Troubles nerveux

Injectées avec un agent neurotoxique de la famille des organophosphorés, rasées et épilées à la crème sur le crâne, 480 souris Swiss subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par perfusion terminale. 192 d'entre elles reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir leur barrière hémato-encéphalique, geste qui peut provoquer un œdème cérébral local ou une pétéchie hémorragique en cas de surdose. Les séances d'imagerie durent jusqu'à deux heures sous anesthésie gazeuse, précédées d'un jeûne de six heures. Le porteur annonce deux à quatre tests comportementaux par animal, variables selon les temps de l'étude, sans préciser lesquels.

Objectifs

Les composés organophosphorés (OP) tels que les agents neurotoxiques de guerre (NOP) comme le sarin, ou certains produits phytosanitaires (pesticides) (OPP), constituent une menace actuelle pour les populations militaire et civile. Si des intoxications à fortes doses constituent toujours une menace (attaque terroriste), l’exposition de manière unique ou répétée à un agent neurotoxique à des doses asymptomatiques (terrains de guerre, épandage de pesticides…) est une réalité permanente. Les effets des doses plus faibles, peu symptomatiques voire asymptomatiques, sont peu étudiées. Pourtant, des troubles comportementaux persistants à très long-terme sont observés après une exposition unique à une dose asymptomatique d’OP chez l’animal. Mais des déficits cognitifs et neuropathiques ont également été observés chez des victimes humaines exposées à de faibles doses. En conséquence, il existe un besoin de biomarqueurs d'exposition permettant i) un diagnostic précoce présymptomatique et ii) l'évaluation et/ou le traitement des intoxications par des agents neurotoxiques sur une longue période. La barrière hémato-encéphalique (BHE) représente la principale surface d’échange entre la circulation sanguine et le tissu cérébral. L’atteinte de la BHE et son rôle sur la neurotoxicité suite à une intoxication aux OP reste mal connue. Des perturbations cérébrales suite à une exposition aux OP sont connus et peuvent avoir des effets importants sur la BHE. Il est donc très probable que son intégrité, sa capacité à transporter des molécules entre le sang et le tissu cérébral et son activation soient impactées. La BHE constitue une cible diagnostique intéressante et restaurer ses fonctions une stratégie thérapeutique potentielle originale. L’objectif du projet est d’étudier les propriétés d’intégrité, de transport et d’activation de BHE suite à une exposition aux agents neurotoxique et de les évaluer comme biomarqueur pour la détection et la prédiction des atteintes cérébrales. Cela permettra d’évaluer des stratégies thérapeutiques originales visant à tirer parti de l’atteinte de la BHE, i) soit en restaurant les propriétés physiologiques de la BHE en injectant différents médicaments, ii) soit en permettant le passage cérébral d’un antidote, grâce à la technologie des ultrasons focalisés (FUS). Cette technologie consiste à injecter dans le sang des microbulles gazeuses qui sous l’action locale et brève d’ultrasons focalisés rendent la BHE transitoirement perméable.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer chez l’animal i) des biomarqueurs d’imagerie potentiels pour un diagnostic précoce pré-symptomatique et ii) un suivi thérapeutique ultérieur des intoxications par les agents neurotoxiques et les composés apparentés avec un potentiel de transférer ces biomarqueurs chez l’homme.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Intoxication à un agent neurotoxique (ou solution contrôle) par injection (temps d’injection 10 secondes) suivi par une étude comportementale d’observation (durée 1 heure) pour déterminer les signes d’intoxication. L’injection et l’étude comportementale d’observation ne seront réalisées qu’une seule fois (tous les animaux). • Mise à jeun max 6h avant l’imagerie (seulement les animaux dont les radiotraceurs le demandent ) • Réalisation des tests comportementaux, les tests varient selon les points temporels de l’étude (durée 10 minutes maximum ; 2 à 4 tests max par animal) et des sessions d’imagerie à baseline puis différents temps post-intoxication (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; tous les animaux) • Thérapie par injection de médicament (1 injection du médicament durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes ; ) • Thérapie par ultrasons (ouverture de la BHE plus 1 injection de médicament) sous anesthésie gazeuse, durée 10 minutes ; 192 animaux). Perfusion terminale sous analgésie et anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables Lors des expériences d’intoxication : • Les animaux peuvent être stressés lors des injections. De plus, l’injection de l’agent neurotoxique ou du traitement par le médicament antidotique peut induire une douleur (moins de 5 minutes). • Les animaux seront exposés à une dose sous-létale asymptomatique du de l’agent neurotoxique qui entraine une intoxication de faible sévérité. Ces effets apparaissent dans la première heure post-intoxication. Une surveillance jusqu’à 6 heures post-intoxication est mise en place pour assurer le bien-être des animaux intoxiqués. Lors des expériences d’imagerie : • Les animaux seront endormis lors des sessions d’imagerie (2h maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientées et stressées. • Une mise à jeun des animaux 6h avant l’imagerie TEP peut entrainer une perte de poids < à 5%. Lors des expériences ultrasonore (US) : • Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou de pétéchie hémorragique. La technique des ultrasons focalisés est bien maitrisée au sein du laboratoire, le risque de surdose ultrasonore est donc très faible. • L’injection des microbulles et médicaments en intraveineux peut induire une courte douleur (moins de 5 min). • Les animaux seront rasés et épilés (par application d’une crème dépilatoire) sur la tête pour permettre la transmission des ultrasons. Cet acte peut causer une légère irritation cutanée, résultat d’une réaction inflammatoire limité à la zone de contact.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever certains organes et d’étudier ex vivo certains paramètres et de les confronter aux données en imagerie.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode alternative permettant d'étudier de manière intégrée la réponse du système nerveux central et périphérique à un agent neurotoxique. Par conséquent, l'étude des propriétés d'intégrité, de transport et d'activation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) après une intoxication au NOP ne peut être réalisée qu'in vivo. En ce qui concerne l’ouverture de le BHE des études in vitro (sur fantôme et culture cellulaire) ont été réalisées pour affiner les paramètres ultrasonores, caractériser les agents ultrasonores utilisés pour ouvrir la BHE et limiter le nombre d’expériences in vivo en amont de ce projet. Cependant, l’ouverture de la BHE en tant qu’approche thérapeutique après intoxication d’un agent neurotoxique nécessite l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

L’utilisation de l’imagerie en longitudinal permettra de réduire le nombre d’animaux. Un même animal passera plusieurs examens d’imagerie en absence ou présence d’un traitement ce qui réduit le nombre d’animaux. L’approche statistique envisagée devrait permettre la comparaison de quatre conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable localisé et dépendant du temps. L'expérience a montré que les tests comportementaux sont les données qui présentent la plus grande variance. Par conséquent, le calcul de puissance est effectué pour les tests de comportementaux. Nous souhaitons être capables de discriminer une taille d'effet de l'ordre de 25% alors même que l'écart-type attendu est lui aussi de l'ordre de 25%. Nos calculs nous amènent à considérer qu’un nombre de 480 animaux répartis en groupes de 24 est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation est prévue après accueil des animaux dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés en groupe dans une cage avec accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Ils bénéficieront d’un milieu enrichi (matériel de nidification, tunnel, batônnets de bois). L’hébergement individuel des animaux sera limité au maximum afin de minimiser leur angoisse. Les animaux seront hebergés en individuel pendant la 1ère heure suivant l’intoxication afin de suivre l’évaluation de l’intensité de l’intoxication, puis remis en cage avec leurs congénères. Une surveillance journalière des souris pendant une semaine sera réalisée à la suite de l’intoxication notamment en se basant sur une grille d’évaluation préalablement établie Des points limites ont été déterminés en s’appuyant sur les scores de la grille d’évaluation. Tous les examens d’imagerie ou traitements thérapeutiques (ouverture BHE, injections de microbulles et/ou de médicaments) seront réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. L’animal sera maintenu sous un dispositif chauffant (tapis, lumière ou flux d’air) pour assurer son bien-être lors des manipulations. Certains radiotraceurs ou médicaments pourront également être administrés par voie intrapéritonéale, ce qui permet une injection rapide chez l’animal éveillé et réduit ainsi la nécessité d’une anesthésie. Lors des examens d’imagerie des larmes artificielles seront appliquées pour éviter le dessèchement de la cornée. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Un suivi quotidien par les zootechniciens et les expérimentateurs sera pratiqué. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.

Choix des espèces

Les expériences se feront sur la souris Swiss. Cette souche a permis la mise au point de récents modèles d’intoxication aux agents neurotoxiques. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes âgés de 9 semaines au moment de l’intoxication, poids de 38-43g. Cet âge correspond aux précédents modèles développés et utilisés dans les laboratoires partenaires sur ce projet, mais il offre surtout la plus grande fenêtre de temps dans une population adulte pour mener des études sur les changements possibles (troubles cognitifs, caractéristiques de la BHE) à long terme et suite à un traitement. De plus, cette souche également utilisée dans notre laboratoire a permis la mise en évidence des désordres métaboliques sur le modèle d’exposition à un agent neurotoxique suivi par imagerie TEP. L’utilisation du même stade de développement nous permet ainsi de pouvoir comparer nos données et évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement avec nos résultats précédents et ceux obtenus par les autres partenaires.

Injectés à trois mois d'âge par voie intraveineuse, mis à jeun douze heures avant chaque anesthésie, ponctionnés du liquide céphalo-rachidien six à neuf fois, passés quatre à cinq fois à l'IRM pendant une heure trente et sous immunosuppresseur oral pendant toute l'étude : quatorze chiens porteurs d'une mutation reproduisant la maladie de San Filippo A vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le traitement immunosuppresseur peut provoquer diarrhées, vomissements, atteintes cutanées et sanguines, prises en charge par un traitement symptomatique. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des injections, des prises de sang ni des ponctions de liquide céphalo-rachidien. Trois ou neuf mois après l'injection, les quatorze chiens sont tués pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La Mucopolysaccharidose de type IIIA (MPS3A), ou maladie de San Filippo A, est une maladie rare dite de surcharge, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances en Europe. La maladie survient lorsque des enzymes nécessaires à la dégradation et au stockage de molécules de sucres complexes font défaut à l'organisme : ainsi ce déficit engendre une accumulation toxique de ces molécules dans de nombreux organes dont le foie, la rate et surtout le cerveau. La maladie de San Filippo A est caractérisée par une atteinte sévère du Système Nerveux Central qui débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère. Dans la phase finale les patients deviennent grabataires et développent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire avec une espérance de vie de l'ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Le produit de thérapie génique que nous souhaitons tester vise à corriger le déficit de l'enzyme à l'origine de la maladie. L'objectif principal de ce projet est de réaliser une étude de biodistribution, d'efficacité et d'évaluation de la tolérance chez le modèle animal du chien MPS3A après administration par injection intraveineuse du produit de thérapie génique, sur un suivi de 3 mois et de 9 mois post-injection.

Bénéfices attendus

Le syndrome de San Filippo A, MPS3A, est la conséquence d'une accumulation de molécules du sucre, partiellement dégradées, dans les tissus de l'organisme. Ceci est le fait d'une mutation génétique qui affecte l'activité d'une enzyme nécessaire pour cette dégradation. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Chez l'Homme, ils apparaissent habituellement avant l'âge de 3 ans. Par la suite, l'atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d'autonomie vers l'âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 15 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l'efficacité des produits thérapeutiques, études de dose...). Le présent projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement de thérapie génique sur des chiens atteints de la maladie. C'est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques, mais aussi la tolérance globale de l'approche avec le suivi par imagerie par résonnance magnétique, et des bilans sanguins réguliers. Le but global de l'étude est de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez des patients souffrant de la maladie de San Filippo.

Procédures

Chaque animal inclus dans cette étude sera soumis aux interventions suivantes : Procédure d'injection intraveineuse : Effectuée sur animal vigile ou sédaté (si besoin). Durée de l'intervention : environ 30 minutes. Prélèvements sanguins : Effectués soit vigiles sous légère contention (animaux sociabilisés et habitués aux manipulations), soit sous anesthésie (anesthésie destinée à une imagerie par résonance magnétique ou prise de sang). Total de 6 prélèvements sanguins pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 5 minutes. Prélèvements de liquide céphalo-rachidien : Effectués par ponction, réalisés par des vétérinaires spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Total de 6 prélèvements pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 10-15 minutes. Imagerie par résonance magnétique : Effectuée sous anesthésie générale et analgésie. Total de 4 examens pour les animaux suivis 3 mois, et 5 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 1h30. Traitement immunosuppresseur : Administré par voie orale tout au long de l'étude. Durée de l’acte : environ 1 minute.

Impact sur les animaux

L'injection du vecteur thérapeutique par voie intraveineuse et les prélèvements sanguins sont des gestes peu invasifs pour lesquels aucun effet indésirable n'est attendu. Ces 2 actes seront réalisés sur animal vigile, sauf si une anesthésie est déjà prévue pour les autres gestes. Il est à noter qu’un jeûne d’une durée maximale de 12 heures sera mis en place avant leur anesthésie. Une nausée pourrait survenir dans les heures suivant l’anesthésie, cependant il est important de noter que les injections n’auront aucun impact sur leur consommation alimentaire ou hydrique. Avec ce protocole et par les expériences passées, il n'est pas attendu de réaction douloureuse. Les tests d’imagerie, examens non invasifs, seront réalisées sur les animaux anesthésiés. Les ponctions du liquide céphalo-rachidien seront réalisées par des vétérinaires spécialistes maitrisant ce geste technique sous anesthésie générale et analgésie adaptées. Il n'est pas attendu d'effet indésirable. Afin de limiter toute réaction inflammatoire au moment des injections du produit thérapeutique, un protocole d’immunosuppression sera mis en place tout au long de l'étude. Des effets secondaires d'ordre digestif tel que diarrhée et vomissements peuvent parfois être observés ainsi que des atteintes cutanées et hématologiques. Un traitement symptomatique pourra alors être mis en place avec un suivi rapproché des animaux concernés. Le phénotype ne devient dommageable qu'après 18 mois d’âge, voire après. L'évolution de la maladie est très lente. Si le phénotype se déclarait, il restera léger au vu de la période de suivi des animaux. De plus des examens cliniques et spécifiques sont prévus régulièrement et permettront d'adapter les soins.

Devenir

Les 14 animaux inclus dans ce projet seront suivis pendant une période de 3 ou 9 mois post-injection du produit thérapeutique, puis euthanasiés pour permettre le prélèvement de tissus post-mortem. La fin de protocole et euthanasie de tous les animaux est indispensable pour obtenir ces prélèvements, nécessaires à la réalisation des analyses moléculaires et histologiques prévues dans le cadre du projet. Ces analyses ne peuvent être effectuées sur des animaux vivants.

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaires pour une demande d'essai clinique de phase I/Il pour lesquelles l'utilisation d'un modèle gros animal, permettant la mise en place d'approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l'essai clinique est indispensable et nécessite donc l'utilisation de cette lignée de chiens MPS3A. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour tester l'effet d'un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l'efficacité du transfert du gène dans une lignée cellulaire in vitro n'est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L'animal est le seul organisme vivant permettant d'étudier l'impact d'un transfert du gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d'administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d'un modèle animal, d’autant plus un chien MPS3A, est donc essentielle pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type 3A.

Réduction

Un total maximum de 14 animaux sera utilisé comprenant : 3 animaux injectés avec du véhicule (2 euthanasiés 3 mois post injection et le troisième euthanasié 9 mois post injection), 9 animaux recevant l’administration du vecteur dont 6 euthanasiés à 3 mois post injection et 3 euthanasiés à 9 mois post injection, et 2 animaux non injectés (un suivi 3 mois et un suivi 9 mois). Ce nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience de précédents projets et des données sur les autres modèles, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Une analyse statistique sera réalisée pour les mesures où le nombre d'échantillons permettra d'avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, et sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). Cet enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. 2. Un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 3. Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre rapidement en place une action, une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d'arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l'aide de mesures comme un traitement adapté ou une mise à mort anticipée. 4. La mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire, antibiothérapie, immunosuppressions, etc.). De plus, le nombre d'anesthésies sera minimisé en regroupant les procédures (prise de sang - volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire, ponction du liquide céphalo-rachidien ) au sein d'une même anesthésie.

Choix des espèces

Le choix du chien comme modèle d'étude (mix beagle et Zealand Huntaway) est basé sur la prédisposition raciale à la même mutation génétique chez l'homme lors de la Mucopolysaccharidose de type III A. Chez le chien, une anomalie génétique conduit comme chez l'homme au développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs. De plus la transmission génétique est la même que chez l'homme en étant autosomale récessive. Le choix de l'espèce est également basé sur son homologie avec l'homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Dans l'étude clinique, les enfants seront traités entre 4 et 12 mois. Les animaux seront injectés à l'âge de 3 mois et 15 mois. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles" ou « jeunes adultes », et mimant donc le stade auquel des patients atteints du syndrome de San Filippo pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants de moins de 5 ans).

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Implantées dans le crâne après une heure de neurochirurgie, 360 souris reçoivent des stimulations électriques intracérébrales une à deux fois par semaine, sur animal éveillé, pendant des sessions allant jusqu'à quarante minutes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à dix injections et vingt prélèvements de sang par animal, et sont hébergées derrière un séparateur qui les isole physiquement de leur congénère pour protéger le système d'enregistrement. Le porteur qualifie l'intensité des stimulations de faible et n'attend une réaction comportementale que dans de rares cas, tout en prévoyant l'administration immédiate de kétamine et de diazépam en cas de crise épileptique. Les dispositifs d'enregistrement n'étant pas amovibles, aucune souris ne sort vivante du projet.

Objectifs

L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des candidats médicaments sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des signes de la maladie dans le cerveau et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel de transposition de cette méthode du rongeur à l'Homme, et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales chez des animaux. Les différences mises en évidence pourront alors être utilisées pour différents tests médicamenteux afin d’identifier une molécule efficace pour lutter contre la maladie.

Bénéfices attendus

L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d'identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris et chercherons à mettre en évidence des spécificités de la maladie qui pourront par la suite être applicable à l'Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques. L’identification d’un potentiel nouveau traitement de la maladie d’Alzheimer permettrait d’améliorer les conditions de vie de nombreux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux sont hébergés après l’implantation dans des cages à deux contenant un séparateur qui favorise le contact olfactif, visuel et auditif mais qui permet de les isoler afin de préserver l’intégrité du système d’enregistrement. Les animaux seront tous soumis à des stimulations intracérébrales répétées de faible intensité qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Chaque session de stimulation durera entre 3 et 40 minutes au maximum. Au préalable de chacune de ces sessions de stimulations, une molécule pharmacologique pourra être administrée à l'ensemble des animaux (injections aigues durant quelques minutes). Pour ces tests pharmacologiques, un maximum de 10 injections sur une période de 5 à 10 semaines seront réalisées. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés (20 maximum au total et 15 minutes maximum par animal), tous les animaux du projet sont susceptibles d'être soumis à ces prélèvements.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagères pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l’intensité faible utilisée, une réaction comportementale (immobilité, sursaut, clignement des yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Le modèle utilisé présente une stagnation de la prise de poids à partir de 10 mois ainsi qu’une surmortalité très modérée propre au modèle non liée au vieillissement.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles animaux car il étudie des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal est son propre contrôle et sera utilisé pour tester différents candidats médicaments, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Ce type de protocole nous permet d’utiliser des tests statistiques de type appariés. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.

Raffinement

Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement (coton, maison en carton) pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien. Les stimulations seront interrompues au moindre signe d’inconfort de l’animal (évaluation visuelle comportementale). En cas de survenue d’une crise épileptique : un traitement de kétamine/diazépam sera administré alors immédiatement. Dès l’apparition d’un signe clinique d’alerte (poids, comportement...) nous nous réfèrerons à une grille de cotation interne spécifique permettant de prendre les mesures nécessaires en fonction des points limites identifiés afin de préserver le bien-être animal. L’évaluation est réalisée jusqu’à disparition du signe d’alerte. Lors des injections, une surveillance particulière est portée sur les animaux. Un arbre décisionnel peut être consulté en cas d’altération de l’état général de l’animal après l’injection afin de le soulager.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques du cerveau. Ces similarités peuvent être utilisées pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de minimum 3,5 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 14 mois maximum car le sujet d’étude concerne la maladie d’Alzheimer qui se développe avec le vieillissement.

Toutes tuées pour que leur système nerveux central soit prélevé, 30 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit quarante gavages oro-gastriques, un par jour, sur animal vigile, avec de la roténone, un insecticide que la Commission européenne a interdit en 2008 pour sa toxicité. Le porteur qualifie la dose de "modérée" et "peu impactante sur la qualité de vie des animaux", et n'attend du gavage qu'une irritation transitoire du système digestif. Il s'agit d'une étude pilote de trois ans, dont la fonction déclarée est de mettre le modèle en place pour permettre de futures expériences.

Objectifs

La roténone est un insecticide d’origine naturelle extrait de racines de plantes tropicales. En raison de sa toxicité, la commission européenne a interdit son utilisation en 2008, avec des dérogations jusqu’en 2011. Le lien étroit entre une exposition à la roténone d'origine professionelle (agriculture) et un risque accru de développer une maladie de Parkinson a été formellement établi en 2011. Les examens post mortem réalisés sur des cerveaux de travailleurs exposés à la roténone dans le cadre de leur activité professionnelle ont révélés des lésions caractéristiques de la maladie de Parkinson : perte des neurones dopaminergiques et accumulation de protéines pathologiques. Ainsi, l’exposition expérimentale à la roténone chez la souris est aujourd’hui utilisée non seulement comme modèle de la maladie de Parkinson, mais aussi pour évaluer ses effets potentiels sur les troubles du développement cérébral chez les fœtus exposés in utero. Il existe en effet de fortes présomptions pour une toxicité des polluants environnementaux (incluant les produits phytosanitaires) sur le cerveau en développement. L’objectif de notre étude pilote est d’implémenter le modèle d’exposition expérimentale à la roténone chez la souris par administration directe dans l'estomac. Cette étude pilote, d'une durée de 3 ans, permettra de préparer de futures études portant sur l’effet de la roténone sur les lésions caractéristiques de la maladie, ainsi que sur les effets toxiques neuro-développementaux de la roténone.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer d’un modèle de référence de maladie de Parkinson provoquée par exposition aux produits phytosanitaires. Sur le plan des connaissances scientifiques, le projet produira des données inédites sur des mesures du comportement des souris dans ce modèle de maladie de Parkinson en complément des données biologiques.

Procédures

Les souris sont exposées à la roténone par voie orale via un gavage oro-gastrique quotidien. Le gavage dure 1 minute et est réalisé sur animal vigil. Chaque souris sera soumise à 40 gavages sur l'ensemble de la période d'expérimentation. En fin de protocole, il sera procédé à une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Le modèle est bien décrit dans la littérature et la dose modérée utilisée est peu impactante sur la qualité de vie des animaux . La procédure de gavage oral, réalisée par un personnel expérimenté, est susceptible d’engendrer une irritation transitoire du système digestif.

Devenir

L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique de la roténone, pour ce faire il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin de disposer du système nerveux central.

Remplacement

A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, et leurs interactions, impliqués dans le développement de la pathologie spécifique produit par l'administration de roténone ne sont pas réalisables in vitro. L’étude de ces mécanismes nécessitent l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Le schéma expérimental utilisé considère chaque animal comme son propre contrôle grâce à la répétition des tests et permet ainsi la réduction du nombre d'animaux.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (igloos, nestlets et petites buchettes de bois). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Le suivi individuel est approfondi lors des pesées bi-hebdomadaires. Les points limites concernent la perte de poids, la présence de piloérection accompagnée du dos vouté et l’absence de réaction à la stimulation. L’administration orale de la roténone évite la répétition d’injections intrapéritonéales.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des souris conventionnelles qui permettront la comparaison de nos résultats avec les données de la littérature. Le projet prévoit d’utiliser des souris à l'âge de 5 semaines à l'arrivée au laboratoire. Le protocole d’exposition démarrera lorsque les souris auront 8 semaines, ceci nous permettra de comparer les résultats avec les données de la littérature.