoencéphalique (la barrière qui protège le cerveau des agents toxiques véhiculés par le sang), ce qui entrave leur application en clinique. Notre équipe et son partenaire biotechnologique ont développé des "vecteurs", basés sur des fragments d’anticorps, qui facilitent le transport de produits biologiques à travers la barrière hématoencéphalique. Nous faisons l’hypothèse que notre construction fragment d'anticorps pourrait être utilisée pour transporter efficacement des oligonucléotides dans le tissus cérébral et réguler des facteurs de risque pertinents de la MA. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons conçu et testé in vitro plusieurs oligonucléotides ciblant des facteurs de risque génétiques connus, associés à la physiopathologie de la MA. Le premier objectif de notre projet est de tester l'efficacité des oligonucléotides chez la souris de type sauvage après injection directe dans le cerveau. Le second objectif du projet est de sélectionner de nouvelles constructions de fragments d'anticorps, conçues pour améliorer les caractéristiques de franchissement de la barrière hématoencéphalique des fragments d’anticorps. Ces deux premiers objectifs nous aideront à sélectionner les oligonucléotides les plus actifs en termes de régulation génique et le fragment le plus efficace en termes de franchissement de la barrière hématoencéphalique in vivo. Le conjugué fragment d’anticorps - oligonucléotide représentera notre médicament final. Par conséquent, le troisième objectif du projet sera de tester l'efficacité de nos nanomédicaments à réguler efficacement l’expression des gènes cibles, d’abord chez les souris sauvages après administration systémique (injection intraveineuse, IV). Enfin, notre quatrième objectif sera de tester nos nanomédicaments sur des souris modèle de la MA afin de vérifier i) leur efficacité dans la réduction des lésions neurodégénératives et ii) dans l'amélioration des fonctions cognitives, en comparaison avec nos placebo.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mettre au point une nouvelle famille de médicaments à base d'oligonucléotides présentant des caractéristiques de distribution efficaces dans le cerveau et destinés à la régulation de facteurs de risque génétiques impliqués dans la physiopathologie de la MA. Plus précisément, ce projet validera in vivo nos nanomédicaments dont l'efficacité et l'innocuité ont déjà été testées in vitro. Nous répondrons à trois questions scientifiques principales : 1) nos nouvelles constructions fragment d'anticorps 2.0 peuvent-elles délivrer encore plus efficacement des oligonucléotides dans le cerveau que le fragment 1.0 déjà disponible; 2) nos oligonucléotides peuvent-ils réguler l'expression des facteurs de risque génétiques liés à la MA ; 3) l'inhibition des gènes ciblés améliorera-t-elle les fonctions cognitives dans les modèles de la MA. À ce jour, il n'existe aucune alternative in vitro capable de reproduire la complexité d'un système vivant, c'est pourquoi les études sur des modèles de souris restent une étape cruciale et inévitable dans le développement de thérapies dédiées au cerveau. En outre, les études précliniques sur des modèles murins de la MA restent le principal moyen prédictif pour étudier l'efficacité d'un nouveau médicament contre la MA, avant de passer aux phases cliniques. Par conséquent, les animaux restent les seuls modèles permettant d’évaluer nos hypothèses, de réaliser nos objectifs, de répondre à nos questions et de développer de nouvelles thérapies pour la MA. Dans le cadre de ce projet, nous sélectionnerons les nanomédicaments à base d'oligonucléotides qui ont un effet thérapeutique intéressant. A plus long terme, ces nanomédicaments seront produits à plus grande échelle pour validation dans des études cliniques. Par conséquent, notre projet devrait accélérer le développement de thérapies innovantes pour la MA, sachant qu’il n’existe à ce jour aucun médicament efficace contre la MA. En outre, grâce à la modularité de notre technologie, nos études ouvriront la voie à la recherche d'un plus grand nombre de facteurs génétiques impliqués dans d'autres troubles neurologiques (par exemple, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, les encéphalopathies, etc), élargissant ainsi encore l'impact scientifique de ce projet.
Procédures
Tous les animaux ayant reçu une injection dans le cerveau, soit 360 souris vont subir : - une chirurgie en vue d'injection des oligonucléotides directement dans le cerveau d'une durée de 30 minutes- des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité de la queue, la durée d'un prélèvement n'excédera pas 5 minutes. Tous les animaux seront mis à mort 14 jours après injection dans le cerveau. Lors de l'induction de l'hypothermie, tous les animaux soit 84 souris vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injections intraveineuses et l'induction d'une hypothermie. L'état d'hypothermie peut durer de 3 à 5 heures. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort 14 jours après injection intraveineuse. Les animaux ayant reçu une injection intraveineuse, soit 876 souris, vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injection intraveineuses, des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés seront sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité caudale et des tests comportementaux, ces manipulations peuvent durer une dizaine de minutes par animal. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort à 60 jours après injection intraveineuse.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables susceptibles d'entraîner du stress et/ou de l'angoisse sont les suivants : la chirurgie pour l'injection ICV est susceptible d'entraîner de la douleur, la contention lors des multiples prises de température rectale (prise discontinue sur 5h maximum), des différents prélèvements de sang au niveau de la queue et lors des injections intraveineuses peut générer du stress et /ou de l'angoisse. L'induction de l'hypothermie peut provoquer inconfort jusqu’au retour à la température normale. Les anesthésies (par injection ou par inhalation) et les tests comportementaux sont susceptibles de générer du stress. Les souris modèle de la maladie d’Alzheimer sont censés présenter une perte neuronale et une perte des fonctions cognitives et motrices avec l’âge. Pour tous les modèles les phénotypes typiques sont un déficit moteur, un déficit de la mémoire spatiale, de l'anxiété, des anomalies posturales, des difficultés d'alimentation, et une mauvaise reconnaissance des objets nouveaux. Tous ces phénotypes sont plus graves chez les animaux homozygotes que chez les hétérozygotes, c'est pourquoi nous n'utiliserons que des souris hétérozygotes.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour procéder à l’évaluation de l’efficacité de l’inhibition génique de nos médicaments, par des tests biochimiques et de biologie moléculaire.
Remplacement
Des études in vitro ont montré que nos nanomédicaments inhibent les gènes sélectionnés et sont adsorbés par les cellules neurales grâce aux fragments d’anticorps. En outre, des études de toxicité in vitro ont prouvé que les médicaments testés sont sûrs et n'induisent pas de réactions indésirables dans les cellules. Ces études in vitro nous ont permis de réduire le nombre de médicaments sélectionnés et d’identifier les meilleurs candidats pour chaque gène ciblé, avec un potentiel d'application clinique. Cependant, les études in vitro ne prennent pas en compte les paramètres physiologiques complexes. Pour faire face à cette limite des études in vitro, nous prévoyons de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, en l'occurrence la souris, qui est le premier modèle animal disponible relativement proche de l'homme et largement utilisé pour l'étude in vivo des mécanismes physiologiques et des nouvelles thérapies développées. À l'heure actuelle, il n'existe pas de système prédictif in vitro, de modèle à base d'organoïdes ou de modèles bioinformatiques capables de fournir toutes les réponses aux enjeux pharmacocinétiques, pharmacodynamiques, toxicité et effets secondaires. En ce qui concerne le développement de nouvelles thérapies pour la maladie d'Alzheimer, les études précliniques sur des modèles de souris transgéniques dédiés restent la principale approche prédictive pour étudier leur efficacité, avant de passer à la phase clinique. Par conséquent, à notre connaissance, les animaux sont le seul modèle qui pourrait nous permettre de tester nos médicaments.
Réduction
Notre étude sera structurée et bénéficiera d’une analyse statistique appropriée pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Plus précisément, la taille de l'échantillon pour chaque objectif a été calculée sur la base d'une analyse de puissance. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=12 (6 mâles +6 femelles), à raison de maximum 15 groupes par étude. Nos données préliminaires ont montré une distribution homogène des oligonucléotides dans toutes les régions du cerveau lors de l’administration dans le cerveau. Par conséquent, pour réduire le nombre total d'animaux le cerveau sera divisé en deux hémisphères et chacun d'eux sera utilisé pour une évaluation différente. Par exemple, pour la localisation de l'ARN, la moitié du cerveau sera utilisé pour les approches de RNAscope (pour évaluer la distribution des ARNm cibles) et l'autre moitié pour les approches de siRNA scope (pour évaluer la distribution des siRNAs). De même, la moitié du cerveau pourra être utilisé pour la quantification de l'expression génique et l'autre moitié pour les analyses biochimiques. Cela nous permettra de réduire de moitié le nombre d’animaux.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont hébergés en zone d'élevage de l'animalerie entre 4 à 5 souris par cage enrichies par des dômes en carton. Les souris seront transférées dans la zone expérimentale 7 jours avant toute expérimentation. - La chirurgie se fera sous analgésie suivi d'une anesthésie. Une fois l'animal anesthésié, il est placé sur un tapis chauffant. Les yeux sont protégés par un gel protecteur oculaire. Avant incision de la peau du crâne, une infiltration d’anesthésique local est appliquée. Une analgésie post-opératoire est établie pour réduire au minimum la douleur pendant les heures et les jours qui suivent la chirurgie. Préalablement aux injections intraveineuses, les souris sont habituées au dispositif de contention et lors de l'induction de l'hypothermie, nous veillerons à ce que la température ne descende pas en deçà de 30°C. - Après chaque prélèvement sanguin, une compresse est appliquée sur le bout de la queue pour arrêter le saignement. Préalablement aux tests comportementaux, les animaux sont manipulés régulièrement pour les habituer aux environnements des différents tests et à l'expérimentateur. Tout au long des 3 procédures, les animaux sont quotidiennement surveillés et pesés 3 fois par semaine. Une grille d'évaluation est appliquée. Notre réaction dépendra du score constaté. Quant au phénotype dommageable des souris modèles de la maladie d’Alzheimer, les souris seront mises à mort dès l'apparition des signes évidents de troubles nerveux fonctionnels.
Choix des espèces
À l’heure actuelle, à défaut d’alternatives, le modèle rongeur, ici la souris, reste le modèle le plus accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de celle de l’homme. Par sa petite taille, la souris est intéressante pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). La MA est un trouble neurologique multifactoriel qui implique différents mécanismes à l'origine de la maladie. De plus, les principaux modèles animaux expérimentaux de la MA sont des souris transgéniques. Nous nous réservons le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés. Pour les procédures sur les souris sauvages, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes » ayant en moyenne de 7 à 12 semaines. A cet âge, on limite ainsi les variations interindividuelles qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l’expression de certaines protéines. Les procédures sur les souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer seront effectuées sur deux 2 tranches d'âge : 1) les jeunes animaux (1 à 3 mois) qui ne présentent qu'un dépôt faible/initial d'espèces toxiques Aβ et Tau (stade précoce) ; 2) les souris âgées (6 à 8 mois) qui se caractérisent par un dépôt élevé et diffus d'espèces toxiques Aβ et Tau dans toutes les régions du cerveau (stade avancé).
Evaluation de candidats médicaments dans des modèles de neurodégénérescence chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2417
Un lot d'animaux déjà lésés est conservé pour tester deux substances à la suite, à trois doses, ce que le porteur présente comme une utilisation continue. 3 437 rongeurs vont être utilisés, 1 020 souris et 2 417 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue parce que les symptômes neurodégénératifs induits sont jugés incompatibles avec un maintien en vie. Les modèles reposent sur des injections de substances neurotoxiques, des chirurgies cérébrales de 30 à 60 minutes, une alimentation contenant un composé toxique pendant cinq semaines, puis jusqu'à trois heures de tests moteurs par jour pendant huit semaines. Le porteur décrit des déficits moteurs et mnésiques ainsi qu'une agressivité transitoire de trois semaines après administration du neurotoxique du modèle Alzheimer, et affirme que les candidats les plus prometteurs sélectionnés sur cultures de neurones doivent ensuite être éprouvés sur des animaux.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer l'efficacité de nouveaux candidats à inhiber l'apparition de symptômes moteurs ou cognitifs (traitement neuroprotecteur et neurorégénérateur) sur des modèles animaux mimant des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques ou une lésion cérébrale telle qu'une ischémie cérébrale. Ces maladies à un stade avancé sont invalidantes, voire mortelles en fonction de la position du caillot au niveau cérébral. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement pour stopper la progression de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer ou protéger les cellules lors d'une ischémie cérébrale. Des traitements thrombolytiques utilisés rapidement après l'apparition d'une ischémie cérébrale permettent de désagréger le caillot formé et rétablir la circulation sanguine. Des traitements symptomatiques sont également utilisés lors de poussées inflammatoires dans la sclérose en plaques ou pour limiter les symptômes (remplacement de la dopamine chez les parkinsoniens et augmentation des niveaux d'acétycholine pour la maladie d'Alzheimer). Des traitements immunomodulateurs sont également utilisés pour diminuer la fréquence des poussées et la progression de la sclérose en plaque. La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Pour ce faire, les troubles neurologiques peuvent être induits par l'administration d'une substance chimique neurotoxique par voie orale, par voie systémique, directement au niveau intra-cérébral ou par une action mécanique (occlusion d'une artère cérébrale par exemple).
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurodégénératives ou ayant subi une accident vasculaire cérébral (AVC). A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer. Les médicaments disponibles sur le marché permettent de limiter les symptômes dans un premier temps mais leurs utilisations restent limitées car ils ne stoppent pas la progression des maladies. Les traitements disponibles pour limiter la progression de la sclérose en plaques ne permettent pas de stopper complétement la maladie. Les traitements thrombolytiques utilisés lors d'un AVC permettent de rétablir la circulation sanguine mais aucune thérapie n'est disponible pour limiter les séquelles physiques. Il est donc important de pouvoir proposer des modèles translationnels pour pouvoir tester de nouveaux candidats médicaments dans ces différentes pathologies très invalidantes.
Procédures
Pour chaque procédure, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Le modèles de maladie de Huntington est induit par l’administration chronique de la substance réactive sur 5 jours; chaque administration dure environ 1 à 2 secondes. Des tests comportementaux moteurs (durée max =60 minutes et entre 1 et 3 tests sur 1 à 5 jours) peuvent être réalisés avant euthanasie des animaux et prélèvement d'organes. Pour mimer la sclérose en plaque, les animaux sont nourris avec des aliments contenants la substance réactive sur une durée de 5 semaines. Des tests comportementaux moteurs peuvent être réalisés pendant ces 5 semaines (maximum de 3 tests sur 1 heure, 1 fois par semaine). A la fin des expériences, des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Certains modèles de la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, des modèles de mort cellulaire ou d'accident vasculaire nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Cette intervention dure entre 30 et 60 minutes. Les animaux sont ensuite évalués dans différents tests moteurs (durée maximum = 3 heures par jour, 1 à 2 séries de tests par semaine sur 8 semaines maximum) ou non-moteurs (tests mnésiques réalisés quotidiennement pendant environ 1 h sur 4 à 5 semaines). Des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Pour chaque modèle, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations par bolus durent de l’ordre de la seconde. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier ou de l'induction d'une anesthésie gazeuse. L'injection d'une substance neurotoxique peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les modèles utilisés pour mimer certains aspects de la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington ou la sclérose en plaque peuvent induire des déficits moteurs légers à modérés (incoordination motrice). Dans les modèles de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer, les déficits attendus peuvent être d’ordre mnésique. Une agressivité transitoire peut être observée suite à l'administration de la substance neurotoxique dans le modèle de la maladie d'Alzheimer (comportement observé sur environ 3 semaines et qui diminue dans le temps). Certains tests mnésiques nécessitent un rationnement en nourriture pouvant causer un léger stress chez l'animal, mais pas de perte de poids (rationnement adapté pour éviter la perte de poids et récompense sous forme de nourriture donnée pendant le test). Le modèle d'accident vasculaire entraîne des déficits moteurs légers (difficulté à marcher, à coordonner les mouvements mais l'animal bouge quasiment normalement), modérés (réduction des déplacements) ou sévères (l'animal ne bouge presque pas).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences car ces modèles induisent des symptômes neurodégénératifs, incompatibles avec le maintien en vie des rongeurs dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives exploratoires permettant de screener un grand nombre de traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Ces tests ont été mis en place au laboratoire. Néanmoins, l'efficacité des traitements les plus prometteurs doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant l'évaluation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux, par exemple.
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires sont utilisés pour pouvoir séléctionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter le nombre d'animaux à tester sur des modèles plus complexes. Dans le cas des études chez l'animal vivant, les substances à tester ont déjà subi une phase de sélection afin de réduire le nombre d'animaux vivants testés. Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées. Les données seront analysées statistiquement avec des tests appropriés. Enfin, pour certains tests, un lot d'animaux est lésé et est gardé pour tester plusieurs substances à la suite (utilisation continue pour tester 2 substances à 3 doses).
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour chaque phase chirurgicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie jusqu'à 48 heures après l'opération. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une substance analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Dans la plupart des modèles de neurodégénerescence, l'évaluation comportementale peut être complétée par des marquages histologiques au niveau cérébral afin de raffiner le modèle. Les animaux sont maintenus en groupe pendant toute la durée des expériences, avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les études sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Par exemple, les substances anti-parkinsoniennes mises sur le marché ont été découvertes en utilisant des modèles pré-cliniques chez le rongeur. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études réalisées et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Dans certains cas, le modèle a été démontré pertinent que chez une espèce. Les animaux transgéniques inclus dans ce projet sont bien décrits dans la littérature et permettent de modéliser une maladie neurodégénérative d'ataxie-télangiectasie. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Evaluation de l’efficacité de traitements antidépresseurs administrés par voie orale en eau de boisson chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune boit pendant trois semaines une eau contenant un antidépresseur, puis passe trois tests comportementaux d'au plus dix minutes, destinés à mesurer l'incurie, l'anxiété et la résignation face à des situations que le porteur qualifie d'inconfortables. L'objet reste une vérification préliminaire, savoir si l'administration dans l'eau de boisson agit aussi bien que les injections répétées, pour des projets à venir. Le porteur présente cette étude comme participant "directement au principe de raffinement", alors que la procédure est classée sévère et qu'aucune des 40 souris ne pourra être réutilisée.
Objectifs
Le projet constitue une étude préliminaire ayant pour objectif de vérifier l’efficacité de traitements antidépresseurs administrés par voie orale dans l’eau de boisson. En effet, contrairement à certains traitements antidépresseurs, il existe peu d’études réalisant des traitements chroniques, par les traitements antidépresseurs qui nous intéressent dans ce projet, en eau de boisson. La plupart des études utilisent des injections. Or, nous avons pour projet d’utiliser l’administration orale, qui est moins invasive dans plusieurs projets actuels ou futurs. Nous souhaitons donc vérifier l’efficacité antidépressive de l’administration de ces traitements par voie orale dans l’eau de boisson. Nous étudierons les effets de trois antidépresseurs sur trois caractéristiques majeures de la dépression chez le rongeur : l’incurie, l’anxiété et la résignation. Ces paramètres seront étudiés dans trois tests comportementaux couramment utilisés pour tester l’efficacité des antidépresseurs. Un traitement antidépresseur déjà connu pour être efficace en administration orale dans l'eau de boisson sera utilisé comme contrôle positif.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer l'effet antidépresseur de 2 traitements antidépresseurs dans le cas d’une administration dans l’eau de boisson chez nos souris. Ceci nous permettra de déterminer s’il est préférable, dans l’ensemble de nos futures études impliquant l’utilisation d’un traitement chronique, d’administrer ces traitements par voie orale dans l’eau de boisson ou par des injections répétées dans la cavité abdominale.
Procédures
Chaque souris sera exposée à un seul antidépresseur pendant 3 semaines dans l’eau de boisson et subira les 3 tests comportementaux. Ces tests seront réalisés une seule fois successivement sur une période d'une semaine maximum et ont tous une durée maximale de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux permettant d’évaluer les effets des antidépresseurs ont pour objectif d’évaluer les réponses des animaux face à des situations inconfortables. Ainsi, ils entrainent un stress modéré. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes.
Devenir
La procédure étant classée sévère, l'ensemble des animaux seront mis à mort puisqu'ils ne pourront pas être réutilisés dans d'autres procédures.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de traitements antidépresseurs administrés par voie orale. Les traitements administrés par voie orale sont soumis à de nombreux échanges au sein de l’organisme permettant leur passage dans le sang puis, dans notre cas, de la barrière hémato-encéphalique pour atteindre leur cible. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Les nombres d’animaux par groupe (n=10) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de sorte à avoir une puissance statistique suffisante (>80%) pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 traitements différents).
Raffinement
Ce projet participe directement au principe de raffinement puisqu’il a pour objectif de tester l’efficacité de deux traitements antidépresseurs administrés dans l’eau de boisson afin d’éviter de réaliser des injections répétées dans de futurs projets. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris (handling) avant le début des tests comportementaux. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Pour ce dernier, le poids le plus élevé sert de référence pour calculer le pourcentage de perte. Les tests comportementaux sont susceptibles d’induire du stress dû à la manipulation répétée des animaux et à leur changement d’environnement. Pour réduire ce stress, les animaux seront soumis à un jour d’habituation.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui sont couramment utilisées dans notre laboratoire et dont le fond génétique est à l’origine de certaines lignées génétiques qui feront l’objet de projets futurs incluant l’utilisation de traitements antidépresseurs : il semble donc pertinent de réaliser les expériences préliminaires sur ce même modèle. De plus, le modèle murin, même non-déprimé, est un modèle prédictif de l'efficacité des antidépresseurs chez l'humain. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte (2 à 8 mois). C’est à cet âge que les souris seront utilisées dans de futurs projets.
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’état de dépression chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 3600
9 600 rongeurs, 6 000 souris et 3 600 rats, vont être utilisés pour tester des molécules candidates sur trois symptômes de la dépression, 6 000 d'entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun reçoit jusqu'à deux administrations par jour pendant quatre semaines, par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intradermique, et une partie reste isolée en cage individuelle jusqu'à 23 jours. Le porteur renvoie au long terme les données précliniques qu'il juge "indispensables" au développement de candidats médicaments, sans nommer les tests comportementaux employés. 8 700 animaux sont tués, 900 réutilisés dans d'autres projets quand la gravité réelle est restée légère ou modérée, les souris ne pouvant plus être remises en hébergement collectif.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouvelles substances pharmacologiques synthétisées ou acquises au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer les symptômes de la dépression chez l’Homme. Ce projet implique l’obtention de données comportementales chez l’animal nécessaires pour envisager la poursuite de développement de produits pharmacologiques chez l’Humain.
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l’animal l’efficacité potentielle de nouvelles substances pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de ces molécules à moduler les symptômes de la dépression chez le rongeur, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique choisie. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l’Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intra-veineuse ou intra dermique ) , la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas pas plus de 2 administrations/jour) ainsi que la durée (période maximale de 4 semaines) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
A l'issue de la procédure 1, classée comme sévère, tous les animaux seront mis à mort. Pour la procédure 2, les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Dans le cas des rats, les animaux contrôles pourront cependant être remis en hébergement groupé et réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. Dans le cas des souris, ne pouvant pas être remise en hébergement groupé, certaines pourront néanmoins être réutilisées uniquement pour des projets de biodisponibilité ou histologiques si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le symptôme de la dépression dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’Homme, la souris et le rat étant ici les espèces les plus adaptées.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, certains animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…) ou isolés de leurs congénères en phase active des tests lors de périodes les plus courtes possibles (durée max de l’isolement 60 min) selon les besoins de la procédure. Seule une procédure nécessitera un hébergement en cage seule des animaux mais la durée n’excèdera pas 23 jours (phase d’habituation de 12 jours incluse) et toujours avec eau/nourriture ad libitum et avec un enrichissement qui sera bien maintenu (appareil de nidification, tunnel…). Le change des cages se fait 1 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, aux administrations…).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur la dépression. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de douleur décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.
Effet de l’apprentissage et le phénotype dit-dépressif sur le connectome neuronal du système olfactif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Privées d'eau en dehors de deux heures par jour pendant un mois, des souris enchaînent des sessions d'apprentissage olfactif de trente à quarante-cinq minutes, six jours sur sept. Elles sont 560 au total, dont 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées pour l'analyse histologique de leur cerveau. Une partie reçoit de la corticostérone dans l'eau de boisson pendant un mois pour induire ce que le porteur nomme un phénotype dit-dépressif, avant cinq jours de tests comportementaux. Chaque souris peut subir jusqu'à deux chirurgies stéréotaxiques d'une heure, et des souriceaux de six jours sont également utilisés. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la dépression et les troubles bipolaires, sont renvoyées au futur.
Objectifs
Les troubles de l’humeur, parmi lesquels la dépression et les troubles bipolaires, sont des maladies psychiatriques hétérogènes affectant environ 15 % et 2 % de la population mondiale, respectivement. Malgré le grave problème de santé publique que représentent ces troubles (l’OMS prédit qu’ils deviendront la cause majeure de morbidité à travers le monde à l’horizon 2030), les traitements existants ont une efficacité limitée et 60-70 % des patients sont partiellement ou non-répondeurs. Il est nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie pour proposer de nouveaux outils diagnostiques et pouvoir développer des thérapeutiques plus spécifiques. Outre la modification de l’humeur, des études cliniques ont également montré l’existence d’altérations sensorielles. Chez l'homme, les troubles olfactifs qu'accompagnent les symptômes dépressifs sont cependant peu considérés dans les critères diagnostiques. Chez l'animal, l'ablation du bulbe olfactif, qui constitue un premier relai dans le cerveau pour le traitement des odeurs, induit un phénotype dit-dépressif et un modèle murin de dépression a révélé une déficience olfactive. De manière intéressante, ce déficit olfactif a été associé à un déficit dans a production des nouveaux neurones dans le cerveau mature, processus nommé neurogenèse adulte. En parallèle, des travaux récents ont démontré que les nouveaux neurones pourraient jouer un rôle dans l’attribution de la valeur hédonique des odeurs après un apprentissage olfactif.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’approfondir nos connaissances sur le phénomène d’intégration des nouveaux neurones dans un cerveau adulte ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des troubles de l’humeur. Une meilleure connaissance des liens entre neurogenèse, la fonction du système olfactif et troubles psychiatriques pourrait aider à déchiffrer la physiopathologie de maladies comme la dépression majeur or les troubles bipolaires. Ainsi, la connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques). Ces interventions ne durent pas plus d’une heure et chaque animal sera soumis au maximum à deux interventions séparées au minimum par 90 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif pour évaluer les effets de l’apprentissage sur la connectivité du système olfactif. Au cours de cette tâche, les animaux sont progressivement soumis à un contrôle hydrique. Les animaux auront accès à l'eau une fois dans la journée pendant et immédiatement après la tache de comportement (durée totale d’accès à l’eau = 2hs). Ce type d’apprentissage a une durée maximale de 1 mois, avec une session de 30 à 45 minutes par jour, chaque jour (6 jours sur 7). Pour l’induction du phénotype dit-dépressif les souris seront administrées avec de la corticostérone dans l’eau de boisson pendant un mois. Ensuite, des tests comportementaux seront réalisés pendant 5 jours. Chaque test aura une durée maximale de 10 min et on réalisera au maximum 2 tests par jour.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : stress induit et attendu pour les modèles de dépression Le contrôle hydrique peut aussi engendrer du stress aux animaux. Douleur, inconfort modérée de courte durée liés à la chirurgie De plus, les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier la réorganisation des connections à la suite d’un apprentissage olfactif ou de l’apparition phénotype dit-dépressif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes. De plus, l’analyse des connexions par la technique d’imagerie volumétrique sur du tissu cérébral rendu transparent à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière, nous permettra d’obtenir un maximum d’information pour chaque échantillon, de réduire la variabilité des donnés et ainsi de réduire le nombre d’animaux pour l’évaluation statistique de l’effet des différentes manipulations.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis. Des interventions adaptées seront mises en oeuvre en focntion des signes cliniques présentés par les animaux. De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
On étudie les modifications des connexions neuronales du système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs au cours de l’apprentissage olfactif peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps de ces expériences. Notre objet d’étude étant les cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de l’apprentissage et le phénotype dit-dépressif sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.
Circuits neuronaux des biais émotionnels dans un modèle murin de dépression.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chirurgie du cerveau sous anesthésie générale jusqu'à deux heures, deux interventions possibles par animal, implants portés jusqu'à deux mois, dix tests comportementaux à raison d'un par jour : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un phénotype qu'il qualifie de dit-dépressif et annonce une détresse "induite et attendue", tout en écrivant que les procédures du projet sont "relativement bien tolérées par les animaux". Les dix tests comportementaux ne sont pas nommés, alors qu'ils servent à mesurer l'approche et l'évitement de stimuli plaisants ou déplaisants. Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que des études histologiques sur leurs tissus sont prévues.
Objectifs
La dépression représente une cause majeure d’incapacité à l’échelle mondiale, affectant environ 300 millions de personnes dont 50% davantage de femmes. Or, la physiopathologie des troubles dépressifs est encore assez méconnue, tout comme les mécanismes par lesquels agissent les traitements antidépresseurs existants, dont l’efficacité est d’ailleurs limitée puisqu’environ un tiers des patients ne répondent pas aux thérapies classiques et plusieurs semaines sont nécessaires pour pouvoir observer ces effets. En outre, la dépression est accompagnée d’altérations sensorielles : les patients dépressifs percevraient les stimuli sensoriels comme étant moins plaisants, ou davantage déplaisants que des sujets sains. On parle ainsi d’un biais de valence négatif, qui est cependant peu considéré dans les critères diagnostiques. Or, ces biais émotionnels sont particulièrement intéressants à étudier d’un point de vue translationnel. D’une part, la réponse émotionnelle est assez facilement mesurable chez la souris, notamment à travers le comportement d’approche (stimuli plaisants) ou d’évitement (stimuli déplaisants), contrairement à d’autres symptômes plus classiques de la dépression comme l’humeur dépressive ou les idées suicidaires qui sont difficilement évaluables chez l’animal. D’autre part, ces biais perceptifs seraient rapidement restaurés après l’administration d’un traitement antidépresseur, c’est pourquoi la prise en compte de la réponse émotionnelle en clinique pourrait permettre de déterminer beaucoup plus rapidement si un patient répond efficacement ou non à la thérapie proposée et donc améliorer la prise en charge thérapeutique. Puisque l’amygdale basolatérale est une région du cerveau jouant un rôle majeur dans la régulation émotionnelle et l’attribution de la valence, et que l’activité de certaines voies neuronales de l’amygdale basolatérale serait modifiée dans des modèles de dépression, l’objectif de ce projet est ainsi (1) d’étudier la réponse émotionnelle dans des modèles de dépression de souris mâles et femelles en nous concentrant sur des stimuli olfactifs, (2) de comprendre quels circuits neuronaux sont impliqués dans ces biais émotionnels, et enfin (3) de chercher comment des traitements antidépresseurs à la fois classiques et innovants modulent l’état émotionnel ainsi que la réponse neuronale associée dans notre modèle murin de dépression.
Bénéfices attendus
En cherchant à comprendre quels sont les mécanismes sous-jacents au biais émotionnel négatif associé à un état dit-dépressif à l’échelle des circuits neuronaux, cette étude permettra d’améliorer notre connaissance et notre compréhension de la physiopathologie de la dépression. De plus, les diagnostics en psychiatrie reposent actuellement sur une approche catégorielle qui consiste à classer les patients selon la présence ou l’absence d’un certain nombre de symptômes discrets. Cependant, cette approche fait face à un nombre grandissant de limitations. En réponse à ces critiques, l’approche RDoC (Research Domain Criteria) propose de changer de paradigme diagnostique pour se fonder sur un continuum de symptômes et de biomarqueurs. De façon notable, les systèmes de valence positive et négative constituent deux des six domaines fonctionnels majeurs d’intérêt relevés par cette approche. Ainsi, en s’inscrivant dans cette approche alternative, notre étude des biais émotionnels négatifs dans une perspective translationnelle chez la souris pourrait non seulement permettre d’élucider de façon fondamentale certains mécanismes physiopathologiques de la maladie (bénéfices à court terme du projet), mais également d’ouvrir la voie au développement de nouveaux outils diagnostiques et de détection de réponse aux traitements antidépresseurs (bénéfices à long terme du projet). En particulier, la restauration de la réponse émotionnelle par un antidépresseur serait obtenue de façon très précoce après administration du traitement, bien avant des effets sur l’amélioration de l’humeur, c’est pourquoi ces biais sont particulièrement intéressants à étudier et pourquoi une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents serait cruciale d’un point de vue thérapeutique. Enfin, la dépression est une maladie qui touche 50% davantage de femmes que d’hommes. Toutefois, les mécanismes neuronaux à l’origine de cette différence sont encore largement méconnus. Ainsi, en comparant systématiquement des souris mâles et femelles tout au long de notre étude, nous pourrons également mettre en lumière l’existence ou non de mécanismes spécifiques au sexe à la fois dans l’installation du phénotype dit-dépressif et du biais de valence négatif, mais aussi dans l’efficacité de la réponse à un traitement antidépresseur.
Procédures
Dans ce projet, les souris pourront être soumises à différents types d’interventions : - Induction d’un phénotype dit-dépressif. Chaque souris ne pourra subir qu’une seule fois un des modèles de dépression. - Tests de comportement non-invasifs pour tester le phénotype dit-dépressif. Les souris devront réaliser au maximum 10 tests comportementaux différents (1 test/jour). - Administration chronique d’un antidépresseur (3 semaines), par voie orale ou par injection intrapéritonéale (1 injection tous les 3 jours) - Procédures chirurgicales sur le cerveau sous anesthésie générale. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris et chaque souris sera soumise à un maximum de deux interventions séparées par un minimum de 30 jours. - Ponction sanguine (environ 1 min par souris). Chaque animal subira un maximum de deux prélèvements sanguins, séparés au minimum de quatre semaines.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : 1) détresse induit et attendu pour les modèles de dépression. Cependant, notre stratégie expérimentale par rapport a des travaux précédents (durée réduite à 4 semaines de traitement, hébergement groupé) est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux et en réduisant la détresse et l’inconfort de l’animal. 2) les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours) liés à la chirurgie. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les souris. 3) La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (durée maximale de l’expérience : deux mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le phénotype dit-dépressif et les biais émotionnels. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal non-nécessaire à l’induction du modèle expérimental de dépression.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour comparer les groupes. De plus, nous nous attacherons à décrire au mieux le phénotype des animaux utilisés à l’aide d’une grande batterie de mesures comportementales et physiologiques. Cela nous permettra de réduire la variabilité intra-individuelle de chacun des tests, et ainsi de nécessiter d’un moins grand nombre d’individus pour évaluer l’effet de nos modèles et des traitements. Enfin, lorsque cela s’y prête, nous aurons recours à une étude longitudinale de l’état phénotypique et de la réponse neuronale des individus, ce qui nous permettra également d’augmenter notre puissance statistique et d’avoir besoin de moins d’animaux par groupe.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avec recours à : - un complément alimentaire hautement calorique (gel hydrique) - chauffage des cages - réhydratation sous cutanée - renforcement d’enrichissement des cages De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle animal est justifié par le fait que les circuits impliqués dans l’attribution de valence aux stimuli sensoriels sont très bien conservés entre l’homme et les rongeurs. Par conséquent notre travail permet de délimiter de nouvelles approches pour le diagnostic et les thérapeutiques des troubles de l’humeur chez l’homme tout en travaillant sur une espèce mammifère mais phylogénétiquement éloignée de l’homme. De plus, en dehors de l’induction du phénotype dit-dépressif souhaité pour l’étude, le type de procédures effectuées dans ce projet sont relativement bien tolérées par les animaux et des traitements anesthésiques et antidouleurs très efficaces existent pour cette espèce et seront appliqués pour ce projet. Nous utiliserons tout au long du projet des jeunes souris adultes, âgées de 8 semaines, car nous étudions des modèles de dépression chez le sujet adulte.
Evaluation de nouveaux candidats médicaments sur l’addiction et la pharmacodépendance
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1410
Cathéter veineux posé sous anesthésie jusqu'à une heure, deux injections par jour pendant environ un mois, séances de conditionnement de vingt minutes à deux heures par jour pendant jusqu'à quatre mois : 2 510 souris et rats vont être utilisés pour tester des candidats médicaments contre l'addiction. 1 910 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 600 d'un niveau léger, et 120 pourront être réutilisés après accord du vétérinaire, les autres étant tués lors d'un prélèvement terminal de sang ou de cerveau. Les tests comportementaux sont nommés, visites de compartiments et appuis sur leviers, et les animaux non-humains y sont rationnés en nourriture. Le porteur décrit les symptômes de sevrage attendus, hypothermie, tremblements, baisse d'activité, perte d'appétit pendant environ sept jours, et qualifie la restriction alimentaire de légère au motif qu'elle n'empêche pas la croissance pondérale.
Objectifs
La pharmacodépendance (dépendance aux substances psychoactives) représente une préoccupation majeure de santé publique. La plupart du temps, les drogues provoquent dans un premier temps des sensations de plaisir qui induisent un désir de renouveler l’expérience et conduisent certains sujets à ne plus pouvoir contrôler leur consommation. La pharmacodépendance réfère à un comportement pathologique de consommation, ayant des conséquences physiologiques, psychologiques et/ou sociales néfastes pour la personne et son entourage. La pharmacodépendance représente un problème majeur de Santé publique également de par le nombre très élevé de patients atteints ; à titre indicatif, selon les chiffres de 2022 publiés par l'Observatoire français des drogues et des tendances addictives (OFDT), 25,5% des adultes fument tous les jours et 10% boivent quotidiennement de l’alcool. Toujours selon l'OFDT, concernant les médicaments psychotropes (anxiolytiques, antidépresseurs, hypnotiques), 21% de la population de plus de 15 ans a bénéficié d'un remboursement de psychotrope au moins une fois dans l'année en 2017 en France ; or, ces médicaments peuvent être associés à un risque de mésusage ou d'abus. Enfin, les drogues illégales sont également expérimentées ou consommées de manière abusive par des millions de personnes en France. Or, les conduites addictives ont de multiples conséquences sanitaires et sociales (maladies, handicaps, suicides, violence, isolement, précarité...) et entraînent une mortalité évitable. Tout ceci souligne l'importance, outre les campagnes de prévention, de développer des traitements permettant de réduire la dépendance aux drogues (licites, illicites ou médicamenteuses) ainsi que les symptômes liés à l'arrêt de leur consommation (sevrage). L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité anti abus/dependance de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la pharmacodépendance repose généralement sur l’association d’un traitement médicamenteux, d’un suivi psychologique et d’un accompagnement social, mais il n'existe actuellement pas de traitement efficcae à 100% contre les problématiques liées à l'addiction ou au sevrage de drogues. Les procédures décrites dans ce projet permettent d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues. Ces traitements seront évalués contre la dépendance induite par différentes drogues, en fonction de leurs spécificités et objectifs cliniques (par exemple contre la morphine ou le remifentanyl pour évaluer l'effet d'un traitement potentiel contre l'addiction aux opiacés/opioïdes, ou contre la nicotine pour évaluer l'effet de traitement anti-tabagisme...).
Procédures
Les substances à évaluer, les contrôles positifs et les contrôles négatifs sont administrées par bolus (environ 1 seconde) ou infusion intraveineuse d’une durée de quelques secondes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou semaines (minimum 1 injection à maximum 2 injections par jour pendant environ 1 mois), selon le traitement étudié. Les procédures peuvent également nécessiter une ’implantation sur animal vigile ou sous anesthésie (durée de quelques secondes à quelques minutes selon le site d’implantation) et/ou la pose d’un cathéter veineux ou d'un dispositif pour infusion lente sous anesthésie (durée maximum d'1 heure). Par ailleurs, des prélèvements de sang (durée de quelques secondes à 3 minutes) pourront être réalisés selon une fréquence déterminée dans la limite des considérations éthiques (de manière standard, un prélèvement par jour et pas plus de 10% du volume sanguin au cours de l’étude). Les phases de test comportemental surviennent le plus souvent quotidiennement durant toute la durée de la procédure et peuvent consister en une simple observation de l'animal sans manipulation ou en des phases de conditionnement et de tests (visites de compartiments ou appuis sur leviers) dans des dispositifs spécifiques (minimum de 20 minutes par jour pendant 10 jours à maximum 2 heures par jour pendant environ 4 mois, selon la procédure). De plus, pour certaines procédures, les animaux sont rationnés en nourriture pendant toute la durée de l’expérience soit environ 4 mois.
Impact sur les animaux
Les administrations, les phases chirurgicales (implantation sur animal vigile ou sous anesthésie) ou les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress ou une douleur légère. Dans le test de sevrage, l'animal peut ressentir des symptômes associés au sevrage pharmacologique (tels que l’hypothermie, des tremblements, une diminution de l’activité locomotrice, une perte d’appétit, etc…). Ces symptômes apparaissent généralement dans les 24 heures suivants l’arrêt du traitement et peuvent persister pendant toute la durée suivant la phase d'administration (en général 7 jours). Dans les autres tests, les animaux sont placés dans des dispositifs spécifiques (boites de conditionnement) pour une durée de 10-20 minutes à 2 heures, ce qui peut induire un stress lors de la première exposition du fait de la nouveauté de l'environnement (auquel les animaux s'habituent rapidement). Dans les procédures de conditionnement opérant, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire qui peut augmenter la sensation de faim, mais n'empêche pas leur croissance pondérale.
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Les animaux soumis à un prélèvement terminal seront ethanasiés car le prélèvement d'une grande quantité de sang ou d'organes vitaux (tel que le cerveau) affecte le maintien en vie dans de bonnes conditions.
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils nécessitent l'étude de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques, que ce soit dans la phase de consommation ou de sevrage de drogues) et permettent l’étude des potentiels effets secondaires. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites spécifiques aux procédures et clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour toute procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Aujourd'hui encore, Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer l'efficacité des nouveaux candidats médicaments sur l'addiction et la pharmacodépendance. En effet, les rongeurs présentent des mécanismes neurobiologiques similaires à ceux rencontrés chez l'Homme, et il a été démontré leur capacité à s'auto-administrer plusieurs drogues de classes différentes, parfois jusqu'à cumuler les 3 principaux critères diagnostiques du Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux (DSM) symptomatiques d'une recherche compulsive et d'une perte de contrôle sur la prise de drogue. Principalement rongeurs (rats, souris) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historique et à la littérature scientifique. Ceci afin d'étudier les traitements potentiels aussi bien chez le jeune que chez l'adulte.
Modèles in vitro et ex vivo en neurologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 525
Des femelles gestantes de 15 à 20 jours et des souriceaux ou ratons âgés de 1 à 10 jours vont être tués pour prélever leurs neurones. 1 050 souris et rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, dont 450 menées sous anesthésie sans réveil, et tous seront tués pour prélever des structures du système nerveux central. Le projet, intitulé modèles in vitro et ex vivo, consiste à fournir des cellules et des tranches de cerveau pour trier des candidats médicaments avant les expériences sur animaux non-humains vivants, une étape que le porteur présente comme un moyen de réduire le nombre d'animaux non-humains utilisés. Le choix entre souris et rat dépend, selon lui, des expériences déjà faites ou à venir plutôt que d'une propriété biologique, et l'âge retenu va de 1 jour à 2 ans selon la maturité neuronale recherchée.
Objectifs
Les tests réalisés sur des cultures primaires (modèle in-vitro) ou sur des tranches de cerveau de rongeur (modèles ex-vivo) permettent d'obtenir des données préliminaires quant à la sécurité et l'efficacité de candidats médicaments, avant de devoir réaliser des études plus poussées dans des modèles de pathologies in vivo. Plus précisément, les modèles de cultures primaires permettent d’évaluer la réponse physiologique de cellules du système nerveux central (cellules provenant du cerveau ou de la moelle épinière) suite à l’ajout d’une substance toxique (exemple d’agents neurotoxiques ou chimiothérapies). Les modèles ex-vivo sont utilisés pour mimer la transmission synaptique ou la présence de décharges épileptiques induites par des substances chimiques. Ces différents tests permettent d'étudier les effets de substances pharmacologiques pour lutter contre des maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer, l'épilepsie ou la sclérose en plaques ou tester leur innocuité. Ces modèles sont utilisés pour évaluer les nouveaux traitements à un stade très précoce et sélectionner les substances les plus efficaces pour les tester sur des modèles plus complexes (modèles in-vivo).
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de cancers ou de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, les traitements chimiothérapeutiques induisent des effets secondaires sur le Système Nerveux Central, l'évaluation de ces effets adverses sur des modèles in-vitro est donc nécessaire. D'autres modèles permettent d'évaluer l'efficacité de traitements anti-épileptiques, les traitements actuels sur le marché n'étant pas efficaces chez tous les patients. Enfin, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la sclérose en plaque ou la maladie d'Alzheimer ; la recherche de nouvelles substances reste donc une priorité. Les modèles in vitro et ex vivo sur cultures primaires ou sur tranche permettent également de raffiner les procédures, sélectionner les meilleurs candidats médicaments et réduire le nombre d'animaux en recherche
Procédures
Les animaux seront soumis à une euthanasie (sous anesthésie) pour prélevement de structures du système nerveux central. Dans certains cas, ils peuvent préalablement être soumis à une administration de substances (bolus rapide, durée de quelques secondes) Cette administration, dans certains cas précis, peut nécessiter une chirurgie préalable (durée de 10 à 60 minutes).
Impact sur les animaux
Pour ces modèles, les animaux sont anesthésiés puis euthanasiés avant le prélèvement des structures/organes nécessaires. L'anesthésie induit un léger stress chez l'animal. L'administration de candidat médicament par voie orale ou systémique est également légèremment stressant chez l'animal même si la procédure est de courte durée. Dans certains cas, les candidats médicaments seront administrés par voie intrathécale ou intracérébrale. L'injection du candidat médicament (trou dans le crâne et canule insérée dans le tissu cérébral ou aiguille insérée au niveau des lombaires) peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les animaux transgéniques utilisés dans ce projet peuvent présenter un phénotype dommageable (des déficits moteurs, difficultés à s'alimenter, symptômes épileptiques) même s'ils sont censés être testés avant l'apparition de ces symptômes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. Chaque procédure nécessite la mise à mort des animaux afin de prélever les structures cérébrales nécessaires pour les tests in vitro ou ex vivo.
Remplacement
Ces modèles constituent des méthodes alternatives permettant de tester un grand nombre de molécules sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Les modèles in-vitro ont l'avantage d'être translationnels mais ne peuvent être utilisés que pour évaluer des molécules sur des modèles simples (cellules).
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires ou sur tranches sont utilisés pour pouvoir sélectionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter le nombre d'animaux à tester. L'utilisation de cellules issues d'animaux permet d'obtenir des données d'efficacité et de sécurité d'un nombre très important de composés et/ou de doses, permettant une réduction importante du nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux est prévu pour réaliser entre 10 et 25 études en fonction de la procédure et pour chacune des espèce (souris et rat).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de mettre à mort précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général). Les animaliers et les techniciens sont formés au suivi des animaux et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas des femelles gestantes, pour éviter les agressions). Les animaux sont anesthésiés avant d'être mis à mort. Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Si une chirurgie est nécessaire, une anesthésie est associée à un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie et pendant 48 heures après l'opération. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. L’animal est placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant).
Choix des espèces
Les études sont effectuées sur des cellules ou organes de rongeur car ces modèles sreproduisent en partie certaines pathologies observées en clinique et permettent de prédire l'efficacité de futurs candidats médicaments de manière fiable. Le choix de l'espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études à venir (modèles pathologiques reproduits chez la souris ou chez le rat). Pour mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques, ces modèles peuvent être également utilisés à posteriori. Le choix de l'espèce est dans ce cas lié aux études précédentes. Pour les cultures primaires réalisées à partir d'embryons, des mères gestantes seront utilisés (mères ayant 15 à 20 jours de gestation en fonction de la structure à prélever, pour des cultures de neurones embryonnaires). Pour les cultures primaires réalisées sur des animaux nés, des rongeurs âgés entre 1 et 10 jours seront utilisés. Le stade de développement choisi dépend du stade de maturation souhaité (les neurones post-nataux étant plus différenciés, et permettant d'étudier un réseau neuronal plus mature). Pour les modèles sur tranches, les rongeurs (souris, rats) sont testés une fois sevrés, l'âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Les procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période de post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Etude de la composition lipidique membranaire et de son impact sur la diffusion et l’accumulation de la production de protéines amyloïdes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est enfoncée dans le cerveau pour y injecter des fibrilles de protéines, au cours d'une intervention de trente minutes sous anesthésie, suivie d'injections répétées pendant soixante-douze heures. 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur en attend le rôle des lipides membranaires dans l'accumulation des protéines amyloïdes des maladies d'Alzheimer et de Parkinson, et décrit une activité locomotrice modifiée et un état d'anxiété altéré dont il affirme qu'ils n'ont aucun impact sur la santé des souris. Sept tests comportementaux sont annoncés, de trois à six minutes chacun, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Les maladies d'Alzheimer et de Parkinson se caractérisent par l'accumulation d'agrégats protéiques dans le cerveau. Dans des conditions normales, les protéines qui composent les agrégats sont fortement associées à la membrane cellulaire pour remplir leurs fonctions. Nous visons ici à comprendre le rôle des lipides – principaux composants membranaires – dans le traitement, la propagation et l’accumulation des protéines amyloïdes dans le cerveau. Nous émettons l'hypothèse qu'une composition altérée de la membrane lipidique pourrait favoriser ou arrêter la génération et la propagation des protéines amyloïdes.
Bénéfices attendus
La recherche dans le domaine neurodégénératif s'est concentrée sur la biologie des protéines au cours des 30 dernières années, et pourtant de nombreuses informations manquent. Récemment, les lipides et les enzymes impliqués dans le métabolisme lipidique ont été mis à l'honneur dans la recherche sur la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Ainsi, avec ce projet, nous créerons de nouvelles connaissances dans ce domaine encore peu étudié, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux ne subiront qu'une seule intervention chirurgicale. L'intervention chirurgicale unique dure au maximum 30 minutes sous anesthésie et analgésie précédée et suivie d'injections intrapéritonéales et sous-cutanées répétées sur 72 heures. Durant l'intervention chirurgicale l'injection intracérébrale durera 5 minutes (3 minutes d'injection et 2 minutes en laissant la canule en place pour permettre la pénétration de la solution injectée). Sept tests comportementaux seront réalisés (durée de 3-6 minutes pour chaque test).
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à la chirurgie sous anesthésie générale et analgésie. Les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur modérée et de l’inconfort. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Les animaux peuvent présenter également des changements subtils dans leur comportement, tels qu'une activité locomotrice différente et un état d'anxiété modifié. Ces changements n’ont aucun impact sur leur santé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Pour étudier les maladies neurodégénératives nous avons encore besoin d’utiliser un modèle vivant assez proche de l’être humain et utilisable facilement en laboratoire. Les meilleurs modèles de maladies neurodégénératives qui ont été caractérisés restent des lignées transgéniques de souris. Pour étudier le métabolisme des lipides, les modèles génétiques ont également été établis chez la souris. La combinaison de ces 2 conditions représente le modèle idéal pour étudier ces maladies neurodégénératives.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques. En effet, une recherche antérieure sur la maladie de Parkinson utilisant certaines souris nous a permis d'effectuer une analyse et d'estimer la taille minimale des cohortes à analyser. La même recherche nous a permis de détecter un taux d'échec maximum de 10 % suite à des interventions chirurgicales. Pour les collectes de tissus, sur la base d'une comparaison de 2 groupes indépendants, et en prenant en compte cette perte potentielle de 10% ainsi que des effets techniques pouvant représenter jusqu'à 10% de la variabilité, nous avons déterminé qu'un effet différentiel pourra être détecté avec un effectif de 16 animaux par groupe (8 mâles et 8 femelles). Après les tests comportementaux, les individus seront considérés pour la collecte de tissus, pour détecter aussi un effet.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avoir recours à : un complément alimentaire hautement calorique, chauffage des cages, réhydratation sous cutanée renforcement d’enrichissement des cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Si le point limites sont atteint les animaux sont mis a mort. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats.
Choix des espèces
Nos questions biologiques nécessitent d’induire des modifications génétiques. De nombreux outils de manipulation génétique sont disponibles chez la souris, ce qui en fait un modèle animal de choix pour notre projet. De plus, l’organisation du cerveau de souris présente des similarités avec le cerveau humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier les maladies neurodégénératives. Des travaux ont notamment démontré que la souris est un modèle d’étude valide pour étudier les maladies neurodégénératives. Dans ce projet, nous utiliserons des souris non modifiées et des souris transgéniques permettant de vérifier le rôle des lipides dans la biogenèse, l’accumulation et la propagation des protéines à l’origine de maladies neurodégénératives. Étant donné que les maladies neurodégénératives affectent le cerveau adulte, nous utiliserons des souris adultes tout au long de l’étude. Le groupe expérimental de souris sera donc composé de compagnons de portée âgés de 8 à 12 semaines. Cet âge permettra le double objectif d'analyser le cerveau adulte, mais permettra en même temps l'analyse des stades avancés de la pathologie (3 mois post-opératoires) sans aucun effet secondaire lié à l'âge, qui pourrait perturber les résultats obtenus. En effet, même si certains groupes seront évalués des mois après l'administration des fibrilles, les analyses seront réalisées à un stade où les souris ne sont pas encore trop âgées. Celui-ci vise à prévenir les décès naturels liés au vieillissement avant la conclusion de leur suivi expérimental.
Traitement pharmacologique dans l’enfance du Syndrome du X Fragile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Une injection quotidienne du cinquième au vingt et unième jour de vie, puis une injection de facteur inflammatoire dans une patte arrière: c'est le sort de chacune des 3 200 souris expérimentales de ce projet sur le syndrome de l'X fragile, auxquelles s'ajoutent 350 reproductrices amputées du bout de la queue pour génotypage. Toutes sont tuées à l'issue, 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 350 un niveau léger. S'y ajoutent des tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique provoquant une douleur qui peut durer jusqu'à une heure, et 72 heures d'isolement visuel et olfactif pour mesurer l'activité jour-nuit. Le porteur prévoit de tuer sur le champ tout animal montrant paralysie, vocalisations ou convulsions, et explique qu'analgésiques et anesthésiques restent exclus d'un protocole dont la douleur est l'objet d'étude.
Objectifs
Le syndrome X fragile (FXS) est une maladie neurodéveloppementale, cause la plus fréquente (1/4 000 hommes et 1/7 000 femmes) de l'autisme avec retard mental héréditaire. Il est dû à une mutation sur le chromosome X qui entraîne l’absence de la protéine FMRP qui contrôle de nombreuses fonctions dont la quantité et la localisation de nombreuses protéines cellulaires dans les neurones. En clinique humaine, comme dans la souris génétiquement modifiée modèle de la pathologie, le FXS est associé à des troubles des comportements socio-cognitifs et sensori-moteurs, et à des défauts cellulaires de morphologie et de plasticité synaptique des neurones. Selon le génotype, on pourra distinguer des individus atteints (hommes et les femmes), mais aussi des femmes porteuses faiblement ou non symptomatiques. In vivo, l'inhibition pharmacologique d'enzymes particulières produit un phénomène de "sauvetage" des défauts sociaux-cognitifs des souris transgénique modèles de la pathologie humaine. Dans une perspective thérapeutique chez l'humain, ce projet a pour objectif de tester l'efficacité d'un traitement chronique précoce par des inhibiteurs pharmacologiques de ces enzymes dans l'enfance des souris modèle du FXS, sur les troubles sensori-moteurs caractéristiques de la pathologie et associés aux troubles socio-cognitifs. Quatre inhibiteurs seront testés, dont certains développés en collaboration, présentant des propriétés pharmacologiques différentes et ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Sur le plan de la recherche fondamentale, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes neuronaux moléculaires et les voies de transduction dans les fonctions sensorielles et sensori-motrices. Sur le plan de la recherche appliquée et clinique, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les symptômes associés au syndrome X Fragile et de proposer une nouvelle cibles thérapeutiques. Avant de proposer de tester de nouveaux composés chez l'homme, il faut en valider les effets sur un modèle de souris génétiquement modifié qui reproduit fidèlement les symptômes comportementaux et neuro-anatomiques des individus atteints de FXS.
Procédures
Les souris reproductrices (350 souris) subiront une ablation du bout de queue pour génotypage. Toutes les souris expérimentales (3200 souris) subiront un traitement chronique P5-P21 (de 5 à 21 jours après la naissance) par injection quotidienne (30 sec /souris/jour pendant 15 jours), ainsi qu'un prélèvement sanguin par veine caudale sous contention (5 min), une injection intraplantaire (30") dans une patte arrière et pour la moitié une anesthésie chimique (5 min), un prélèvement sanguin sous anesthésie (1 min) avant euthanasie (5 min), alors que l'autre moitié subira une anesthésie gazeuse avant euthanasie (5 min).
Impact sur les animaux
Bien que rares, des inflammations ou infections pourront se développer aux points de prélèvements (queue) et d’injections. Le traitement chronique sur les souriceaux (P5-P21) peut entrainer une dégradation de l'état général qui constituera un point limite. Les gestes de contention et les tests d'interaction sociale, les tests sensori-moteurs et les tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique non invasifs peuvent induire du stress, qui sera néanmoins réduit (nuisance modérée) par l’habituation préalable. Un isolement visuel et olfactif relatif de 72h sera nécessaire pour mesurer les variations d’activité durant le cycle jour-nuit. Pendant les tests comportementaux de sensibilité cutanée, une douleur cutanée transitoire ou prolongée (max 1h) sera ressentie sur la queue ou une patte arrière.
Devenir
Les souris sont génétiquement modifiées et ne peuvent être disséminées dans la nature pour adoption. De plus, elles ont subi un traitement pharmacologique, ainsi que des tests comportementaux invasifs avec injections de facteurs inflammatoires. Elles ne peuvent donc pas être conservés pour une réutilisation. Elles seront donc mises à mort en fin de protocole et permettront des prélèvements sanguins et tissulaires nécessaires aux résultats expérimentaux.
Remplacement
Les expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et des processus sensori-moteurs. Elles permettent aussi d'utiliser des souris génétiquement modifiées, transposition directe de la pathologie humaine chez l'animal. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques.
Réduction
L‘objectif de Réduction a été pris en compte car le nombre total de souris (3200) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (15 souris/condition + une sécurité optionnelle de 5 souris/lot pour compenser l’exclusion de certains animaux en cours d’étude selon les points limites prévus). Toute expérience rendue inutile par des résultats obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. En fonction de leur génotype, de leur sexe et de leur traitement pharmacologique les lots de souris seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés à la distribution statistique des données et au type de comparaison choisies (comparaison sur le même animal ou sur des animaux différents). Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souriceaux les deux génotypes mâles et des trois génotypes femelles (dont des animaux normaux) qui devront être comparés (la pathologie X-Fragile est causé par une mutation sur le chromosome X). Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées (nombre des bébés, sexes et génotypes) déjà produits et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem.
Raffinement
Pendant les expériences, un suivi quotidien sera réalisé par contrôle visuel de l'état de l'animal et de ses sites d'injection ou de prélèvement, ainsi qu’un contrôle expérimental (comportement mesuré par le test). Le poids de chaque souriceau sera relevé et, en cas de stagnation ou de décroissance de la prise de poids sur deux jours, le souriceau sera euthanasié. Les risques de rejet et de cannibalisme liés à la manipulation des souriceaux sera limité en mettant les souriceaux en contact avec l’urine de la mère avant d’être remis dans le nid. Dans le cadre de la prise en compte de leur souffrance, les animaux adultes seront habitués aux tests préalablement afin de réduire leur stress. Chaque test/intervention sera séparé au minimum d’une semaine du suivant. Si un animal est blessé ou présente des signes d’infection au site d’injection ou de prélèvement, nous l'isolerons et le soignerons jusqu'à guérison (si après une semaine l'animal est encore blessé, il sera mis à mort). Tout animal qui présenterait des signes de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement anormal (prostration, apathie…) ou d‘une pathologie quelconque serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans les protocoles qui ont pour objet d’étude la douleur.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer le comportement « normal » ("sauvage") avec le modèle transgénique du FXS (souris Fmr1-KO), et d'étudier les défauts de comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensori-moteurs que l'on peut retrouver chez les patients. D'autre part, de nombreux modèles comportementaux de douleur et de motricité font actuellement référence chez la souris dans le type d’étude que nous souhaitons mener. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques. Le traitement pharmacologique chronique sera réalisé de P5 à P21 (de 5 à 21 jours après la naissance), correspondant à l'enfance chez la souris, où le processus neurodéveloppemental est crucial. Les tests sensori-moteurs et sociaux seront conduits à 1 mois à l’adolescence, une période clé du développement de l’autisme, puis de 8 à 20 semaines afin d'évaluer le bénéfice du traitement pharmacologique précoce à l’âge adulte.