Troubles nerveux

Une injection qui déclenche une inflammation, un AVC provoqué chirurgicalement en une trentaine de minutes, des injections de microparticules d'oxyde de fer, quarante minutes d'imagerie par résonance magnétique, une heure d'imagerie par ultrasons après ouverture de la peau du crâne, la pose d'une fenêtre crânienne, puis une perfusion intracardiaque. 3 025 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour savoir comment les cellules inflammatoires gagnent le cerveau après un accident vasculaire cérébral. Le porteur annonce une pesée quotidienne et une notation de la grimace, les souris étant tuées au-delà de 15 % de perte de poids ou d'un score supérieur à sept pendant les quarante-huit heures critiques. Toutes sont mises à mort pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Les méninges ont été récemment (re)découvertes en tant que voie d’infiltration immunitaire, notamment dans les pathologies auto-immunes, et jouent également un rôle dans la régulation du débit sanguin cérébral, le drainage des antigènes vers le compartiment immunitaire, ainsi que la circulation des leucocytes du parenchyme vers la circulation sanguine. Cependant, le rôle des méninges dans l’AVC ischémique est peu connu. A partir de ces informations, nous suggérons qu’une meilleure compréhension des voies et des mécanismes par lesquels les cellules inflammatoires infiltrent le parenchyme à la suite d’un AVC ischémique nous conduira vers de nouvelles possibilités de traitement. Afin de répondre à cette problématique, le projet prévoit l’utilisation combinée de techniques d’imageries innovantes et performantes, de modèles expérimentaux adaptés et des manipulations aux niveaux tissulaires et cellulaires, et porterons notre attention vers les lieux de l’inflammation méningée.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet pourront grandement améliorer notre compréhension de la physiopathologie de l’AVC et présentent un grand potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux du projet seront répartis en plusieurs groupes et seront soumis à certaines interventions correspondant au protocole suivi par chaque groupe. L’ensemble des interventions prévues durant le projet sont les suivantes : - Une injection intrapéritonéale d'un produit induisant une inflammation (animal vigile contentionné, < 1 minute) - L’induction d’un AVC (acte chirurgical, environ 30 minutes) * - Des injections intraveineuses de microparticules d’oxyde de fer (< 1 minute) * - Des examens d’imagerie par résonance magnétique et par particules magnétiques (environ 40 minutes) * - Des examens d’imagerie par ultrasons, nécessitant l’ouverture de la peau de la tête (contient un acte chirurgical, environ 1 heure) * - Des examens d’imagerie en microscopie bi-photonique, nécessitant l’ouverture de la peau de la tête (contient un acte chirurgical, environ 40 minutes) * - Une pose de fenêtre crânienne (acte chirurgical, environ 30 minutes) * - Perfusion intracardiaque (acte chirurgical, environ 10 minutes) * Les interventions marquées d’un astérisque sont réalisées sur l’animal sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient : Pour l’ensemble des procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et par le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids, observation dans la cage en s’assurant du bien-être des animaux, échelle de grimace de la souris, prise alimentaire et boisson). Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra en un simple coup d’œil d’identifier et de surveiller particulièrement les animaux les plus « à risque ».

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales prévues pour la réalisation du projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants, car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La physiopathologie du modèle, globalement établie, nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra de mieux comprendre la physiopathologie de l’accident vasculaire cérébral et de ce fait améliorer la récupération des patients.

Réduction

Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assuré d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur chaque modèle. Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues). L’ensemble des échantillons prélevés lors des procédures pourra être partagé et utilisé, permettant une réduction du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés durant tout le projet. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun comportement de maladie. Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (échelle de grimace de la souris) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle malgré les soins apportés. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra en un simple coup d’œil d’identifier et de surveiller particulièrement les animaux les plus « à risque ». Durant les chirurgies prévues dans la procédure, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie (injection sous cutanée minimum 20 minutes avant le début de la chirurgie). Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l’endroit à inciser. Les yeux des souris seront couverts par du gel ophtalmique afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris sont placées dans des enceintes de réveil chauffées, avant d’être remises dans leur cage respective, où elles disposeront de croquettes humides ou de diet gel auxquels elles auront été habituées sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature, et les techniques employées sont bien maîtrisées. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont similaires chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. L’ensemble des procédures comprend des animaux âgés de 8 à 15 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ainsi que des animaux âgés de 16 mois, correspondant à un stade adulte âgé. Cela permettra de fournir un modèle pertinent et de reproduire la variabilité liée à l’âge dans l’inflammation et la récupération post-ischémique.

Quatre chirurgies de trois à six heures par animal, un examen IRM et trois scanners sous anesthésie générale: quatre macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué à l'issue, le porteur indiquant qu'ils pourront rejoindre un autre projet ou "gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite". Pendant environ un an et demi, ils travaillent cinq jours par semaine sur une tâche de choix entre deux mouvements du bras, motivés par un contrôle alimentaire puis, en dernier recours, hydrique, pour tester l'hypothèse d'un signal d'urgence fourni par les ganglions de la base. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'il est "impossible de répondre à la question" dans ce projet.

Objectifs

Ce projet, se déroulant dans deux EU, vise à mieux comprendre le fonctionnement neurophysiologique d’un ensemble de structures cérébrales sous-corticales, les ganglions de la base, chez le primate non-humain lors de la prise de décision entre actions, comportement typique de la vie quotidienne aussi bien pour ces animaux que pour les humains. Au-delà de l’apport en connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, cette problématique représente un enjeu de santé publique car un dysfonctionnement des ganglions de la base est associé à de nombreux déficits neuropsychiatriques et neurologiques liés à la prise de décision et l’exécution de l’action, dont les troubles obsessionnels compulsifs, l’impulsivité et la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Dans notre vie quotidienne, nous devons continuellement faire des choix entre actions potentielles, que ces choix soient guidés par des stimuli sensoriels externes (feu rouge = appui sur la pédale de frein ; feu vert ; appui sur l’accélérateur), ou par des indices de valeurs acquis par l’expérience (mouvement du bras vers la droite pour prendre une tasse de café, ou à gauche pour prendre la bouteille de jus d’orange). Les mécanismes neuronaux sous-tendant ces sélections et exécutions d’actions sont donc sollicités en permanence mais malgré des décennies de recherche, leur compréhension reste incomplète et controversée. Les données de la littérature les plus récentes indiquent que les décisions entre actions seraient déterminées dans les mêmes structures que celles impliquées dans la préparation et l’exécution de l’action, le cortex sensorimoteur, selon un mécanisme computationnel comprenant un signal d’urgence qui pousse les sujets à agir en situation d’incertitude. Elles suggèrent également que les ganglions de la base (BG) fourniraient ce signal d'urgence, permettant l’ajustement du compromis vitesse-précision en fonction du contexte dans lequel la tâche est effectuée. De façon importante, les BG sont interconnectés avec de nombreuses aires corticales et il est aujourd’hui admis que la compréhension du fonctionnement de ces noyaux nécessite l’étude du réseau cortico-ganglion de la base dans son ensemble. Ce projet vise donc à tester l’hypothèse novatrice selon laquelle les ganglions de la base régulent la prise de décision et l’exécution de l’action en fournissant aux structures cérébrales, notamment corticales, responsables du choix de l’action un signal « énergisant » appelé urgence, permettant de choisir et d’agir au moment opportun et à la bonne vitesse. En soutient de cette hypothèse, une incapacité à décider au bon moment ou à agir avec la vitesse appropriée est caractéristique de nombreux troubles neuropsychiatriques et neurologiques basés sur un dysfonctionnement des ganglions de la base, tels que l’impulsivité, les troubles obsessionnels compulsifs ou la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux recevront un entrainement sur une tâche comportementale avec renforcement positif (pastilles sucrées ou recompenses liquides) dans une salle de test (EU 1/2). Lors de cet entrainement, les animaux pourront être amenés à suivre un protocole de controle de la motivation pour les encourager à réaliser les séances comportementales. Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. La durée de l'entrainement et du controle de la motivation associé dépendront de la capacité des animaux à apprendre à réaliser la tâche comportementale, mais n'excède généralement pas un an et demi. Les singes passeront également des IRM (EU 1/2) et des examen de tomodensitométrie (CT-scan) (EU 2/2) sous anesthésie générale. Nombre : 1 IRM & 3 CT par animal. Durée : IRM 1 heure, CT 30 min. Les singes passeront quatre chirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et le retrait de ces dispositifs (EU 1/2). Nombre : Tous les animaux. Durée : de 3 à 6 heures. En cas d'infection suspectée, des prélèvements sanguins seront effectués chez l'animal sous anesthésie afin d'évaluer son état immunologique. En outre, des prélèvements locaux pourraient être réalisés sur un animal vigile maintenu avec la tête fixe, si nécessaire, dans le but de caractériser les souches bactériennes responsables de l'infection et de déterminer le traitement antibiotique approprié. Les singes fourniront des enregistrements intracérébàraux lors des sessions d'enregistrements électrophysiologiques avec renforcement positif (jus de fruit) dans une salle de test (EU 1/2). Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. Pour la réalisation de ces enregistrements électrophysiologiques, les animaux seront habitués à un protocole de contrôle hydrique. La durée des enregistrements électrophysiologiques et du controle hydrique associé dépendront de la capacité des animaux à réaliser la tâche comportementale, et à notre capactité à collecter les données neurophysiologiques nécessaires pour répondre aux questions du projet. Nous anticipons une durée n'excédant pas une année et demi.

Impact sur les animaux

Durant la phase d'entraînement à la tâche comportementale, l'application d'un contrôle de la motivation (controle alimentaire ou hydrique) pour motiver les animaux à travailler peut occasionner un certain inconfort. Toutefois, les animaux comprennent rapidement que leur coopération et la réalisation de la tâche leur garantissent l'accès à leur ration journalière complète et des friandises en bonus. Concernant les acquisitions de données IRM ou CT-scan, réalisées sous anesthésie générale, un inconfort lié à l’anesthésie (fatigue, nausées, vomissements) peut survenir au réveil de l'animal mais il s'estompe rapidement. Pour ce qui est des interventions chirurgicales (i.e. l'implantation du plot de fixation de la tête et du dispositif d'enregistrements électrophysiologiques), des douleurs post-opératoires peuvent être présentes. Cependant, une médication appropriée, incluant des analgésiques, des anti-inflammatoires et des antibiotiques si nécessaires, est mise en place en collaboration avec le vétérinaire pour les minimiser.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Remplacement

Il est de nos jours impossible de recueillir les données nécessaires à la réalisation de ce projet à partir d'expériences qui n'impliqueraient pas les animaux, et les primates non humains en particulier. En comparaisons à d’autres espèces animales, les expériences menées chez le singe macaque présentent plus de pertinence pour la compréhension des fonctionnements et disfonctionnement de la cognition et de l’action humaine en raison des capacités cognitives et motrices de cet animal très proches de celles de l’humain, et des similarités structurelles du cerveau entre les deux espèces. Il est donc impossible de répondre à la question du remplacement dans ce projet.

Réduction

Pour des questions de robustesse et de reproductibilité des résultats, chaque question posée doit être abordée en fournissant des données complètes sur plusieurs animaux, selon la pratique habituelle en électrophysiologie sur primate non humain. Ce projet a été planifié afin de maximiser la quantité de données que l’on peut obtenir avec chaque animal et donc minimiser le nombre d'animaux nécessaires à cette étude. Plusieurs types de données seront collectées sur chaque animal : comportementales, psychophysiques, électrophysiologie musculaire et neuronale. De plus, la technique d’enregistrement neurophysiologique employée pour ce projet, technique largement utilisée par de nombreux laboratoires et ayant demontré son efficacité pour caractériser l'activité cérébrale, permettra de collecter de nombreuses données en un minimum de temps, réduisant ainsi le risque de recours à des animaux supplémentaires afin de guarantir la puissance statistique des résultats.

Raffinement

L’animalerie dans laquelle les animaux seront hébergés est spécialement étudiée pour favoriser le bienêtre animal. L'animalerie dispose de lumière naturelle, de distractions grâce aux vues sur l'activité humaine, de contacts sociaux, d'activités quotidiennes et un espace plus vaste dans lequel les animaux peuvent non seulement bouger mais aussi s'échapper comme ils le feraient dans la nature en cas de tension entre eux. Le contrôle de la motivation des animaux est choisi afin d’avoir le moins d’impact possible sur leur bien-être (mise en place progressive et individualisée du contrôle de la motivation, par contrôle alimentaire en priorité et hydrique en dernier recours). Dans tous les cas, les singes seront incités à coopérer et participer aux manipulations par le biais du renforcement positif. Les enregistrements électrophysiologiques sont conçus pour supprimer les gênes quotidiennes associées à ce type de procédure et les implants chirurgicaux seront fabriqués « sur mesure » pour diminuer les risques de complications post-chirurgicales. La pose de ces implants sera faite sous anesthésie générale et contrôle antidouleur permanent, en condition aseptique stricte. La chaise dans laquelle les singes effectueront la tâche est large et de type « ouverte », conçue pour que la contention soit minimale. Le matériel permettant de mesurer et enregistrer le mouvement des yeux et la taille de la pupille est basé sur l’analyse d’images vidéo et ne constitue donc aucune gêne pour l’animal. Des CT scan seront réalisés une fois que le singe sera implanté avec le dispositif d'enregistrements électrophysiologiques, dans le but de vérifier la position des électrodes en superposant ces images aux clichés d'IRM anatomique de l'animal. Lors des examens d’imageries, l'animal ainsi que ses paramètres physiologiques sont surveillés pendant toute la durée de l’examen. Cette procédure constitue un raffinement majeur, puisqu'elle permet d'éviter des analyses histologiques post-mortem et évite donc la mise à mort des animaux à la fin des procédures. Enfin, les implants chirurgicaux seront retirés à la fin de la procédure et les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Choix des espèces

Les expériences proposées dans ce projet reposent sur des questions qui peuvent seulement être résolues par des études chez le singe, et ce pour les raisons suivantes : La prise de décision entre actions et un comportement dit « interactif », qui nécessite souvent l’utilisation des bras et des mains guidés la vision pour atteindre et manipuler les objets qui nous entourent. Cette caractéristique exclue de fait le modèle rongeur (animaux se basant principalement sur l’olfaction pour l’exploration, comportement de transport des membres supérieurs et préhension pauvre) ainsi que les animaux plus anciens phylogénétiquement comme modèles préférentiels pour l’étude des bases neuronales de la prise de décision entre mouvements du bras dirigés vers un but. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte (le developpement du cerveau doit être complet).

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mini-pompe osmotique diffusant des anticorps de patients leur est implantée sous la peau du dos au cours d'une chirurgie d'une heure trente, sans anti-inflammatoire possible puisque les maladies étudiées sont neuroinflammatoires. Suivent trois tests comportementaux étalés sur 37 jours, dont sept jours d'apprentissage à retrouver une plateforme cachée dans une piscine remplie d'un liquide opaque et un conditionnement contextuel en chambre, les mâles étant hébergés seuls, ce qui supprime selon le porteur le blottissement et le toilettage entre congénères. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni in silico ne permet d'étudier l'effet de ces anticorps sur la mémoire et que seuls des animaux vivants le permettent.

Objectifs

Les maladies de la neuromyélite optique (NMOSD) et de la MOGAD sont des maladies neurologiques auto-immunes très invalidantes qui détruisent certaines cellules du cerveau. Ce n’est que récemment que des études cliniques ont mis en évidence des atteintes en dehors du nerf optique et de la moelle épinière, notamment des atteintes de l’hippocampe dans le cerveau qui est une région responsable de la mémoire, et des troubles de la mémoire. Ces troubles sont encore peu étudiés dans ces deux maladies alors que cela représente un réel handicap chez les patients. Une étude préliminaire utilisant des anticorps de patients ayant la NMOSD (appelés NMO-IgG) a démontré que les NMO-IgG impactaient l‘activité des neurones de l’hippocampe suggérant un mécanisme concernant l’origine des troubles de mémoire chez ces patients. Les effets de substances pharmacologiques suggèrent qu’il est possible de combattre les effets délétères des anticorps de ces maladies sur la mémoire. L’objectif est de tester l’impact sur la mémoire spatiale des auto-anticorps NMO-IgG et MOG-IgG (anticorps de patients ayant la MOGAD) chez la souris. Il s’agira dans un premier temps d’évaluer si les souris développent des troubles de la mémoire liés à la présence de ces anticorps par la réalisation d’expériences testant la mémoire spatiale, une mémoire dépendante de l’hippocampe. Si tel est le cas, des substances pharmacologiques seront utilisées dans un second temps afin de déterminer si elles bloquent les troubles de la mémoire. Ce projet permettra d’une part de déterminer si les anticorps de ces maladies induisent des troubles de la mémoire, et d’autre part d’offrir de nouvelles solutions thérapeutiques ciblées de ces atteintes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra pour la 1ère fois d’identifier l’impact des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG sur la mémoire. Cette étude permettra de caractériser les troubles de la mémoire, si ce sont des troubles de l’apprentissage ou des troubles de la consolidation de la mémoire, dans la NMOSD et la MOGAD. Ce projet permettra également d’analyser l’impact des anticorps sur différents types cellulaires dans l’hippocampe. Il permettra ainsi d’établir un lien entre auto-immunité, astrocyte et myéline étant des types de cellules présentes dans l’hippocampe et impliquées dans la mémoire. Enfin grâce à l’utilisation de produits pharmacologiques visant à rétablir les troubles de la mémoire, ce projet est une approche pré-clinique qui permettra d’offrir des pistes thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez les patients ayant la NMOSD et la MOGAD.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale avec implantation d'une mini-pompe osmotique, l'intervention durant 1h30 au maximum. L'intervention chirurgicale est suivie par une phase de récupération d'environ 5 jours. Par la suite, ils passeront 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 37 jours. Le premier test qui durera 30 minutes permet d’évaluer l’état de stress de la souris. Pour le second test, la souris qui est posée dans une piscine avec un liquide opaque et thermostaté doit pendant 7 jours apprendre à se rappeler de l’emplacement d’une plateforme cachée. Un jour et un mois après apprentissage, les capacités de rappel de l’emplacement de la plateforme seront testées. Le dernier test consiste à placer la souris pendant 6 minutes dans une chambre de conditionnement où elle pourra associer un évènement au contexte dans lequel elle est (la chambre). Un jour et un mois après, la souris est replacée dans le même contexte (la chambre) pour tester les performances de sa mémoire associative. Ces deux derniers tests permettent d’évaluer l’apprentissage et la consolidation de la mémoire spatiale.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire des effets secondaires indésirables : perte de poids, douleur, stress pendant quelques jours. Les souris seront implantées avec une mini-pompe pouvant représenter une gêne et de l’inconfort pour les souris. La réalisation d‘injections peut engendrer du stress. Cela peut mener à des infections chez la souris tout comme la présence de points de suture. Les tests comportementaux peuvent également induire de l’inconfort (nouvel environnement), un certain degré de stress et de la fatigue (tests répétés). L’hébergement spécifique des mâles induit chez les souris des interactions sociales minimisées et une absence de contact physique positif qui empêche le blottissement, le toilettage et le réchauffement des souris entre elles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et d'analyser les altérations morphologiques et cellulaires.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle cellulaire ou in silico ne peut permettre d’étudier les conséquences cognitives des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG. L’étude préliminaire ex vivo, bien qu’elle permette l’étude de mécanismes relatifs aux processus de mémoire, n’est pas suffisante pour démontrer un potentiel effet des anticorps sur des troubles de mémoire. L’étude physiopathologique de ces deux maladies, et donc l’effet d’anticorps sur la mémoire via des tests comportementaux, ne peut être effectuée que grâce à l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été établi à 15. Les prédictions statistiques se basent sur les résultats de plusieurs études comportementales menées chez la souris où le nombre d’individu requis pour observer des différences dans des tâches de mémoire où le comportement est subtil est de 15 avec une puissance statistique fiable, mais aussi sur l’évaluation d’un article. Dans cet article utilisant la même méthodologie que ce projet (diffusion d’anticorps humain de patients via une mini-pompe osmotique chez des souris de même souche), les résultats montrent qu’il faut au moins 15 souris par groupe pour atteindre une bonne puissance statistique. Deux études pilotes seront réalisées en amont des deux études comportementales pour permettre de valider la méthodologie. Il est important de noter que la deuxième étude pilote et l’étude comportementale sur la consolidation ne seront réalisées que si des différences statistiquement significatives sont obtenues lors de l'étude comportementale sur l’apprentissage. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, les souris ayant subi les tâches comportementales serviront également aux analyses du cerveau afin de corréler sur un même animal les performances de mémoire et les atteintes morphologiques.

Raffinement

Les animaux seront habitués à leur utilisateur et seront hébergés par petit groupe dans les cages ce qui permettra de réduire leur niveau de stress. Les cages seront enrichies par l’introduction de morceaux de carton, batônnets en bois à ronger, de la litière ainsi qu’une roue et un igloo. Les souris auront un accès permanent à l’eau et à la nourriture. Lors de la chirurgie, du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux. Une infiltration d’anesthésique sera faite en amont sur la zone d’incision. La cicatrisation sera facilitée en appliquant une crème cicatrisante sur la cicatrice. Un antiseptique sera appliqué sur la peau au niveau du champ opératoire et en post-opératoire sur la cicatrice pour éviter les infections. La mini-pompe osmotique sera placée sous la peau au niveau du dos et sur le côté pour ne pas gêner l’animal dans ses déplacements. L’emploi d’une mini-pompe osmotique a été privilégiée pour éviter des injections intracérébrales répétées aux souris. Le ciment dentaire utilisé pour fixer la canule sur le crâne sera limé si nécessaire pour éviter toute aspérité qui pourrait blesser la face interne de la peau de l’animal. Les maladies étudiées étant neuroinflammatoires, l’emploi de traitements anti-inflammatoires n’est pas envisageable. 8h après la chirurgie le temps que la première dose d’anti-douleur ait fait effet, les souris recevront une seconde injection en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’un suivi journalier post chirurgie jusqu’à la fin de la procédure à l’aide d’une grille d’évaluation basée sur un système de scorage permettant l’évaluation de la douleur, du comportement, de la cicatrisation, du poids et leur prise alimentaire et de leur agressivité à la manipulation. Un score trop élevé sur l’ensemble des catégories ou l’atteinte d’un point limite dans une des catégories conduira à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car elle possède une organisation anatomique et un réseau limbique similaire à l’homme avec un hippocampe très développé. Depuis 50 ans, la souris est considéré comme un des meilleurs modèles expérimentaux pour l’étude de la mémoire. Depuis 15 ans la plupart des études dans ce domaine sont effectuées sur ce modèle. Une étude pilote a montré que les anticorps des patients NMOSD et MOGAD reconnaissent leur cible chez la souris. Enfin, les souris présentent l’intérêt de permettre l’utilisation facile de souris de modèles transgéniques. Les souris seront utilisées à un stade jeune adulte, soit à 8 semaines. A cet âge les souris ont atteint leur taille définitive facilitant l’implantation des mini-pompes osmotiques. De plus, l’étude sur laquelle les hypothèses statistiques se basent utilise des souris âgées de 8 semaines.

Après l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes qui enregistrent l'activité du cerveau et des muscles, des souris passent deux semaines isolées chacune dans un baril individuel, une semaine puis un mois après l'opération. 45 souris transgéniques et témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour contrôler une seconde fois leur génotype et prélever leur cerveau. L'objectif est de décrire le sommeil de souris porteuses du gène humain muté de la dystrophie myotonique de type 1, une maladie où les patients souffrent souvent de somnolence pendant la journée. Le porteur affirme que la chirurgie "ne devrait pas induire d'effets indésirables", et prévoit pourtant un anti-inflammatoire et une surveillance de la cicatrisation autour de l'implant. Quant aux analyses moléculaires prévues sur les cerveaux, il écrit qu'elles "seront déterminées après l'analyse des résultats", sans en dire davantage.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1, prévalence : 1/8000) est une maladie génétique qui affecte presque tous les organes, comme le cœur et les autres muscles, mais aussi le cerveau. Il en résulte des troubles neurologiques qui ont un impact délétère sur les patients DM1 et leurs familles. Outre des symptômes cognitifs handicapants tels qu'une déficience intellectuelle sévère dans la forme congénitale, on retrouve chez les patients DM1 des altérations motrices, des changements de la perception de l’espace, un déficit attentionnel, de la fatigue intellectuelle et quelques cas d'épilepsies. Une somnolence excessive pendant la journée est également un symptôme fréquent. Initialement focalisée sur le muscle, la recherche sur DM1 dispose de peu de données sur la pathologie cérébrale et les mécanismes à l'origine des troubles neurologiques, comme l'altération de la qualité du sommeil, ont été très peu ou pas étudiés à ce jour. Notre but est de caractériser, dans le modèle murin de la pathologie, les modifications du sommeil.

Bénéfices attendus

La description très détaillée du cycle veille-sommeil au travers du modèle murin DMSXL apporteront des informations inédites sur la pathologie DM1. Nous pensons que les résultats obtenus aideront à la prise en charge de la maladie afin d'améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les 45 souris auront une implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes pour les mesures de l'activité électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG), chaque implantation durera au maximum une heure (en moyenne 45 minutes). Les souris seront placées en chambres d’enregistrement pour deux sessions d’une semaine d’enregistrement : une semaine après l’implantation chirurgicale et un mois après.

Impact sur les animaux

Outre l’injection intrapéritonéale de l’anesthésique qui pourra générer un léger stress, la chirurgie pratiquée ne devrait pas induire d’effets indésirables. L’effet indésirable attendu durant les phases d’enregistrement sera uniquement dû à l’isolement des animaux dans des barils individuels (les souris seront isolées deux fois 7 jours).

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de revérifier leur génotype. De plus, les cerveaux seront également prélevés pour des études ex vivo de biologie moléculaire, qui seront déterminées après l'analyse des résultats sur la qualité du sommeil.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. L’étude du cycle veille-sommeil n'est possible que sur un animal entier, vigile et se comportant normalement.

Réduction

45 animaux au maximum devraient être utilisés. Nous prévoyons d’utiliser 12 animaux par groupe (souris transgéniques et contrôles). L’obtention des données qualitatives et quantitatives sera analysée par des tests classiquement utilisés dans l’étude du sommeil sur ces effectifs. Si les 12 premières souris d'un groupe donnent des résultats de qualité, on n’utilisera pas les 3 souris supplémentaires de ce même groupe.

Raffinement

Des mesures appropriées seront prises pour suivre la pathologie (surveillance de la pousse des dents qui seront coupées si elles deviennent trop longues), pour minimiser le stress et mal-être individuel (hébergement enrichi et en groupe avant la chirurgie pour éviter un isolement social), pour gérer la douleur avant, pendant et après la chirurgie (médications par un anti-inflammatoire, surveillance de la cicatrisation au niveau de l’implant d’électrodes), et pour limiter l’isolement pendant les phases d’enregistrement électroencéphalographique avec des cages individuelles en espace ouvert pour empêcher que les congénères ne dégradent les implants et permettre aux animaux de se voir et sentir leurs odeurs.

Choix des espèces

Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie permettent d'étudier les mécanismes physiopathologiques. De plus, chez la souris adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer le sommeil dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle souris possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les souris ont une taille cérébrale qui permet d’étudier les oscillations locales de l'hippocampe ciblé dans notre projet. L'étude sera réalisée sur des souris âgées de 2 mois (plus précisément 8 semaines) afin d'être à un âge 1/ où le phénotype DM1 est bien établi et 2/ compatible avec l'implantation aisée des électrodes pour la mesure du sommeil.

Quatre chirurgies par animal pour implanter puis retirer un dispositif d'enregistrement cérébral et un plot de fixation de la tête, de trois à six heures chacune, et un contrôle alimentaire puis hydrique pour obtenir leur coopération: 4 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les séances de tâche comportementale durent de une à trois heures, cinq jours par semaine, pendant une période pouvant atteindre un an et demi pour l'entraînement, autant ensuite pour les enregistrements électrophysiologiques. Le porteur ramène ce contrôle de la motivation à un "certain inconfort" et affirme que les animaux comprennent vite que leur coopération leur garantit leur ration journalière complète, avant de conclure qu'il est "impossible de répondre à la question du remplacement dans ce projet". Les implants seront retirés en fin de procédure et les quatre macaques doivent rejoindre un autre projet ou un lieu de retraite, ce que le porteur présente comme un raffinement majeur puisqu'il évite les analyses histologiques post-mortem.

Objectifs

Ce projet, se déroulant dans deux EU, vise à mieux comprendre le fonctionnement neurophysiologique d’un ensemble de structures cérébrales sous-corticales, les ganglions de la base, chez le primate non-humain lors de la prise de décision entre actions, comportement typique de la vie quotidienne aussi bien pour ces animaux que pour les humains. Au-delà de l’apport en connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, cette problématique représente un enjeu de santé publique car un dysfonctionnement des ganglions de la base est associé à de nombreux déficits neuropsychiatriques et neurologiques liés à la prise de décision et l’exécution de l’action, dont les troubles obsessionnels compulsifs, l’impulsivité et la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Dans notre vie quotidienne, nous devons continuellement faire des choix entre actions potentielles, que ces choix soient guidés par des stimuli sensoriels externes (feu rouge = appui sur la pédale de frein ; feu vert ; appui sur l’accélérateur), ou par des indices de valeurs acquis par l’expérience (mouvement du bras vers la droite pour prendre une tasse de café, ou à gauche pour prendre la bouteille de jus d’orange). Les mécanismes neuronaux sous-tendant ces sélections et exécutions d’actions sont donc sollicités en permanence mais malgré des décennies de recherche, leur compréhension reste incomplète et controversée. Les données de la littérature les plus récentes indiquent que les décisions entre actions seraient déterminées dans les mêmes structures que celles impliquées dans la préparation et l’exécution de l’action, le cortex sensorimoteur, selon un mécanisme computationnel comprenant un signal d’urgence qui pousse les sujets à agir en situation d’incertitude. Elles suggèrent également que les ganglions de la base (BG) fourniraient ce signal d'urgence, permettant l’ajustement du compromis vitesse-précision en fonction du contexte dans lequel la tâche est effectuée. De façon importante, les BG sont interconnectés avec de nombreuses aires corticales et il est aujourd’hui admis que la compréhension du fonctionnement de ces noyaux nécessite l’étude du réseau cortico-ganglion de la base dans son ensemble. Ce projet vise donc à tester l’hypothèse novatrice selon laquelle les ganglions de la base régulent la prise de décision et l’exécution de l’action en fournissant aux structures cérébrales, notamment corticales, responsables du choix de l’action un signal « énergisant » appelé urgence, permettant de choisir et d’agir au moment opportun et à la bonne vitesse. En soutient de cette hypothèse, une incapacité à décider au bon moment ou à agir avec la vitesse appropriée est caractéristique de nombreux troubles neuropsychiatriques et neurologiques basés sur un dysfonctionnement des ganglions de la base, tels que l’impulsivité, les troubles obsessionnels compulsifs ou la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux recevront un entrainement sur une tâche comportementale avec renforcement positif (pastilles sucrées ou recompenses liquides) dans une salle de test (EU 1/2). Lors de cet entrainement, les animaux pourront être amenés à suivre un protocole de controle de la motivation pour les encourager à réaliser les séances comportementales. Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. La durée de l'entrainement et du controle de la motivation associé dépendront de la capacité des animaux à apprendre à réaliser la tâche comportementale, mais n'excède généralement pas un an et demi. Les singes passeront également des IRM (EU 1/2) et des examen de tomodensitométrie (CT-scan) (EU 2/2) sous anesthésie générale. Nombre : 1 IRM & 3 CT par animal. Durée : IRM 1 heure, CT 30 min. Les singes passeront quatre chirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et le retrait de ces dispositifs (EU 1/2). Nombre : Tous les animaux. Durée : de 3 à 6 heures. En cas d'infection suspectée, des prélèvements sanguins seront effectués chez l'animal sous anesthésie afin d'évaluer son état immunologique. En outre, des prélèvements locaux pourraient être réalisés sur un animal vigile maintenu avec la tête fixe, si nécessaire, dans le but de caractériser les souches bactériennes responsables de l'infection et de déterminer le traitement antibiotique approprié. Les singes fourniront des enregistrements intracérébàraux lors des sessions d'enregistrements électrophysiologiques avec renforcement positif (jus de fruit) dans une salle de test (EU 1/2). Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. Pour la réalisation de ces enregistrements électrophysiologiques, les animaux seront habitués à un protocole de contrôle hydrique. La durée des enregistrements électrophysiologiques et du controle hydrique associé dépendront de la capacité des animaux à réaliser la tâche comportementale, et à notre capactité à collecter les données neurophysiologiques nécessaires pour répondre aux questions du projet. Nous anticipons une durée n'excédant pas une année et demi.

Impact sur les animaux

Durant la phase d'entraînement à la tâche comportementale, l'application d'un contrôle de la motivation (controle alimentaire ou hydrique) pour motiver les animaux à travailler peut occasionner un certain inconfort. Toutefois, les animaux comprennent rapidement que leur coopération et la réalisation de la tâche leur garantissent l'accès à leur ration journalière complète et des friandises en bonus. Concernant les acquisitions de données IRM ou CT-scan, réalisées sous anesthésie générale, un inconfort lié à l’anesthésie (fatigue, nausées, vomissements) peut survenir au réveil de l'animal mais il s'estompe rapidement. Pour ce qui est des interventions chirurgicales (i.e. l'implantation du plot de fixation de la tête et du dispositif d'enregistrements électrophysiologiques), des douleurs post-opératoires peuvent être présentes. Cependant, une médication appropriée, incluant des analgésiques, des anti-inflammatoires et des antibiotiques si nécessaires, est mise en place en collaboration avec le vétérinaire pour les minimiser.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Remplacement

Il est de nos jours impossible de recueillir les données nécessaires à la réalisation de ce projet à partir d'expériences qui n'impliqueraient pas les animaux, et les primates non humains en particulier. En comparaisons à d’autres espèces animales, les expériences menées chez le singe macaque présentent plus de pertinence pour la compréhension des fonctionnements et disfonctionnement de la cognition et de l’action humaine en raison des capacités cognitives et motrices de cet animal très proches de celles de l’humain, et des similarités structurelles du cerveau entre les deux espèces. Il est donc impossible de répondre à la question du remplacement dans ce projet.

Réduction

Pour des questions de robustesse et de reproductibilité des résultats, chaque question posée doit être abordée en fournissant des données complètes sur plusieurs animaux, selon la pratique habituelle en électrophysiologie sur primate non humain. Ce projet a été planifié afin de maximiser la quantité de données que l’on peut obtenir avec chaque animal et donc minimiser le nombre d'animaux nécessaires à cette étude. Plusieurs types de données seront collectées sur chaque animal : comportementales, psychophysiques, électrophysiologie musculaire et neuronale. De plus, la technique d’enregistrement neurophysiologique employée pour ce projet, technique largement utilisée par de nombreux laboratoires et ayant demontré son efficacité pour caractériser l'activité cérébrale, permettra de collecter de nombreuses données en un minimum de temps, réduisant ainsi le risque de recours à des animaux supplémentaires afin de guarantir la puissance statistique des résultats.

Raffinement

L’animalerie dans laquelle les animaux seront hébergés est spécialement étudiée pour favoriser le bienêtre animal. L'animalerie dispose de lumière naturelle, de distractions grâce aux vues sur l'activité humaine, de contacts sociaux, d'activités quotidiennes et un espace plus vaste dans lequel les animaux peuvent non seulement bouger mais aussi s'échapper comme ils le feraient dans la nature en cas de tension entre eux. Le contrôle de la motivation des animaux est choisi afin d’avoir le moins d’impact possible sur leur bien-être (mise en place progressive et individualisée du contrôle de la motivation, par contrôle alimentaire en priorité et hydrique en dernier recours). Dans tous les cas, les singes seront incités à coopérer et participer aux manipulations par le biais du renforcement positif. Les enregistrements électrophysiologiques sont conçus pour supprimer les gênes quotidiennes associées à ce type de procédure et les implants chirurgicaux seront fabriqués « sur mesure » pour diminuer les risques de complications post-chirurgicales. La pose de ces implants sera faite sous anesthésie générale et contrôle antidouleur permanent, en condition aseptique stricte. La chaise dans laquelle les singes effectueront la tâche est large et de type « ouverte », conçue pour que la contention soit minimale. Le matériel permettant de mesurer et enregistrer le mouvement des yeux et la taille de la pupille est basé sur l’analyse d’images vidéo et ne constitue donc aucune gêne pour l’animal. Des CT scan seront réalisés une fois que le singe sera implanté avec le dispositif d'enregistrements électrophysiologiques, dans le but de vérifier la position des électrodes en superposant ces images aux clichés d'IRM anatomique de l'animal. Lors des examens d’imageries, l'animal ainsi que ses paramètres physiologiques sont surveillés pendant toute la durée de l’examen. Cette procédure constitue un raffinement majeur, puisqu'elle permet d'éviter des analyses histologiques post-mortem et évite donc la mise à mort des animaux à la fin des procédures. Enfin, les implants chirurgicaux seront retirés à la fin de la procédure et les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Choix des espèces

Les expériences proposées dans ce projet reposent sur des questions qui peuvent seulement être résolues par des études chez le singe, et ce pour les raisons suivantes : La prise de décision entre actions et un comportement dit « interactif », qui nécessite souvent l’utilisation des bras et des mains guidés la vision pour atteindre et manipuler les objets qui nous entourent. Cette caractéristique exclue de fait le modèle rongeur (animaux se basant principalement sur l’olfaction pour l’exploration, comportement de transport des membres supérieurs et préhension pauvre) ainsi que les animaux plus anciens phylogénétiquement comme modèles préférentiels pour l’étude des bases neuronales de la prise de décision entre mouvements du bras dirigés vers un but. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte (le developpement du cerveau doit être complet).

Retenus pour la proximité de leur cerveau avec celui de l'humain, des macaques à longue queue sont utilisés à l'exclusion de toute autre espèce. 100 d'entre eux vont l'être sur cinq ans, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à dix prélèvements de sang en 48 heures, des ponctions de liquide céphalo-rachidien, trois heures d'imagerie sous anesthésie, une chirurgie intracérébrale de deux à quatre heures et jusqu'à six heures d'immobilisation en chaise de contention, l'évaluation de la sensibilité impliquant l'atteinte de seuils douloureux tactiles ou thermiques. Ils sont tués en fin de projet pour des analyses ex vivo, leurs organes pouvant ensuite être proposés à d'autres équipes de recherche.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, …) sont des affections du système nerveux caractérisées par la dégénérescence progressive des neurones, ce qui peut entraîner divers symptômes cognitifs, moteurs et sensoriels. Avant l’entrée des médicaments en phase clinique, il est important d’évaluer leur efficacité dans le traitement mais également l’absence d’effets secondaires chez l’animal. Le présent projet vise à tester pour ces pathologies de nouveaux candidats administrés chez le primate non-humain. Leur validation reposera sur deux approches : premièrement, une analyse permettant d'évaluer l'évolution temporelle de la distribution de ces molécules dans l'organisme; deuxièmement, une approche basée sur les changements entrainés par l’administration de ces agents dans la perception de la douleur (somesthésie), Ces approches auront recours à des prélèvements biologiques, tissulaire, de l’imagerie et pourront nécessiter une étape chirurgicale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques dans le cadre des maladies neurodégénératives permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de ces molécules sur les animaux est fondamental pour confirmer que celles-ci atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus sans effets secondaires notables. En effet certains traitements ont un impact sur la sensibilité générale (thermique, tactile, douleur …) Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouvel agent pharmacologique à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils pharmacologiques en évitant toute modification délétère de la somesthésie chez un modèle de grand animal.

Procédures

Les animaux sont soumis aux étapes suivantes : - Prélèvement sanguin (10 min), jusqu'à 10 fois en 48 heures, avec un volume maximum de 5 ml/kg par semaine, sur des animaux anesthésiés ou éveillés. - Prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) (10 min), avec un volume maximum de 1 ml par animal, sur des animaux anesthésiés. - Imagerie (3 heures) sur des animaux anesthésiés. - Chirurgie intracéérébrale (2 à 4 heures) sous anesthésie. - Traitement administré par voie générale, jusqu'à 2 fois par jour, sur des animaux éveillés. - Tâches en chaise pour la microdialyse (maximum 6 heures) et tests comportementaux (2 fois par semaine, maximum 60 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie (éventuelle), douleur possible. Pour l’évaluation de la somesthésie : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique de substances, atteinte de seuil douloureux (tactile ou thermique) Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’utilisation exclusive du PNH peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 2) Dans le cadre des modèles du traitement des maladies neurodégénératives, l’objectif à terme est de tester de nouvelles molécules, thérapies innovantes sur un modèle animal ayant des caractéristiques génétiques, immunologiques similaires associes a des comportements moteurs et cognitifs qui ne peuvent être étudiés sur des lignées cellulaires (humaines ou animales) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales, ici la somesthésie, et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 5 animaux maximum par étude, soit un total de 100 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 5 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Dans le cadre d’une étude de validation de composé innovant, la chirurgie peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, fourrage, etc.)." Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. L’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assuré par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. Enfin, ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité́ SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le primate non-humain a été retenu. Premièrement les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique. Deuxièmement le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du singe et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Stade Adulte afin de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.