Troubles nerveux

Quarante minutes de contention sur chaise à chaque administration, treize prélèvements sanguins par animal, et pour trois d'entre eux deux ponctions de liquide cérébrospinal sous anesthésie : 12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois fois par voie intraveineuse des ARN interférents couplés à un anticorps censé leur faire franchir la barrière hématoencéphalique, pour un développement industriel de transport de médicaments vers le cerveau. Le porteur reconnaît que les ponctions peuvent provoquer une infection post-opératoire, de la fièvre ou un œdème au point de piqûre, et annonce dans le même temps n'attendre aucun effet indésirable lié au produit testé. Le choix du macaque tient selon lui à sa proximité phylogénétique avec l'être humain, et celui de jeunes adultes au fait que des animaux plus âgés présenteraient des anomalies susceptibles d'altérer la qualité des échantillons prélevés après leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de trois molécules d'intérêts, conjugués à un même transporteur, passant la barrière hématoencéphalique chez le primate non humain dans le but de transporter des médicaments dans le système nerveux central. Le premier objectif est d’évaluer les structures qui sont ciblées dans le système nerveux central par les trois molécules d'intérêts. Le deuxième objectif est d’évaluer le devenir dans le sang des trois molécules d'intérêts couplées au transporteur avec deux méthodes différentes afin d’évaluer leur stabilité dans le sang. Le troisième objectif sera d’évaluer les concentrations dans le cerveau des trois molécules d'intérêts à la fin du projet. Enfin, le quatrième objectif sera d’évaluer le profil général de sécurité des molécules d'intérêts testées. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une molécule permettant le passage de médicaments directement dans le système nerveux central via une simple administration intraveineuse. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse (sédation en cas de besoin). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre chaque administration. Treize prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Deux prélèvements de liquide cérébrospinal par animal seront réalisés sur 3 animaux (sous anesthésie générale et analgésie). La chirurgie durera environ 1 heure (anesthésie et réveil compris) Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’environ 5 semaines entre les deux prélèvements. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront tout de même accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. D’après des études préliminaires réalisées sur le primate, nous n’attendons pas d’effet indésirable lié à l’élément d’essai sur ce projet. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de liquide cérébrospinal pourront provoquer des réactions locales au niveau des sites de ponction, une infection post-opératoire et/ou une réaction systémique de type fièvre. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort liés la mise à jeun, à l'induction et au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Enfin, le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) pourra provoquer un stress léger sur une courte période.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 12 primates réparties en 4 lots de 3. 4 lots car nous testons trois molécules différentes (une molécule par lot) et un lot contrôle en plus pour pouvoir comparer les résultats selon une base. Le fait d'avoir 3 animaux par lot permet d'avoir plus d'assurance en cas de résultats variables au sein d'un groupe. En effet, des résultats divergeant sur deux animaux sont difficiles à interpréter, trois animaux par groupe est donc le plus petit nombre possible qui permet cette approche de détermination égalitaire des résultats.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement.Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (exemple : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises (exemple : céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces molécules d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

La barrière qui protège le cerveau est ouverte par ultrasons focalisés, geste qui peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème visibles à l'imagerie. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après la dernière séance d'imagerie. Elles font l'aller-retour entre leur animalerie et une plateforme d'imagerie, reçoivent une molécule radioactive par voie intraveineuse et passent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie, d'une heure au maximum chacune, l'enjeu étant de mettre au point un traceur pour diagnostiquer plus tôt la maladie d'Alzheimer chez l'être humain. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque les souris sont anesthésiées pendant l'imagerie, et annonce des points limites "adaptés aux modèles" sans dire lesquels.

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.

Une sonde rectale introduite dix à quinze fois en trois à cinq heures, une hypothermie poussée jusqu'à 32 °C et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la queue attendent chaque souris de ce projet. 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole pour prélèvements de tissus et de sang. Le porteur décrit une technologie qu'il compare à un cheval de Troie, des molécules-médicaments détournant les mécanismes naturels de passage des barrières de l'organisme pour atteindre le cerveau. Il qualifie ces manipulations de précises et rapides et écrit que la procédure ne comporte "pas d'anesthésie, pas d'analgésie", tout en retenant comme point limite l'apparition d'une hypothermie irréversible.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administrations des conjugués : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations lors de l’euthanasie : 1 seul/individu. Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements n’excédant pas ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu) ou intrapéritonéale (dose unique), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individu, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 6 groupes par étude et 2 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 96 animaux par an (4 *6*2*2), soit un total de 384 souris sur 4 ans (96*4). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : Apparition d’une hypothermie irréversible (température

Choix des espèces

Nous réalisons en amont de nos procédures des tests in vitro. Ces tests permettent de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques qui conditionnent le succès de nos vecteurs. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons de réaliser nos expériences sur la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. La souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux et permettra une extrapolation plus pertinente au modèle humain. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun voyant ses pattes arrière immobilisées par un adhésif seize heures par jour, de la naissance au vingt-huitième jour. Les ratons sont séparés de leur mère cinq heures au douzième jour, certains sont ensuite soumis à une course forcée sur tapis roulant trente minutes par séance, trois jours par semaine pendant quatre semaines, d'autres à des vibrations du corps entier quinze jours de suite. Une injection de marqueur dans le muscle après ouverture de la peau, une étude électrophysiologique d'une heure trente et un prélèvement de sang par section du bout de la queue complètent le protocole, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur annonce des contremesures qui permettraient aux enfants alités ou atteints d'un trouble de la coordination un développement harmonieux, quand ce qui est acquis ici est l'immobilisation quotidienne de rats nouveau-nés.

Objectifs

Les premières années de la vie sont déterminantes pour le développement de l’enfant et de la santé de l’adulte qu’il deviendra, et elles programment sa santé future (cf. concept des « 1000 premiers jours » lancé par l’Unicef). La jeune enfance est donc une période critique du développement au cours de laquelle les individus vont développer les compétences motrices et cognitives essentielles pour leur existence. Or, certains enfants sont contraints à l’hypoactivité parce qu’ils sont alités (maladie, accident, paralysie cérébrale…). D’autres, qui souffrent d’un trouble développemental de la coordination, présentent des atypies sensorimotrices. L’hypoactivité ou les troubles moteurs précoces sont à l'origine d'un développement anormal et durable de l'organisation et des fonctions du système nerveux. Ils conduisent à des troubles cognitifs et à un risque accru d’émergence de maladies civilisationnelles à l’âge adulte (diabète, hypertension...). Les objectifs de ce projet sont 1/ de fournir des preuves d'une altération du dialogue muscle-cerveau dans les déficits neurodéveloppementaux induits par l'hypoactivité et 2/ dans une perspective translationnelle, de développer des stratégies innovantes pour restaurer un dialogue efficace et robuste entre le muscle et le cerveau afin de contrecarrer les déficits. L’étude sera réalisée sur un total de 1760 rats dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après les interventions. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des procédures éthiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension des effets de l’hypoactivité au cours du développement (enfance) et de proposer des contremesures efficaces pour permettre un développement sensorimoteur et cognitif harmonieux.

Procédures

- La procédure de restriction sensorimotrice consiste à immobiliser les pattes postérieures pendant 16h chaque jour, de la naissance à P28. La pose de l'adhésif chaque soir dure env 1 min et le retrait chaque matin 1-2 min. - Prise alimentaire : les ratons sont isolés de la mère pendant une durée de 5 heures le 12e jour postnatal. - L'analyse IRM est réalisée une seule fois et dure env. 1 heure, depuis l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie finale. - Les animaux du groupe "exercice" seront entrainés à marcher sur la tapis 10 minutes / jour, 5 jours consécutifs, puis seront soumis à une course sur tapis roulant pendant 30 min, 3 jours /semaine, 4 semaines consécutives. - Vibration corps entier : pendant 15 jours consécutifs, avec un maximum de 15 min / jour. - Avant l’euthanasie, une goutte de sang sera recueillie par section de la pointe de la queue pour mesures de paramètres sanguins au moyen de bandelettes. Cette procédure très rapide ne génère pas plus de douleur pour l’animal que, pour les personnes diabétiques, le fait de se piquer le bout du doigt pour obtenir une goutte de sang. En outre, une pommade anesthésique sera appliquée préalablement. - Injection de marqueur rétrograde dans le muscle : cette procédure, réalisée sous anesthésie, nécessite d'ouvrir la peau pour injecter une petite quantité de marqueur dans le muscle au moyen d'une aiguille très fine. L’animal recevra une injection d’analgésique. La durée totale de l’intervention n’excèdera pas 30 min. - Une étude électrophysiologique (réflexe H) et mécanique (propriétés contractiles) : le niveau d’anesthésie sera vérifié tout au long de la procédure, en veillant toujours à ce que l'animal ne présente aucun signe d'inconfort. La durée totale de l’ensemble de cette procédure est de l’ordre de 1h30. À la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et différents tissus seront alors prélevés. - tests comportementaux : réalisés chaque semaine pendant 2 mois. Ils sont répartis sur 5 jours consécutifs, l'ensemble des tests réalisés les 3 premiers jours n'excède pas 30 minutes / jour. Le 4e jour, le test de fatigue dure jusqu'à ce que l'animal refuse de courir. La durée est de l'ordre de 30 min à 1h. Le 5e jour, le test dure toute la nuit mais l'animal est laissé dans sa cage d'hébergement.

Impact sur les animaux

Pour les animaux du groupe RSM (soumis à une restriction sensorimotrice), la peau des pattes postérieures peut se trouver sensibilisée par l’application quotidienne d’adhésif médical. En outre, l’immobilisation peut induire des contractures musculaires. Lors du retrait du système d’immobilisation chaque matin, la peau est soigneusement inspectée et les mouvements de flexion et extension des pattes postérieures sont réalisés délicatement. L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant peut générer un stress et de possibles douleurs musculaires. Les animaux seront habitués à la course sur tapis roulant à faible vitesse pendant au minimum trois séances préalablement à l’exercice proprement dit. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.

Devenir

Les animaux des différents groupes expérimentaux seront mis à mort afin de prélever des tissus.

Remplacement

L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. La plupart des interventions sont non invasives et peuvent être réalisées sur les mêmes animaux. Toutefois, lors de l’euthanasie, deux types de perfusion différentes seront nécessaires pour prélever les tissus, ce qui oblige à prévoir deux lots d’animaux. En outre, pour éviter un effet éventuel de la portée (dû par exemple au comportement maternel), il faut diversifier les portées d’origine au sein d’un même groupe (par exemple, 10 animaux seront obligatoirement issus de 5 portées différentes au minimum).

Raffinement

Les rats seront hébergés en cage collective dans des condition de température et d’hydrométrie contrôlée avec une alimentation et un apport en eau à volonté. Ils bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. Les expérimentations et les prélèvements seront effectués dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d'hébergement. Des anesthésiques et antalgiques adaptés au protocole seront utilisés. Des points limites adaptés seront appliqués. Les animaux présentant au minimum un point limite seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les rats seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 3 mois, ce qui permettra d'étudier les conséquences chez le jeune adulte d'une restriction sensorimotrice subie au cours de l'enfance.

Tués parce que le retrait de la canule implantée dans leur crâne provoquerait des lésions incompatibles avec une vie dans de bonnes conditions, 1 000 rats et 500 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de une heure à une heure trente pour l'implantation de canules en profondeur, puis six à sept heures relié par des câbles à une seringue et à un collecteur, dans un espace restreint, séance qui peut être répétée une seconde fois à deux ou trois jours d'intervalle. Des candidats médicaments leur sont administrés en bolus, en une fois ou chaque jour pendant une semaine, pour mesurer leur effet sur des neurotransmetteurs. Le porteur indique que les modèles alternatifs développés au laboratoire ne mesurent que certaines molécules sécrétées par des cultures de neurones, et que le choix entre rat et souris dépend aussi de la quantité de molécule disponible.

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines maladies psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser des substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ou l’espérance de vie des patients atteints de maladies psychiatriques ou neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le rongeur.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. La phase de collecte des échantillons est en général de l'ordre de 6 à 7 h (animal connecté en permanence pour la collecte de dialysat) et peut être répétée maximum 2 fois à intervalles de 2 à 3 jours. Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique (une administration par jour sur une durée de 7 jours maximum).

Impact sur les animaux

La phase d'anesthésie peut induire un léger stress. Des douleurs peuvent être liées à l'implantation du ou des guides canules au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Il n'est pas attendu d'effets néfastes suite à l'administration d'un candidat médicament. Pendant le test, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène, sur plusieurs heures dans un espace restreint. Les cables sont légers mais limitent le déplacement de l'animal pendant toute la durée du test ce qui peut générer un stress chez l'animal.

Devenir

Les rongeurs seront mis à mort à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisés, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait du guide canule implanté pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux. Les tests qui seront appliqués ne sont pas encore complétement définis car la technique d'analyse des dialysats est toujours en cours de développement (bien que la partie in vivo chez le rongeur soit mise en place). Des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des essais ont été réalisés pour tester le même animal à deux reprises et limiter le nombre d'animaux utilisés. Cependant, les animaux ne pourront pas être utilisés plus de deux fois pour garantir une diffusion homogène des molécules entre deux tests. Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour la phase chirugicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une solution analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Les animaux sont maintenus en 2 par 2 pendant toute la durée de l'étude (excepté la phase de test), avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalables réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Les voies métaboliques peuvent également être différentes entre les espèces, les spécificités de chaque candidat médicament peuvent amener à choisir une espèce plutôt que l'autre. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

Des administrations répétées, jusqu'à deux par jour pendant quatre semaines, précèdent des tests de douleur sur 3 600 souris et 2 400 rats. Ces 6 000 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 5 500 sont tués et 500 pourront être réutilisés dans d'autres projets s'ils n'ont reçu que les traitements contrôles. Les voies d'administration vont de l'orale à l'intradermique, et chaque animal est isolé de ses congénères jusqu'à soixante minutes pour les phases de test, d'habituation ou de récupération. Le porteur annonce des modèles comportementaux censés reproduire chez le rongeur le symptôme de la douleur humaine, et des tests provoquant des douleurs de moins de trente secondes, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

La douleur est une expérience complexe, sensorielle et émotionnelle, aigue ou chronique, mettant en jeu des récepteurs et nerfs présents dans tout l’organisme ainsi que des régions cérébrale spécifiques. Indépendamment de la cause, la douleur doit être prise en charge afin de soulager le patient avec des traitements qui reposent essentiellement sur les médicaments antalgiques (3 niveaux en fonction de l’intensité de la douleur incluant le paracétamol, la codéine, la morphine). D’autres substances peuvent aussi être utilisées telles que les anesthésiques locaux, des antispasmodiques, des antidépresseurs ou encore des relaxants musculaires. Mais ces traitements symptomatiques peuvent entrainer des effets indésirables selon les substances utilisées : nausées, somnolence, dépendance… Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouvelles entités pharmacologiques synthétisées ou acquises au sein du laboratoire dans des modèles comportementaux chez le rongeur permettant de mimer le symptôme la douleur chez l’homme. Ce projet implique l’obtention de données comportementales chez l'animal nécessaires pour envisager la poursuite du développement de produits pharmacologiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données chez l'animal l’efficacité potentielle de nouvelles entités pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer la capacité de nouvelles molécules à moduler les symptômes de la douleur chez le rongeur, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique choisie. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l'Homme.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, intra-veineuse, intra-musculaire, sous-cutanée ou intra dermique ) , la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas pas plus de 2 administrations/jour) ainsi que la durée (période maximale de 4 semaines) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés/inducteurs avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (

Devenir

Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles de la procédure 1, pourront cependant être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur le symptôme de la douleur dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, la souris et le rat étant ici les espèces les plus adaptées.

Réduction

Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…) ou isolés de leurs congénères pour les tests lors de périodes les plus courtes possibles (moins de 60 min) selon les besoins de la procédure. Le change des cages se fait 1 à 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour, et font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).

Choix des espèces

Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur la douleur. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de douleur décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.  

Deux heures d'anesthésie générale par séance d'imagerie TEP, et jusqu'à deux transports de quarante-cinq minutes entre deux établissements : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur de thérapie génique par injection intraveineuse rétro-orbitale, geste auquel le porteur associe un risque rare d'hémorragie, d'atteinte oculaire ou d'infection, puis un radiotraceur en perfusion, puis un prélèvement de sang. Toutes sont tuées à la fin, les analyses histologiques et biochimiques d'efficacité se faisant post mortem. Le porteur utilise deux lignées génétiquement modifiées à partir de douze mois, âge auquel leur cerveau présente les lésions de la maladie d'Alzheimer, et les suit sept semaines.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique et valider un biomarqueur d’imagerie nucléaire chez deux lignées de souris génétiquement modifiées, modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera sur 2 sites (EU 1/2 et 2/2) pour l'accès au système d'imagerie spécifique et les competences liées à cette imagerie qui ne sont disponible que dans le second établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle thérapie génique pour la maladie d’Alzheimer et de valider un biomarqueur d’imagerie pour le suivi de cette pathologie chez deux modèles souris de cette pathologie. Si le projet permet de confirmer la pertinence de ce biomarqueur, celui-ci pourrait potentiellement être utilisé en clinique Humaine pour le diagnostic ou le suivi de plusieurs maladies neurodégénératives. De plus, si l’efficacité de l’une des thérapies testées est avérée cela pourrait permettre de proposer des essais cliniques chez l’Homme, et donc à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladie d’Alzheimer, pathologie pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif et qui touche près de 900 000 personnes rien qu’en France.

Procédures

Une partie des animaux recevront une injection intraveineuse (durée 5 min) sous anesthésie générale (EU1/2). Ils seront ensuite transportés entre deux établissements utilisateurs par un transporteur agréé (45 minutes maximum, 2 fois maximum). Ils réaliseront une procédure d’imagerie par tomographie par émission de positrons (EU2/2) sous anesthésie générale, (durée 2 heures) durant laquelle une injection intraveineuse d’un produit nécessaire à l’imagerie (radiotraceur) sera réalisée en perfusion pendant 2 minutes (EU2/2). Cet examen pourrait être réalisé une 2ème fois (maximum) si l’on rencontrait un problème avec le radiotraceur lors de la première imagerie. Un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux sous anesthésie générale (EU1/2, 1 fois, durée 2 minutes). Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure (EU1/2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont (dans l’EU1 sur 2) : un risque modéré cardio-respiratoire et hypothermique durant les anesthésies; un léger stress lors des anesthésies générales; une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite aux Injections intrapéritonéales, une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite aux Injections intraveineuses rétro-orbitale du vecteur viral (durée 5 mn, sous anesthésie générale). Il existe un risque rare d’hémorragie, d’atteinte oculaire ou d’infection suite à cette injection intraveineuse. enfin, une légère douleur au point de prélèvements lors de la prise de sang (durée 5mn, sous anesthésie générale) et un stress lié au transport entre les 2 établissements utilisateurs et au changement d’environnement. Dans l’EU 2 sur 2, les effets indésirables sont une légère douleur liée à l’injection intraveineuse du ligand radioactif; un risque modéré cardio-respiratoire et hypothermique durant les anesthésies. De plus, lors du réveil les animaux peuvent être désorientés et stressés. Et enfin, un stress faible de l’animal lors des contentions tout au long de nos expériences.

Devenir

Tous les animaux injectés avec la thérapie génique à évaluer et leurs contrôles seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité.

Remplacement

Le projet vise à valider une thérapie génique pour la maladie d’Alzheimer, incurable à l’heure actuelle chez l’Homme, mais aussi à valider in vivo un biomarqueur permettant de suivre ou diagnostiquer la maladie. Les modèles in vitro (modèles de cellules de neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de notre approche de thérapie génique ; elle nécessite à présent d’être validée dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent dans notre cas puisque des modèles de la maladie d’Alzheimer associés à la mutation génétique que nous voulons cibler ont été créés chez cette espèce.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 20 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Nous utiliserons deux lignées de souris génétiquement modifiées mais dans un souci de réduction nous utiliserons un seul groupe contrôle de souris non génétiquement modifiées pour ces deux lignées pour l’évaluation de la thérapie génique d’intérêt. Nous prévoyons au cours du projet un nombre total maximal de 120 souris. De façon générale nos résultats seront analysés statistiquement avec les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture (adaptée à leur stade physiologie) à volonté et ils bénéficieront d’un enrichissement réglementaire. En cours de procédure une attention particulière est portée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne, la mise en place de points limites et de soins adaptés Les animaux seront hébergés en groupe, en cas d’agressivité les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge), dans ce cas, on lui rajoute une maisonnette dans sa cage en plus des enrichissements habituels. Nous incluons dans notre étape d’injection uniquement des animaux qui font plus de 20g pour une meilleure récupération des animaux à l'anesthésie et à l'intervention, avec la mise en place de gel ophtalmique et la prévention de l’hypothermie en plaçant les souris sur un tapis chauffant. Un suivi rapproché est effectué au réveil. Les transports entre les 2 établissements seront réalisés par un transporteur agrée et dans des conditions contrôlées. Une phase d'acclimatation sera respectée avant toute manipulation dans le deuxième établissement. Les injections intraveineuses et la prise de sang seront réalisées sous anesthésie pour éviter le stress des animaux. Nous injectons un sédatif avant l’euthanasie pour éviter la douleur de l’injection et obtenir une pré-sédation. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour notre projet, nous avons besoin d’un modèle de la pathologie afin d’étudier les effets de notre thérapie génique sur la cible d’intérêt, et pouvoir évaluer notre biomarqueur d’imagerie dans le cadre de la maladie d’Alzheimer. De nombreux modèles de souris génétiquement modifiés ont déjà été mis au point, et deux modèles d’intérêts ont été sélectionnés pour notre projet. Les animaux utilisés pour l’évaluation de notre thérapie génique et de notre biomarqueur seront utilisés à partir de l’âge de 12 mois car il s’agit de l’âge où ils présentent des signes de la pathologie (au niveau du tissus du cerveau). Ils seront ensuite suivis 7 semaines pour l’évaluation de notre approche thérapeutique.

Des ultrasons focalisés ouvrent temporairement la barrière qui protège le cerveau de 36 souris, le temps d'y faire entrer une molécule radioactive. Ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, pour que soient recherchées les conséquences des ultrasons et la distribution du produit dans leur cerveau. Chacune fait l'aller-retour entre deux animaleries, subit une IRM de contrôle, reçoit le traceur par voie intraveineuse et enchaîne jusqu'à huit séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur signale que l'ouverture par ultrasons peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème, écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu sur les animaux, et limite le projet aux expériences qu'il juge "absolument indispensables".

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.

Une chirurgie de trente à quarante minutes déclenche l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cerveau de 60 souris adultes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent des injections sous la peau cinq jours par semaine pendant deux à quatre semaines selon les groupes, et une pesée hebdomadaire. Le peptide testé doit franchir la barrière hémato-encéphalique et bloquer l'agrégation de la protéine, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives" à l'expérimentation animale pour en démontrer l'efficacité et l'innocuité. Toutes sont tuées à la fin, par thoracotomie et perfusion intracardiaque destinées à fixer les tissus avant analyse.

Objectifs

La plupart des molécules destinées à la thérapie de maladies neurodégénératives qui ont une efficacité in vivo n'atteignent pas leurs cibles parce qu'elles sont incapables de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège le cerveau chez les vertébrés et même les invertébrés. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au système nerveux central (SNC) est l'utilisation de peptides qui traversent la BHE. Ces peptides sont capables d'améliorer le passage des composés à travers la BHE sans en altérer l'intégrité. Ils sont économiques, chimiquement polyvalents et non immunogènes selon des résultats déjà obtenus chez la souris saine. De plus, ces peptides combinent un ciblage sélectif et spécifique. Ils sont mieux adaptés que les petites molécules, ils présentent une faible toxicité et sont moins enclins à générer des mécanismes de résistance aux médicaments administrés de façon quotidienne à long terme. La maladie de Parkinson est reconnue comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette pathologie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans. La prévalence de la maladie augmente avec l'âge. Le coût économique direct et indirect estimé par patient tourne autour de 100.000 euros. Les traitements existants ne sont pas curatifs et ont des effets secondaires importants. Il s'agit donc d'une pathologie qui nécessite de développer des nouvelles approches thérapeutiques. La thérapie ici proposée utilise les dernières avancées en termes d’ingénierie peptidique pour permettre une pénétrance de la BHE optimisée, et combine cela à une stratégie d’arrêt d’accumulation de la protéine alpha-synucléine qui est clé dans le développement de la maladie de Parkinson. On testera ainsi l’effet protecteur de peptides anti-agrégation d’alpha-synucléine embarqués dans une navette qui les aide à traverser le BHE et arriver au cerveau de la souris parkinsonienne après avoir été injectés sous la peau.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour soigner la maladie de Parkinson, les traitements non-invasifs actuels ne traitent que les symptômes et ont, à terme, des effets secondaires assez importants, menant certains patients à arrêter le traitement. C’est pour cette raison que des nouvelles thérapies non-invasives sont toujours nécessaires. Le traitement que nous proposons est un peptide thérapeutique qui bloque l’interaction entre deux protéines dérégulées dans cette pathologie, une phosphatase et une kinase, et empêche ainsi l’accumulation pathologique d’alpha-synucléine. Ceci devrait conduire à une modification significative de la progression de la maladie de Parkinson si le traitement est administré précocement après le diagnostic.

Procédures

Les souris adultes seront sujettes à une seule procédure chirurgicale (30-40min) pour induire l’accumulation d’alpha-synucléine dans le cerveau, puis à un traitement par administration du médicament 5 jours par semaine (5min/jour) pendant 2 ou 4 semaines selon les groupes expérimentaux. Les souris seront pesées toutes les semaines. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.

Impact sur les animaux

Délivrer l’alpha-synucléine dans le cerveau nécessite une chirurgie ce qui peut entrainer une douleur modérée et transitoire péri-opératoire. Le traitement par injection sous la peau journalière pendant 2 à 4 semaines peut entrainer également un stress de manipulation/contention de l’animal. Une pesée hebdomadaire sera effectuée pour contrôler la normalité de la courbe de poids tout au long de l’expérience.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour d’alternatives à l’expérimentation animale pour faire la preuve de concept d’efficacité et sécurité de notre thérapie/peptide. Il est nécessaire de prouver une efficacité de passage de la BHE en conditions physiologiques chez le modèle animal rongeur puis une bonne distribution dans les régions ciblées dans le cerveau. De même, la démonstration de l’innocuité du traitement impose la présence d’un système immunitaire fonctionnel ce qui est absente dans les cultures cellulaires. Cela justifie donc l’utilisation des modèles murins.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu de la variabilité de la technique d’analyse prévue (histologie). Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences similaires menées dans le laboratoire.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés qui vont du soutien nutritionnel adapté à l’administration de médicaments. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Le protocole d’anesthésie et d’analgésie de la procédure chirurgicale a été défini et validé par une équipe vétérinaire et est implémenté en routine dans le laboratoire avec des résultats satisfaisants. Les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation à l’arrivée dans l’animalerie, de récupération après chirurgie et d’adaptation à la manipulation pour traitement quotidien qui ont pour objectif de garantir des conditions physiologiques et d’assurer un minimum de souffrance et stress pendant le protocole. La surveillance rapprochée et la mise en place de points limites (et de points d’alerte en amont des points limites) permettent d’évaluer une perte de poids, une infection, un changement de comportement en lien avec une douleur/ nuisance liée aux interventions.

Choix des espèces

Les régions les plus touchées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson sont la substance noire, où résident les noyaux des neurones dopaminergiques, et le striatum où se trouvent leurs terminaisons. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones ciblés dans leur environnement cérébral complexe. De la même façon, les peptides utilisés dans ce projet doivent traverser une BHE, ce qui est difficilement atteignable sur des cultures cellulaires. La maladie de Parkinson est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Pour cette raison, les animaux utilisés dans le protocole seront des animaux adultes avant le début de l’induction de l’agrégation d’alpha-synucléine et du traitement pour réduire ou empêcher son agrégation. De plus, l’innocuité du traitement et l’efficacité de passage à travers la BHE nécessite une physiopathologie adulte pour augmenter la fiabilité de la prédiction des résultats chez l’homme.