Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etablissement d’un modèle d’injection intracérébroventriculaire chez le souriceau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
320 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, 128 anesthésiés puis tués avant tout réveil et 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À deux ou trois jours de vie, chacun reçoit une injection dans les ventricules cérébraux, d'un colorant ou d'un fragment d'ADN ou d'ARN synthétique, sous anesthésie par hypothermie ou par gaz, les deux méthodes étant comparées entre elles. Une partie est suivie jusqu'à trente jours après l'injection, puis autopsiée pour prélever le cerveau, le foie et les reins. Le porteur conclut qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour évaluer une thérapie contre les épilepsies infantiles, au motif que des neurones en culture ne présentent pas de crise spontanée, alors que ce projet ne mesure aucun effet thérapeutique.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie des neurones dont le fonctionnement anormal entraîne des décharges électriques brusques et excessives – la crise épileptique. L’épilepsie infantile est une maladie rare mais sérieuse qui apparaît habituellement entre l’âge de 3 mois et 6 ans. Comme pour les adultes, le traitement des épilepsies chez l’enfant est principalement médicamenteux. Toutefois, plus d’un tiers des épilepsies infantiles sont résistants aux approches médicamenteuses existantes, d’où la nécessité d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques notamment pour éviter le recours à des interventions chirurgicales lourdes et risquées. Dans ce sens, de nombreux essais d'administration intra-cérébrale sont en cours, à la fois au stade préclinique et clinique, et suscitent déjà d'importants espoirs thérapeutiques à long terme. L'objectif de ce projet est de développer et valider un modèle permettant d'administrer un colorant non toxique ou une molécule thérapeutique spécifique (un fragment court d'ADN ou d'ARN synthétique) dans des zones précises du cerveau de souris nouveau-nées. Deux techniques d'anesthésie seront comparées : 1) L'anesthésie par hypothermie et 2) L'anesthésie gazeuse par inhalation. Cette comparaison vise à déterminer la méthode optimale pour anesthésier efficacement des souris nouveau-nées, minimiser la durée de l'anesthésie, l'inconfort de l'animal et le temps de séparation entre le souriceau et sa mère, tout en ciblant efficacement la zone cérébrale d'intérêt. La distribution de la substance injectée sera évaluée immédiatement après l'injection pour vérifier le succès du geste (procédure 1), et 7 jours plus tard pour s'assurer de la bonne récupération des souriceaux et comparer les 2 méthodes d’anesthésie (procédure 2). La validation du modèle sera assurée par l’évaluation d’une injection de la molécule thérapeutique avec la méthode anesthésique la plus appropriée. Les souriceaux seront suivis attentivement pendant 30 jours maximum (procédure 3). Une analyse macroscopique des organes post-mortem sera également réalisée au moment de l’euthanasie et le foie, les reins seront prélevés afin de réaliser des analyses sur ces tissus. La validation du modèle sera fonction de l’ensemble des résultats et des analyses. Le modèle établi servira in fine, au travers d’une demande ultérieure d’autorisation de projet, à évaluer l’effet thérapeutique à plus long terme d’une injection d’oligonucléotides dans le cerveau de souris épileptique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra d’informer sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité de la molécule thérapeutique au niveau du système nerveux central en développement et au niveau périphérique (ii) les modifications physiologiques induites par l’injection intracérébrale de la molécule thérapeutique (iii) le mode d’anesthésie à pratiquer sur des souriceaux afin de minimiser leur inconfort, maximiser leur survie et obtenir des résultats aussi reproductibles que possible.
Procédures
L'injection d'un colorant non toxique ou d’une molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du souriceau sera réalisée sur animal anesthésié et analgésié. L'administration sera unique et durera moins de 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront évalués avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyées d’une veille bibliographique inhérente à la molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) à injecter. Plus précisément, nous surveillerons l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un traumatisme et une inflammation transitoire au niveau du site d’injection, ou encore un comportement anormal de l’animal, une perte de poids.
Devenir
Devenir des souriceaux utilisés dans les 3 procédures : A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et minutieusement autopsiés. Les organes d'intérêts, dont les structures cérébrales, seront prélevés. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
Les agents thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels présentent plusieurs limites, p.ex., l’étude de cellules neuronales en culture ne permet pas d’observer de crise épileptique spontanée ; la vascularisation cérébrale et les connexions entre neurones de différentes régions cérébrales étant absentes. De plus, ces études ne renseignent pas sur les effets d’agent thérapeutique sur un ensemble de cellules différentes, en particulier ici dans le cerveau. Le système nerveux central comme celui du nouveau-né est en perpétuel remodelage assuré par des régulations impliquant différents types cellulaires. Le développement cérébral et les mécanismes complexes de communication entre cellules ne peuvent donc être mimés par un simple modèle de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’efficacité d’une thérapie dans le traitement des épilepsies infantiles et ses effets éventuels sur le développement cérébral. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Les souriceaux des deux sexes seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une étude complémentaire pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux agents thérapeutiques, 8 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu après analyse des premiers résultats avant chaque protocole, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les souriceaux seront stabulés avec leur mère respective. Pour les souriceaux gardés jusqu’à 30 jours après injection, une fois sevrés, ils seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement adapté n’induisant pas de stress et en veillant à séparer les mâles des femelles. Des mesures spécifiques de gestion de la douleur éventuelle occasionnée par l’injection intracérébrale seront prises pour éviter toute souffrance inutile et prolongée des animaux : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilitée d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des protocoles anesthésiques (par hypothermie ou à l’isoflurane) et analgésiques appropriés dès l’apparition de premiers signes cliniques. Une observation minutieuse des souriceaux sera effectuée durant la phase de réveil sur couverture chauffante puis lors du replacement dans la cage avec la mère. Les souriceaux seront également minutieusement observés 10min, 3h et 24h après le réveil puis 2x par semaine jusqu’à la fin des procédures. Ce score a été déterminé spécialement pour ce projet en se basant sur la littérature existante. Les souriceaux seront également pesés le jour de l’injection, puis tous les 2 jours jusqu’à 10 jours post-injection et enfin 2 fois par semaine jusqu’à 30 jours post-injection. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites à l’appui des grilles du bien-être animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère possède des organes et type cellulaires identiques à ceux de l’homme. De plus, la souris présente un patrimoine génétique et des caractéristiques comportementales, physiopathologiques et réponses tissulaires très proches de celles observables chez l'homme, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les pathologies humaines notamment celles du système nerveux. La souris étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme. Par ailleurs, les structures cérébrales et nerveuses peuvent parfaitement être prélevées à partir de cet animal. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Les souriceaux seront soumis à une injection directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du cerveau à l'âge de 2 ou 3 jours—une période critique du développement cérébral. Ce stade précoce est optimal pour cette procédure, offrant un accès facilité aux ventricules cérébraux. La procédure n°3, en particulier, permettra d’évaluer les conséquences de l'injection d'oligonucléotides sur un cerveau en pleine maturation. À un mois post-injection, le cerveau murin aura atteint environ 90% de sa taille adulte, avec la majorité des neurones déjà formés et en cours de différenciation. Cette approche permettra d'analyser l'impact global de l'intervention sur les structures et fonctions cérébrales, fournissant ainsi des données cruciales sur la sécurité potentielle de l’élément injecté dans le contexte du développement neurologique. Par ailleurs, l'utilisation de la fenêtre 2-3 jours pour les expériences, plutôt qu'un jour fixe, présente plusieurs avantages cruciaux pour l'optimisation du protocole expérimental et le respect des principes éthiques en recherche animale. Cette approche permet une gestion efficace des ressources en s'adaptant aux naissances survenant hors des horaires de travail habituels, réduisant ainsi le gaspillage d'animaux. Elle prend en compte la variabilité biologique naturelle entre les portées, permettant d'ajuster les protocoles d'anesthésie selon le poids et le développement de chaque souriceau.
Evaluation de la tolérabilité et de l’efficacité de candidats-médicament administrés par voie intrathécale chez le primate non-humain
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Ces injections intrathécales servent à caler les doses et le calendrier des études réglementaires obligatoires qui suivront. 116 macaques à longue queue y sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 tués pour l'analyse post-mortem des tissus et 66 gardés en vie pour d'autres études. Chacun peut recevoir jusqu'à six injections dans le liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale, avec ponction du même liquide, jusqu'à dix prélèvements sanguins par semaine sur animal vigile, six IRM de trois heures maximum et vingt-quatre heures en module de collecte d'urine. Le porteur anticipe une baisse transitoire des réponses des membres inférieurs, des contractions musculaires et de rares fuites urinaires, et présente ces essais comme un moyen de réduire les contraintes des études réglementaires à venir.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement l’efficacité et la toxicité éventuelle de candidats-médicaments administrés par voie intrathécale afin de pouvoir proposer le meilleur traitement aux patients atteints de troubles neurologiques graves tels que par exemple les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson…) ou des atteintes neuropsychiatriques (épilepsie, …). Les études dans ce projet permettront d’ajuster au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal).
Bénéfices attendus
Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients. Ce projet nous permettra également de comprendre l’impact du geste de l’administration spinale (voie intrathécale) répétée d’un traitement et à terme d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour rendre plus sûre l’administration du traitement chez les patients et améliorer ainsi leur prise en charge.
Procédures
•Injections intrathécales réalisées sous anesthésie générale : jusqu’à 6 injections maximum avec un délai minimum de 7 jours entre les 2 injections (durée acte : 15min maximum) •Prélèvements de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale juste avant les injections intrathécales et plus rarement entre 2 injections intrathécales. (durée : 2 à 3 min en fonction de la vitesse d’écoulement) •Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (au maximum 10 par semaine ou dans la limite de 7,5% du volume total circulant ; quelques secondes •Prélèvements urinaires en hébergeant l’animal dans un module d’hébergement adapté pendant 24 heures maximum pour collecter les urines. •Examen des yeux sous anesthésie générale (utilisation d’une lampe à fente) : 30 à 40 min • Examen du système cardiovasculaire (port gilet pour monitoring sur 12h) par électroencéphalogramme et prise de la tension artérielle (brassard pour les mesures : 10min max). • Imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale : 6 sessions au maximum, espacées de 15 jours minimum, seront réalisées par animal (durée acte : 3h maximum)
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les effets indésirables anticipés concernent ceux inhérents à la voie d’administration intrathécale et pourrait inclure : une diminution transitoire (jusqu’à 24-48 heures après injection) des réponses des membres inférieurs pouvant induire ou non une perturbation de la démarche et la posture de 30 minutes à 4 heures après le réveil, contractions musculaires durant la procédure ou juste après injection, de rare troubles neurologiques tel que des fuites urinaires (jusque 4 heures après injection). Ces effets potentiels seront gérés par l’utilisation de points limites adaptés afin de limiter au maximum l’apparition et la durée des effets décrits ci-dessus. La douleur et la souffrance potentiellement présentes sont liées aux administrations et aux prélèvements de sang et de liquide cérébrospinal. Ces désagréments sont gérés sous anesthésie générale excepté dans le cas des prélèvements de sang où l’anesthésie provoquerait plus de souffrance et de stress que l’acte en lui-même pour lesquels les animaux sont habitué par renforcement positif. Concernant l’IRM, il s’agit d’un examen de nature non-invasive mais des nuisances liées à l’anesthésie et son caractère répétitif (troubles respiratoires/embolie pulmonaire, fausse déglutition) ou une perte de poids peuvent subvenir. Un inconfort des voies aériennes suite à l’intubation endotrachéale (max 3h) peut être attendu
Devenir
66 animaux seront gardés en vie et pourront être réutilisés dans d’autres études, après accord vétérinaire. 50 animaux seront euthanasiés pour procéder à l’analyse post-mortem des tissus (immunohistochimie/biochimie).
Remplacement
Les progrès scientifiques ont permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés en privilégiant les tests in silico et in vitro pour la sélection précoce des molécules. Cependant, les progrès réalisés n’ont pas permis la substitution complète des tests in vivo qui demeurent un requis réglementaire. Comme les études envisagées dans le cadre de ce projet permettent de choisir les doses des études réglementaires obligatoires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires, elles doivent être réalisées sur le même modèle animal que celui des études réglementaires.Cependant, des études préliminaires réalisées en amont chez le rongeur (rat/souris) auront déjà permis de bien définir les doses à administrer et à limiter le nombre de produits à tester chez le primate non humain..
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son minimum afin d’atteindre l’objectif du projet. Pour ces études, en tenant compte de la disponibilité de la bibliographie existante et des données générées en interne,, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Ces études préliminaires permettront de limiter le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques dans les études réglementaires.
Raffinement
Une procédure d’analgésie et d’anesthésie sera appliquée au moment des administrations intrathécales. Une anesthésie sera également effectuée pour l’examen IRM. Un délai d’au moins 48h sera respecté entre les IT et IRM. Une observation accrue et adaptée du comportement de l’animal sera faite suite à l’administration afin de s’assurer qu’il ne présente pas de signe défavorable ou que l’apparition d’éventuels signes liés à la procédure ne soit que transitoire (ex : démarche anormale). Concernant le reste des examens pratiqués, afin de ne pas interférer sur les paramètres étudiés, les animaux ne seront pas anesthésiés mais ils seront habitués par renforcement positif. Une grille de point limite adaptée est mise en place pour prise de décision rapide. En cas de nécessité, le vétérinaire pourra intervenir et décider de la mise en place de soin spécifique. Tous les animaux sont mis en groupes, sauf cas occasionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie , prélèvements sanguins ou signes nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.
Choix des espèces
Les études de ce projet ont pour but de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicaments chez l’Homme ainsi que son efficacité sur l’engagement de la cible associée à la distribution du médicament dans l’organisme humain. Dans ce contexte, le modèle primate non-humain peut être sélectionné à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proches de l’humain notamment sur la totalité des paramètres suivants : • Sur le plan pharmacologique et toxicocinétique : exposition au médicament, élimination, fraction libre du médicament… • D’un point de vue du métabolisme : le type et la quantité relative de métabolites produits suite à l’administration d’un médicament en se basant sur des études préliminaires • D’un point de vue physiologique : réactions physiologiques similaires (exemple : engagement de la cible) et pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme • Sur le plan expérimental : évaluation des formulations et excipients tolérés, voies d’administration possibles • Données historiques : expérience avec des médicaments compétiteurs de la même catégorie Ces études étant préliminaires aux études réglementaires qui utilisent principalement des adultes et de jeunes adultes, il est donc prévu d’utiliser des animaux du même stade de développement.
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Placés seuls en cage de 17 h à 9 h pendant trois nuits, en gardant un contact visuel avec leurs congénères, pour un test de préférence du saccharose, les rats passent aussi des tests de locomotion, d'anxiété, de coordination, de force, de mémoire et de comportement compulsif, ainsi qu'une prise de sang et une mesure de la fonction musculaire sous anesthésie. 100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet vise à vérifier si ces lignées reproduisent une maladie neurodéveloppementale rare, et le porteur indique qu'une des mutations rend les mâles "plus chétifs, plus agressifs". Hormis le test du saccharose, il désigne chaque test par ce qu'il mesure sans dire lequel est employé, et mentionne un "test impliquant de l'eau", après lequel les rats sont séchés sous une lampe chauffante, sans l'identifier.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT- L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Elevage et maintien de la lignée murine modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher, avec prélèvement invasif pour génotypage
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris homozygotes de cette lignée sont conçues pour démyéliniser: dysfonction mitochondriale, dégénérescence du cervelet, convulsions et mort précoce vers l'âge de trois mois. 2 250 souris au maximum vont être produites sur cinq ans, dans un projet d'élevage classé en souffrance légère au titre de la seule procédure déclarée, un prélèvement de l'extrémité de la queue sur des souriceaux de sept à dix jours. Les porteuses des génotypes utiles partent vers d'autres projets à vingt-et-un jours, les reproductrices sont gardées jusqu'à huit mois, et les souris non porteuses sont tuées parce que leur modification génétique interdit tout replacement. Le RNT ne dit pas combien de souris homozygotes seront produites ni combien exprimeront le phénotype dommageable, alors que c'est là que se concentre la souffrance de la lignée.
Objectifs
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Elle fait partie des leucodystrophies hypomyélinisantes caractérisées par un déficit permanent de myéline (une substance qui sert à isoler, à protéger les axones des neurones comme une gaine isolante autour de fils électriques et qui joue un rôle important dans la propagation rapide de message nerveux d’un neurone à l’autre) au niveau du cerveau. Cette maladie touche surtout les enfants avec des retards de développement important qui impactent à la fois les fonctions motrices et cognitives. La mise au point d’un traitement est un point crucial pour les patients atteints de cette maladie génétique rare, qui ne bénéficient actuellement d’aucune solution thérapeutique. L’objectif du projet est d’élever une lignée de souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher afin de générer nos lots expérimentaux qui permettront d’évaluer l’effet thérapeutique de différentes approches thérapeutiques par la suite.
Bénéfices attendus
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher (ou PMD) est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Sa fréquence est de 1 pour 100 000 naissances. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour cette pathologie. Le bénéfice du projet sera de maintenir notre lignée modèle de cette pathologie afin de générer des lots expérimentaux pour différents projets de recherche pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques qui nous l’espérons, contribueront à améliorer la vie des patients. A plus long terme ce projet pourrait donc permettre d’améliorer les connaissances sur la PMD et contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera effectué une fois sur animal vigile de 7 à 10 jours et durera moins d’une minute par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage. La lignée présentera un phénotype dommageable chez les animaux homozygotes generé se traduisant par une démyélinisation des axones, une dysfonction mitochondriale aggravant la dégénérescence du cervelet, suivie d’une mort précoce des animaux à l’âge de 3 mois en lien avec des crises de convulsions, cependant les reproducteurs heterozygotes ne developpent pas de phenotype dommageable et les animaux générés seront transférés en procédure dans d'autres DAP à 21jours. Enfin, les animaux pourront ressentir un stress lors des manipulations.
Devenir
En fonction de leur patrimoine génétique, une partie des animaux sera dirigée vers d’autres projets de recherche, en utilisation continue. Les animaux d’élevage et les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés par une methode réglementaire car ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets ou replacés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Le projet vise à maintenir une lignée de souris génétiquement modifiées modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher, afin de générer des lots expérimentaux pour l’étude d’approches thérapeutique de cette pathologie . Les modèles in vitro (lignées immortalisées/cultures de neurones primaires) nous permettront au préalable de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de nos approches thérapeutiques mais il restera toujours indispensable de valider les résultats obtenus dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de recourir à des études pré-clinique chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent dans notre cas puisqu’un modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a été créé chez cette espèce.
Réduction
Du fait de la nature du projet (élevage), il n’y aura pas de tests statistiques. Nous piloterons notre élevage afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour correspondre à nos besoins stricts pour les projets de recherche et le maintien de notre lignée. Nous prévoyons donc de produire au cours du projet un nombre total maximal de 2250 souris afin de constituer nos cohortes d’étude. Nous contrôlerons les accouplements pour générer uniquement les animaux nécessaires, ainsi, en fonction de nos besoins expérimentaux au cours des 5 années du projet il est possible que nous produisions finalement moins que ce nombre maximal. Les animaux produits seront en utilisation continue dans des projets d’évaluation de thérapies dans lesquels les effectifs par groupe auront été définis à l’aide de tests de puissance statistique afin d’inclure uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus nous inclurons dans ces groupes les mâles et les femelles générées, en effet nous pouvons utiliser les 2 sexes dans ce modèle murin préclinique car la mutation d’intérêt n’est pas liée au sexe comme chez l’Homme, ce qui limitera le nombre d’animaux à produire.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement, et un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. En cours de procédure une attention particulière est portée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne par la zootechnie et la mise en place de points limites et de soins adaptés. Le prélèvement pour le génotypage est très petit et réalisé sur un jeune animal (moins de sensibilité à le douleur et cicatrisation rapide), c’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Les reproducteurs seront conservés jusqu'à l'âge de 8 mois pour conserver des capacités de reproduction optimales. Dès que les animaux homozygotes exprimeront le phénotype dommageable, c’est-à-dire à 12 jours environ, nous les surveillerons et mettrons à leur disposition un soutien alimentaire directement dans la cage afin de favoriser leur alimentation. Nous choisirons un schéma d'accouplement entre hétérozygotes afin de limiter l'expression du phénotype dommageable aux animaux nécessaires pour les évaluations thérapeutiques uniquement.
Choix des espèces
Pour notre projet, nous avons besoin d’un modèle de la pathologie afin d’étudier les effets de nos approches thérapeutique de la maladie de Pelizaeus Merzbacher. De nombreux modèles de souris génétiquement modifiés ont déjà été mis au point, et il existe chez la souris un modèle particulièrement pertinent pour cette pathologie que nous avons donc sélectionné pour notre projet. Les animaux reproducteurs seront utilisés de l’âge de 2 mois environ jusqu’à 8 mois. Les petits produits seront prélevés d’un fragment de queue à l’âge de 7 à 10 jours pour connaitre leur patrimoine génétique. Les animaux porteurs des patrimoines génétiques d’intérêt pour nos projets de recherche seront transférés dans ces projets (utilisation continue) à l’âge de 21 jours.
Caractérisation du comportement de tétée chez le nouveau-né de la souris modèle du syndrome de Prader-Willi et rôle de l’ocytocine dans ce comportement.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés séparés de leur mère jusqu'à quatre heures, stimulés au pinceau puis au laser infrarouge au niveau du tronc cérébral: 708 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour des analyses post-mortem. Les mères reçoivent des injections intrapéritonéales d'anesthésique et se voient retirer une partie de leur portée. Le projet cherche à comprendre pourquoi les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi tètent mal et comment l'ocytocine rétablit la tétée, un essai clinique de phase 3 étant déjà en cours chez des bébés. Trente femelles sont réutilisées pour quatre à cinq portées avant d'être tuées, et 312 autres souris sont utilisées pour la reproduction de huit lignées puis tuées vers l'âge de six mois.
Objectifs
Ce projet porte sur la compréhension de mécanismes physiopathologiques impliqués dans la tétée chez des souris modèles d’une maladie rare (le syndrome de Prader-Willi) et le rôle d’une hormone qui restaure une activité de tétée normale. En effet, il a été montré qu’il y a un dysfonctionnement de l’activité de tétée chez les souris modèles d’une maladie rare, tout comme cela a été observé chez les bébés Prader-Willi et que l’administration de l’hormone étudiée rétablie une tétée normale chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques (PhaseI/II) chez des enfants atteints du syndrome de Prader-Willi, il résulte une amélioration (voire normalisation) de l’activité de succion. Toutefois le mécanisme d’action de cette hormone dans l’activité de tétée n’a jamais été investigué Les études associées à ce projet permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi, d’étudier comment l’hormone étudiée restaure une tétée normale chez ces souriceaux et quelles régions du cerveau sont activées, et donc d’argumenter l’intérêt d’utiliser cette hormone et définir les conditions optimales pour traiter les bébés Prader-Willi. Ce projet comprend 6 procédures. Au total, 708 souris, dont 678 issues de 164 croisements que nous effectuerons et 30 femelles provenant d'un fournisseur agréé, seront expérimentées.
Bénéfices attendus
Les bébés Prader-Willi présentent dans plus de 95% de cas un déficit de l’activité de tétée qui nécessite une intubation de quelques semaines. Cette intubation peut avoir des conséquences sur le développement et le comportement de ces enfants. Nos études précliniques ont montré que l’administration sous-cutanée d’une hormone (une seule administration à la naissance), permet de restaurer une activité normale de tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi et une amélioration dans le comportement cognitif et social de ces souris plus tardivement. A partir de ces études précliniques, une étude clinique de phase I/II a été mené chez des bébés Prader-Willi montrant une normalisation de la tétée chez ces bébés; une étude clinique en phase 3 est en cours. Il s’agit ici d’un projet qui est focalisé sur la tétée pour comprendre quelles sont les altérations mécaniques ou sensorielles qui empêchent les souriceaux modèles du Syndrome de Prader-Willi de téter normalement et comment une administration de l’hormone étudiée agit sur le plan fonctionnel (sensoriel ou moteur) et sur l’activité neuronale du cerveau pour rétablir une tétée normale chez ces souriceaux. Ce projet amènera : 1) une compréhension des mécanismes fonctionnels et cellulaires du déficit de la tétée dans un modèle du syndrome de Prader-Willi et par extension chez les bébés Prader-Willi ; 2) de mieux comprendre, en général, les mécanismes sous-jacents à l’activité de tétée qui est très peu étudiée ; 3) d’élucider comment l’administration de l’hormone étudiée corrige ce déficit; 4) plus généralement elle nous révèlera le rôle du de tout un système hormonal dans la tétée et cela nous permettra d’envisager d’élargir le traitement à des bébés qui présentent un déficit de tétée à la naissance (soit 10% des nouveau-nés). Les résultats attendus permettront donc de comprendre et de proposer un traitement approprié (en connaissance de cause) du déficit de tétée chez les bébés Prader-Willi mais aussi dans d’autres pathologies qui présentent un déficit de tétée. Cet aspect translationnel est vraiment très important.
Procédures
Sur les mères, les interventions sont : Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes. La séparation avec une partie de leurs nouveau-nés pour quelques heures (même si une partie des nouveau-nés restent avec elles). Sur les nouveau-nés, les interventions sont : Les injections sous cutanée sur les nouveau-nés. L’isolement de la portée de souriceaux de leur mère pendant 4 heures maximum. La manipulation des souriceaux pendant le test de saisie de tétine, La stimulation tactile des nouveau-nés à l’aide d’un pinceau. La stimulation externe (au niveau du tronc cérébral) de nouveau-nés à l’aide d’un laser Infra-rouge (peu énergétique) faite sur animaux non contraints Sur les souris génétiquement modifiées lors du maintien de lignée : caudectomie ; tatouage Il n'y a aucune procédure chirurgicale dans cette DAP. Un prélèvement de queue sera effectué sur animaux vigiles dans le cadre du génotypage si le génotypage ne fonctionne pas à partir d’une touffe de poils prélevée sur l’individu (des mises au point sont en cours) mais concernera au grand maximum 312 souris.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère douloureux. Malgré le temps très court de cette nuisance (
Devenir
Pour l’ensemble des animaux expérimentés en Procédures 1, 2, 4, 5 la mise à mort est justifiée par des analyses post-mortem sur des tissus prélevés. Procédure 3: 30 femelles réutilisées qui, après une première portée, seront utilisées deux fois dans notre étude et pourront aussi être utilisées comme génitrices 2 fois supplémentaires. Après 4 à 5 portées, les femelles seront euthanasiées. Procédure 6: 312 souris seront utilisées comme géniteurs (rices). Il s’agit du maintien de 8 lignées sur 4 ans et d’animaux qui seront géniteurs pour produire les animaux qui seront expérimentés. Ces animaux seront euthanasiés à l’âge adulte vers 6 mois.
Remplacement
Ce projet porte sur la physiologie et physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans le syndrome de Prader-Willi, qui est notre sujet d’étude. Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur le modèle de souris génétiquement modifié (qui mime ce déficit de tétée) et nous prenons en compte les analyses faites en parallèle sur les bébés Prader-Willi afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients.
Réduction
L'utilisation de souris qui sont identiques sur le plan génétique (ici une souche particulière de souris de laboratoire) permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour les tests de comportement depuis plus de 10 ans montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe, dans le test de saisie de tétine, pour valider la démarche statistique. En ce qui concerne les expériences pour étudier l’anatomie du cerveau ou l’activité électrique de neurones, nous utiliserons 6 animaux par condition. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, dépourvu de pathogènes spécifiques. La température et l’hygrométrie sont contrôlées, avec un cycle de lumière de 12h. Les cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Les souris sont entre 2 et 4 par cage, mais pas isolées ou exceptionnellement mais moins de 48 heures. La douleur/souffrance des animaux adultes et souriceaux est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes) en suivant la Grille de Score. Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie pourront être isolés de leur mère pendant 20min à 1h. Pendant le temps de séparation de leur mère, les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux au jour de la naissance et lors du tatouage des animaux de la procédure 6, un analgésique sera appliqué sur la peau pour diminuer la sensation de douleur.
Choix des espèces
L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude évalue des paramètres de comportement de tétée ainsi que l’anatomie du cerveau. Il est donc nécessaire d’étudier des mammifères, en particulier des modèles de souris de la maladies rare qui nous intéresse mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles de souris génétiquement modifiés. A ce jour, la souris est donc le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les stades choisis sont le jour de la naissance car le déficit de tétée observé chez les bébés Prader-Willi démarre à la naissance (tout comme dans le modèle souris étudié) et des souris femelles adultes, mères des nouveau-nés étudiés, sont aussi expérimentées.
Etude de l’activité cérébrale par photométrie chez la souris atteinte de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Les 420 souris subissent une chirurgie de 40 minutes pour implanter une fibre optique dans le cerveau, et la douleur chronique est provoquée sous anesthésie par une lésion de nerf (SNI) ou une injection de CFA, avec une douleur modérée et des troubles anxiodépressifs annoncés pendant environ six semaines ou une semaine selon la méthode. Élevées sur place, ces souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau et, selon le porteur, "afin de leur éviter toute souffrance inutile". Pendant 4 à 11 semaines, elles passent des séances de photométrie d'environ trois heures et des tests de comportement deux jours par semaine, pour repérer quelles régions du cerveau s'activent sous une stimulation mécanique ou thermique selon que la douleur vient d'un nerf lésé ou d'une inflammation. Le texte ne nomme pas ces tests de douleur, et annonce un prélèvement du cerveau pour analyser "l'expression virale" sans qu'aucune injection de virus figure parmi les procédures.
Objectifs
Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.
Procédures
Tous les animaux (n=420) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
La chirurgie SNI entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection de CFA entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h.
Devenir
Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.
Choix des espèces
Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature
Etude des effets du vieillissement et de candidats-médicaments sur la régénérescence de l’axe moteur périphérique dans un modèle murin de compression nerveuse.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Si l'analgésique administré ne suffit pas, l'animal est mis à mort. 1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit sous anesthésie une chirurgie de trente minutes qui comprime et lèse le nerf sciatique, puis une injection quotidienne pendant 28 ou 42 jours et deux électromyographies, le porteur reconnaissant que la lésion "provoquera de la souffrance" et que la pesée quotidienne y ajoute du stress. Deux questions justifient ces 1 824 souris, l'effet de candidats-médicaments et celui du vieillissement sur la repousse nerveuse, et le seul bénéfice annoncé tient dans la poursuite du développement de ces molécules si les résultats sont positifs.
Objectifs
Les atteintes de l’axe moteur, telles que la perte des axones et des neurones moteurs ainsi que la dénervation musculaire, sont à l’origine des maladies neuromusculaires. Des études montrent que dans certaines maladies neuromusculaires, comme la sclérose latérale amyotrophique, les neurones moteurs encore fonctionnels sont capables de compenser cette perte en créant de nouveaux prolongements axonaux et une réinnervation partielle. Ces mécanismes compensatoires sont induits par des voies de signalisations pro-régénératives : on parle de régénérescence de l’axe moteur. Ici, nous avons 2 objectifs : 1) étudier les effets de différents candidats-médicaments pour leur capacité à promouvoir la régénérescence de l’axe moteur après compression/lésion du nerf sciatique. 2) étudier l'effet du vieillissement sur la capacité à promouvoir la régénérescence de l’axe moteur après compression/lésion du nerf sciatique. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de lésion mécanique du nerf sciatique. En effet, la souris possède un système moteur complexe présentant de fortes similitudes avec le système moteur humain. Une lésion du nerf sciatique va en effet conduire à une dénervation musculaire et à une dégénérescence wallérienne, comme chez les humains. Le système moteur des souris est capable de régénérescence après lésion. Seulement 10 jours après la lésion, les souris présentent des signes de récupération fonctionnelle ainsi que réinnervation du muscle. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats-médicaments pour des maladies invalidantes. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie (1 fois, 30 minutes maximum), sous anesthésie générale, et une analgésie systémique et une analgésie locale. Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours postopératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure 1 inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 28 jours, d'une durée de 30 secondes maximum). La procédure 2 inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 42 jours, d'une durée de 30 secondes maximum). Les enregistrements électromyographiques (EMG) auront lieu à 2 reprises (J14 et J21 pour la procédure 1, et J35 et J42 pour la procédure 2). Ceux-ci durent maximum 30 minutes, et seront réalisés sous anésthésie générale. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie et une lésion mécanique du nerf sciatique. Cette lésion provoquera de la souffrance. Le traitement quotidien des souris peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Des mesures électromyographiques seront réalisées sous anesthésies. De plus, la mesure quotidienne des poids des animaux peut également engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (histologie).
Remplacement
Les processus de dénervation et réinnervation impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (motoneurons, cellules de l'immunité et cellules de Schwann) dans différentes structures (moelle épinière, nerf sciatique, muscle). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris (n par expérience) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique ainsi que l’expérience du porteur du projet suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (puissance: 80%, seuil de significativité à 5%, effect un effet de 25% et un écart type de 15%). Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans un modèle animal de lésion mécanique du nerf sciatique.
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par 4 au maximum, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprénorphine, 0.1 mg/kg) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris possède un système moteur complexe présentant de fortes similitudes avec le système moteur humain. Une semaine après la lésion du nerf, les souris présentent les premiers signes de réinnervation musculaire. La réinnervation et la récupération fonctionnelle est observable à partir de 10 jours après la lésion. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous utiliserons dans ce projet des souris. Afin de pouvoir évaluer l'effet du veillissement sur les procéssus de récupération fonctionnelle après une lésion du nerf, nous utiliserons des animaux âgés de 2, 12, 15 et 18 mois. Afin de tester l'efficacité de différents candidats-médicaments, nous utiliserons des animaux de 2 mois.
Etude des mécanismes comportementaux liés aux troubles de la prise alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Deux ponctions à la queue à trois semaines d'intervalle, un rationnement maintenant les souris à 90 % de leur poids libre, des isolements de une à deux heures et un régime riche en gras et en sucre pendant quatre à six semaines : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif déclaré est de relier des traits comportementaux, anxiété, prise de risque, capacités cognitives, prise de décision, au risque de développer un trouble du comportement alimentaire, avec l'idée de transposer les résultats à l'humain. Aucun prélèvement d'organe n'est prévu, et les souris sont tuées à la fin de la procédure parce que leur âge, plus de neuf mois, et leur régime empêchent de les réutiliser ailleurs. Sur la réduction, le porteur écrit seulement que "tous les efforts seront faits" et que le minimum sera utilisé, sans indiquer comment il arrive à 400 animaux.
Objectifs
L’objectif du projet est de faire ressortir des liens entre traits comportementaux et comportement face à la prise alimentaire. Plus spécifiquement, il s'agit de faire ressortir certains profils (caractère anxieux, prise de risque, capacités cognitives, choix et prise de décision) comme pouvant être à l’origine, voir prédictifs de trouble du comportement alimentaire. Nous nous intéresserons tout particulièrement au lien entre les trois processus suivants : Le décisionnel, le motivationnel, et le mnésique. Ces différents processus seront étudiés par divers études comportementales telles que : la mesure de l'anxiété, de la cognition, de la prise de décision par l'association d'un son à une action pour obtenir une récompense. Il s’agira in fine d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Par la suite, l'idée est de transposer ces résultats chez l’Homme afin de connaître le lien entre caractère comportementaux et risque de déclencher un trouble alimentaire. Ce savoir permettrait à l’avenir, d’anticiper au maximum le développement de troubles alimentaires touchant aujourd’hui près de 600 000 jeunes en France.
Bénéfices attendus
Les troubles du comportement alimentaire sont des pathologies mentales graves caractérisées par d’importantes perturbations du comportement alimentaire et de la corpulence. Elles peuvent causer des dommages physiques et émotionnels pouvant conduire malheureusement à la mort. Elles touchent une part importante de la population, avec une augmentation considérable depuis ces 15 dernières années, et constituent un réel problème de santé publique. Il est donc indispensable d’approfondir nos connaissances sur cette physiopathologie afin d’identifier des perspectives thérapeutiques mais aussi préventives. Dans ce projet, la confrontation de l’étude comportementale avec l’étude métabolique permet de déterminer une éventuelle corrélation entre certains traits comportementaux (anxiété, impulsivité, habitude) et paramètres consommatoires et/ou métaboliques spécifiques. Il s’agira donc d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Transposé à l’humain, ce projet apportera des connaissances sur les mécanismes à la base du comportement alimentaire et de ses altérations, afin d’éviter, le plus tôt possible (aspect préventif), l’apparition de pathologies liées à la consommation alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par ponction à la queue (ne durant que quelques secondes, le temps de prélever une goutte de sang) afin d’analyser leur taux de glucose et le métabolisme de chaque individu. Deux prélèvements à 3 semaines d'intervalle seront effectués au total sur chaque souris pour toute la procédure. Aucune autre intervention de type chirurgicale ne sera effectuée sur ces animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable majeur n'est attendu dans cette procédure. Principalement car elle est constituée de tests classiquement reconnus pour leur innocuité. Il est à noter tout de même que de légères nuisances sont à prévoir : stress, rationnement alimentaire léger (maintien à 90% du poids ad libitum). Les animaux seront également amenés à subir une isolation ponctuelle et de courte durée (pas plus de 2h), nécessaire notamment à la mesure de leur consommation individuelle. Cela peut entrainer un stress léger, qui sera diminué par l'utilisation de séparateurs de cage, permettant la conservation d'un contact visuel, auditif et odorant avec leur congénères. Dans la deuxième partie, la prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisances, qui restent moindres, pour les souris. Comme par exemple : une prise de poids de 15% maximum, une augmentation de la masse grasse, une augmentation modérée des niveaux circulants d’insuline et de glucose induisant un début d'intolérance au glucose mais pas de diabète avéré. De plus, cette nuisance, identique à celle rencontrée chez l’Homme, est l’object précis de cette étude. Enfin, le suivi des paramètres intéressants, comme le taux de glucose, pendant toute la phase du régime hyperlipidique inclu deux prélèvements de faible quantité de sang (100microL) en utilisant la méthode de prélèvement la moins invasive possible (légère ponction à la queue).
Devenir
A la fin de la procédure, les souris sont agées de plus de 9 mois, et auront déjà suivi une batterie de tests comportementaux. De plus, les animaux auront consommé un régime riche en sucre et gras pendant près de 4 à 6 semaines, empéchant toute réutilisation auprès d'un autre projet. Aucun prélèvement de tissu ou organe n'est prévu dans ce projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l’utilisation de modèles animaux puisqu’il s’intéresse à des dimensions comportementales, et s’adresse donc au vivant. Ceci est particulièrement vrai pour des tests d’anxiété, cognitifs, ou de prise de décision, visant à observer des différences inter-individus. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in-vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux et le minimum de souris nécessaires pour atteindre une signification statistique sera utilisé.
Raffinement
Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi et dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Lors d’expériences spécifiques et nécessaires impliquant une courte individualisation, des solutions sont mises en place pour réduire au maximum le stress de l'animal : une poignée de sciure de leur cage d’hébergement contenant une odeur familière et celle des congénères versée dans leur cage individuelle, ou encore la mise en place de séparateurs de cage pour garder un contact visuel, auditif et odorant avec un autre congénère. L'isolement est ponctuel et ne dure pas plus de 1-2h. La mise sous restriction alimentaire, nécessaires au bon fonctionnement des expériences mesurant l’aspect motivationnel lors de tests en conditionnement opérant seront réduites au maximum, et un suivi tout particulier sera effectué sur l’évolution du poids des souris. Hormis ces deux cas de figure, tout au long de leur hébergement, les souris recevront de l’eau et de la nourriture ad libitum, et seront changées régulièrement (1 fois par semaine) afin de conserver un environnement de vie propre et confortable. Elles seront également observées minutieusement de manière quotidienne par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et recevra un suivi renforcé (surveillé deux fois par jour). Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids de plus de 15%, poils hérissés, prostration…), la mise en place de mesures appropriées sera effectuée en fonction des besoins de l’animal. Il sera si besoin isolé de sa cage et les soins nécessaires lui seront administrés. Si, suite aux soins effectués, l’animal ne montre aucune amélioration significative dans les 48h suivant sa prise en charge, il sera mis à mort. De plus, si des signes d’agressivités sont présents dans une cage collective, l’agresseur est identifié et isolé du reste du groupe.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Le comportement du vivant en réaction à l’anxiété, aux fonctions cognitives, sociales ou décisionnelles sera particulièrement exploité dans notre étude, d’autant plus que les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. La souris a tout particulièrement été choisie car les effets du régime utilisé dans la seconde partie de notre étude sont bien caractérisés chez cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Ils seront livrés au sein de l’animalerie par un établissement agréé dès l’âge de 3 semaines (après le sevrage). Puis hébergés en collectivité (par 4 ou 6), le temps d’atteindre leur âge adulte. Ils débuteront ensuite les premiers tests comportementaux à l’âge de 8 semaines (adulte). Puis ils seront utilisés pour une durée totale de 6 mois.
Evaluation de l’effet neuroprotecteur de la photobiomodulation sur des modèles murins de la maladie de Huntington.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
366 souris, de deux souches porteuses de la maladie de Huntington et de souches témoins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Cinq jours par semaine, elles sont immobilisées 90 secondes pour un traitement de la tête par la lumière, avec des prises de sang éveillées tous les quinze jours, des IRM sous anesthésie jusqu'à une fois par mois et des tests de mouvement et de mémoire que le texte ne nomme pas. Si cette première partie est concluante, une seconde ajoute une chirurgie de 90 minutes pour implanter une source de lumière dans le cerveau. Dans les deux parties, les souris sont tuées dès que leurs symptômes moteurs évoluent "au-delà d'une gêne modérée". Le porteur compte parmi les bénéfices des "publications scientifiques et présentations en congrès", et renvoie un éventuel essai clinique à des "études complémentaires". Il présente aussi la seconde partie comme un moyen de limiter "le nombre de gros mammifères" d'une étude ultérieure.
Objectifs
Des études ont démontré que la lumière ralentie la maladie de Parkinson. La maladie de Huntington touche 6000 personnes en France. C’est une maladie génétique rare qui se traduit par la mort de neurones. Les symptômes handicapent grandement le quotidien des patients, et la maladie n’a pas à ce jour de traitement . La maladie de Huntington présente des similarités avec la maladie de Parkinson. Les objectifs de ce projet sont 1. d’évaluer sur des modèles souris de la maladie de Huntington si un traitement par la lumière permet de ralentir le développement de la maladie, au même titre que pour la maladie de Parkinson et 2. de préciser la région du cerveau la plus à même de recevoir le traitement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d’évaluer si le traitement par la lumière protège les neurones, comme cela a été observé dans la maladie de Parkinson. Les travaux seront aussi valorisés au travers de publications scientifiques et présentations en congrès. La deuxième partie du projet permettra de préciser les régions du cerveau les plus appropriées pour recevoir le traitement par la lumière. Si l’effet de protection des neurones par la lumière est avéré, comme il l’a précédemment été pour la maladie de Parkinson, des études complémentaires pouvant conduire jusqu’à un essai clinique, porteur d’espoir pour les patients, seront envisagées.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux subiront une contention 5 jours par semaine de 90 secondes afin de permettre le traitement. Les animaux sont préalablement habitués à cette contention. Le traitement est indolore, et n’induit pas de gêne ou inconfort. Pour évaluer l’effet du traitement nous mesurerons les mouvements des animaux et leur mémoire (tests n’excédant pas 15 minutes) et feront des IRM réguliers (n’excédant pas 1 heure) : initialement puis pour les plus fréquents tous les mois (pour les animaux dont l’espérance de vie est réduite), et tous les 3-4 mois pour les animaux avec une espérance de vie normale. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront effectués tous les 15 jours. Si besoin un prélèvement de queue de quelques millimètres pourra être réalisé de facçon unique sur animal anesthésié pour sa caractérisation génétique. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au delà d’une gêne modérée. Si l’efficacité du traitement est concluante, la deuxième partie du projet nécessitera une chirurgie (maximum 90 minutes) pour placer un implant délivrant de la lumière directement dans le cerveau, pour définir quelle région est la plus appropriée pour recevoir le traitement. Le traitement, permis par l’implant ne nécessitera plus de contention car la lumière sera contrôlé à distance. Les animaux seront évalués comme précédemment (même fréquence et durée pour les prélèvements sanguins, l’IRM et les tests comportementaux), et euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au-delà d’une gêne modérée.
Impact sur les animaux
Certains modèles animaux Huntington utilisés conduisent naturellement à une perte progressive des possibilités de mouvement de l’animal ; l’animal se nourrit et boit moins facilement et perd du poids progressivement. Certains animaux ont une durée de vie plus courte que la normale, et ne peuvent plus se déplacer correctement en fin de vie. La contention pour illuminer la tête des animaux ainsi que la réalisation des tests comportementaux peut engendrer de façon temporaire, le temps que l’animal s’habitue à l’expérimentateur, à une peur légère. Le traitement en lui-même n’induit ni chaleur, ni douleur. La chirurgie induit de façon temporaire (24-48h) et maitrisée une douleur modérée du fait des points de suture. Par expérience, les animaux tolèrent ensuite bien le dispositif qui est adapté à leur morphologie.
Devenir
Les animaux subiront un traitement par la lumière pour évaluer si cela permet de limiter le développement de la maladie de Huntington. Si les animaux de mise au point n’ont pas besoin d’être euthanasiés pour les mises au point sur pièce anatomique, ils seront utilisés dans les mises au point de la procédure 2. A l’issue de ces procédures, et en compléments des évaluations et de l’imagerie, les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour évaluer si le traitement a protégé les neurones.
Remplacement
La littérature permet de savoir que le traitement par la lumière est efficace dans la maladie de Parkinson. C’est un élément très encourageant pour espérer obtenir des résultats positifs pour la maladie de Huntington, car ces 2 maladies ont de nombreux points communs. Les études des effets de la lumière sur des modèles cellulaires ont mis en évidence une difficulté de transposition des résultats obtenus sur les modèles physiologiques in vivo (absence d’effet, ou modalités d’illumination complètement différentes de celles effectives in vivo). Les effets du traitement par la lumière impliquent probablement un intermédiaire encore non identifié, et non présent dans les cultures de cellules, empêchant ainsi l’anticipation des effets de la lumière in vitro. L’évaluation des effets neuroprotecteurs du traitement dans le cadre de la maladie de Huntington nécessite donc une évaluation chez l’animal, d’autant plus pour mesurer l’impact sur les performances motrices et cognitives. Les modèles de souris étant bien décrits et facilement manipulables sont adaptés pour une première évaluation. Des souches de souris de même fond génétique sont utilisées pour les mises au point, car il n’est pas nécessaire d’utiliser une souche à phénotype dommageable pour mettre au point les différentes étapes de l’étude. La deuxième partie du projet permettra de limiter le nombre de gros mammifères qui seraient nécessaires dans une étude ultérieure.
Réduction
Les données seront analysées par des tests statistiques. Des animaux au phénotype non dommageable seront utilisés pour les mises au point afin d’optimiser l’utilisation des animaux Huntington. La phase de mise en place sera stoppée dès que toutes les procédures seront maitrisées et reproductibles sur 3 animaux consécutifs. Les animaux n’ayant pas besoin d’être euthanasiés à l’issue des mises au point de la première procédure seront utilisés pour la procédure 2. L’évaluation des effets du traitement nécessite 2 souches complémentaires de souris Huntington, et des contrôles associés au phénotype non dommageable. On estime à 10% le nombre de souris qui seront euthanasiées précocement ne permettant pas de recueillir les données de façon adéquate. Deux types distincts et incompatibles d’analyse des pièces anatomiques sont nécessaires. La deuxième partie du projet ne sera réalisée que si les résultats de la première partie sont concluants. Elle reproduira la première étude en comparant 3 régions du cerveau pouvant recevoir le traitement (traitement localisé). Le total maximal de souris nécessaires pour ce projet sera de 366.
Raffinement
Les animaux seront surveillés de façon journalière. Le traitement, les tests et l’IRM ne sont pas douloureux ; une habituation préalable à la contention et aux expérimentateurs permettra de réduire le stress des animaux. Les IRM seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux réintègreront leurs groupes sociaux dès les tests effectués. Dans la deuxième partie du projet, les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et traitement antalgique. De l’hydrogel sera mis dans la cage et les animaux pesés chaque semaine pour évaluer et limiter la perte de poids naturelle de ces souris (du fait de la maladie). Les euthanasies seront effectuées sous anesthésie générale et antalgie, dès que les points limites sont atteints permettant de limiter la durée pendant laquelle la souffrance due au phénotype dommageable atteint un stade sévère.
Choix des espèces
L’effet d’un traitement et son impact sur les mouvements, la mémoire et l’espérance de vie, ne peut s’évaluer que sur un organisme entier. Les souris sont des modèles bien connus, et une première évaluation ne nécessite pas d’organisme plus évolué. La littérature permet de bien connaitre les modèles d’étude, et d’adapter le protocole pour évaluer l’impact de notre traitement. Les animaux seront réceptionnés à l’âge de 3 semaines afin d’être sevrés, et de démarrer le traitement en phase précoce de développement de la maladie, l’espérance de vie étant assez courte (3 mois) pour l’une des souches, et les symptômes de la maladie apparaissant assez rapidement, comme c’est le cas dans la maladie humaine.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
650 rats vont être utilisés, chacun logé seul en cage pour que sa consommation alimentaire soit mesurée, quatre jours par semaine pendant six semaines, avec deux heures de retrouvailles quotidiennes ou un week-end en binôme. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue. Jeûne de quinze heures, privation d'eau de six heures, sept passages au maximum dans des tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, jusqu'à cinq prises de sang, quarante-huit heures en cage de collecte d'urines et de fèces, et pour quarante rates deux traites manuelles sous anesthésie après trois heures de séparation de leurs petits. L'enjeu déclaré est d'évaluer les effets de la végétalisation de l'alimentation humaine sur le métabolisme et le comportement, les résultats devant alimenter une collection de données utile aux pouvoirs publics.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Evaluation d’une approche thérapeutique innovante dans un modèle murin de la leucodystrophie métachromatique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie subissant une seule chirurgie crânienne de dix minutes, l'autre deux opérations de 40 minutes à trois mois d'intervalle. Les chirurgiens posent un implant près du cerveau ou injectent des cellules dans le cerveau, avec un risque d'hémorragie lors de la craniotomie, et des saignements, hématomes ou infections possibles. Ces souris reproduisent une leucodystrophie métachromatique, maladie qui touche environ 150 patients identifiés en France, et le porteur précise qu'elles seront tuées avant l'apparition du phénotype dommageable. La preuve de concept espérée pourrait "permettre de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l'Homme", formulation au conditionnel adossée à des craniotomies déjà planifiées.
Objectifs
L’objectif du projet sera d’évaluer la faisabilité puis l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique dans le cadre d’une maladie présentant une atteinte grave de la gaine de myéline (leucodystrophie métachromatique). Cette approche, basée sur de la thérapie cellulaire, sera évaluée sur le modèle murin de la pathologie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de la faisabilité et de l’efficacité d’une nouvelle approche de thérapie cellulaire pour le traitement de la leucodystrophie métachromatique. Si les résultats obtenus dans ce projet s’avèrent concluants, cela pourrait permettre de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l’Homme et ainsi d’amener à une étude clinique chez des patients souffrants de cette pathologie (fréquence 1/45000 naissances, soit environ 150 patients identifiés en France). A long terme, cela pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Pour une partie des animaux, une procédure chirurgicale (sous anesthésie générale et analgésie adaptée) sera réalisée pour la mise en place d’un implant proche du cerveau (une fois par animal, durée 10 minutes). Pour l’autre partie des animaux, deux procédures chirurgicales (sous anesthésie générale et analgésie adaptée) seront réalisées à 3 mois d’intervalle pour réaliser des injections dans le cerveau des animaux (deux fois par animal, durée 40 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire. Le phenotype dommageable present chez ce modele se developpe apres l'age d'euthanasie de ce projet.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont un stress de l'animal lors des contentions et manipulations nécessaires au cours des procédures. Lors des procédures de chirurgie l’animal pourra ressentir un stress lors de l’induction de l’anesthésie. Cette anesthésie sera associée à une hypothermie et un risque rare de problèmes cardio-respiratoire. Suite à la chirurgie l’animal pourra ressentir une douleur et un inconfort. Des risques rares et inattendus peuvent survenir en lien avec la chirurgie tels que saignements, hématome, ou infection, mais aussi un risque d’hémorragie peu probable lors de l’implantation et la réalisation de la craniotomie. Le phenotype dommageable present chez ce modele se developpe apres l'age d'euthanasie de ce projet.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements de tissus d’intérêts post-mortem et leurs analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires pour évaluer notre approche thérapeutique.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier la tolérance et l’efficacité dans l’ensemble de l’organisme de notre approche thérapeutique basée sur la thérapie cellulaire. En effet pour étudier ces aspects il est nécessaire d’utiliser un organisme comparable à la complexité de ce que l’on retrouve chez l’Homme. Il est donc toujours indispensable d’avoir recours à l’animal pour cette évaluation, et notamment un modèle animal de la pathologie pour une meilleure transposition des résultats chez l’homme. Choisir la souris et notamment le modèle murin de la pathologie pour ce projet nous permettra de collecter des données cruciales avant de passer chez l’Homme pour application clinique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait, nous avons établi qu’un nombre de 3 souris par groupe serait d’abord nécessaire pour valider la faisabilité et la tolérance de notre approche. En fonction des résultats obtenus avec ces premiers groupes réduits nous pourrons évaluer l’intérêt de poursuivre ou non le projet et ainsi utiliser le moins d’animaux possible. Puis nous avons défini que des groupes de 10 souris seraient nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité de l’approche sur le modèle pathologique. Ces effectifs permettront de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 45 souris sera utilisé au cours de ce projet.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une observation quotidienne et de soins adaptés. Le change (de la litière, abreuvement,nourriture) est réalisé 1 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction des besoins de la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de carré de coton de bâtonnet de bois à ronger et si nécessaire supplémenté de lanières de kraft, et de maison de type celldom. Les animaux d’étude seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée et un maintien de la température de l'animal pendant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir toute hypothermie. Nous utiliserons également un gel ophtalmique afin de prévenir toute sécheresse oculaire au cours de l'anesthésie. En post-opératoire, une surveillance renforcée des animaux sera assurée quotidiennement pendant 5 jours. Au moment de l'euthanasie, un sédatif sera administré à l'animal avant d'injecter le composé euthanasiant. La lignée peut présenter un phénotype dommageable mais nos animaux seront euthanasiés avant sa manifestation.
Choix des espèces
Il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la leucodystrophie métachromatique dans son ensemble, nous avons donc besoin de modèles animaux. Le modèle murin est particulièrement adapté (modification génétique possible, outils moléculaire disponible…) pour reproduire et étudier cette maladie et surtout pour l’évaluation d’un effet thérapeutique. En effet il existe une lignée de souris génétiquement modifiée qui reproduit les caractéristiques de la pathologie présentes chez l’Homme et nous permettra ainsi d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche. Les animaux seront utilisés à 9 semaines d’âge et suivies jusqu’à 19 semaines maximum pour la première étape du projet afin de juger de la faisabilité de l’approche sur un cerveau complètement développé. Pour l’évaluation de l’efficacité de notre approche, les souris seront utilisées à partir de 6 mois et suivies jusqu’à 12 mois. En effet, nous avons besoin d’évaluer notre approche dans un modèle symptomatique de la maladie et de suivre notre traitement sur 6 mois pour évaluer l’effet thérapeutique dans la durée.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 2/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.