Troubles nerveux

Au premier jour de leur vie, des souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau sous anesthésie générale, avant un prélèvement de queue à quatre semaines. 448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois, elles passent quatre tests comportementaux, dont la reconnaissance d'objet et l'interaction sociale, censés mesurer mémoire et anxiété, puis sont tuées à cinq mois pour prélever sang et cerveau. Le porteur admet que la manipulation des nouveau-nés peut conduire la mère à rejeter un ou deux petits, avec absence de tétée ou cannibalisme, atteintes qu'il classe pourtant dans un niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer MA est une maladie neurodégénérative, au cours de laquelle les cellules du cerveau dégénèrent. Elle affecte environ 1 million de personnes en France et il n’existe aucun traitement efficace à ce jour. Notre activité de recherche est dédiée à l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans la MA. L’objectif est de comprendre le fonctionnement de cette maladie, afin de trouver des moyens d’action dans le système nerveux qui permettront de ralentir le développement de la MA.

Bénéfices attendus

L’objectif final est d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par la maladie d'Alzheimer. Les bénéfices à plus court terme, concernent d'une part la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la MA et d'autre part de trouver des moyens d’action sur le système pour réduire le développement et l’agressivité de la MA.

Procédures

Les nouveaux-nés subiront au premier jour post-natal une injection de virus dans le cerveau sous anestésie générale et à 4 semaines un prélèvement de bout de queue (

Impact sur les animaux

Les nouveaux-nés subiront au premier jour post-natal une injection de virus dans le cerveau. Compte tenu de la manipulation des bébés, il est possible que la mère rejette un ou deux petits, se traduisant par l'absence de tétée et /ou du cannibalisme. Un prélèvement de bout de queue est réalisé pour le génotypage à l'âge de 4 semaines. A l'âge de 4 mois tous les animaux subiront 4 tests comportementaux tels que la reconnaissance d'objet et l'interaction sociale, destinés à explorer leurs capacités de mémorisation et leur niveau d'anxiété. A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde et analgésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Le sang et le cerveau sont prélevés pour effectuer des explorations biochimiques et histologiques.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, nous développons aussi des approches expérimentales in vitro dont les résultats doivent dans tous les cas être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle souris de la maladie d'Alzheimer. Ces souris représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - souris sauvages (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 -souris modèle de MA (mâles+ femelles) n= 7groupes x32 souris = 224 Soit 448 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions.

Raffinement

Tous les petits de la même fratrie seront injectés. Le génotypage permettra 4 semaines plus tard de les identifier. Les nouveau-nés opérés sont réchauffés sur une couverture chauffante de type bouillotte, et remis à leur mère. Les mères et leur nouveau-nés opérés seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (nids végétaux à base de fibres courtes de coton). Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Afin d'éviter un maximum la manipulation des petits et le possible rejet par leur mère nous éviterons de les peser, mais nous observerons tous les jours leur comportement, s'ils sont vigoureux, s’ils tètent, ainsi que leur taille en comparant tous les petits de la même fratrie.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour nos études, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées modèle de la maladie d’Alzheimer. 1) Stade premier jour post-natal, dans lequel les injections de virus seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de protéines d’intérêt dès les premiers jours de vie post-natale dans les neurones. 2) Stade juvénile 1 mois et adulte 2 mois, afin de tester des stades intermédiaires 3) Stade adulte à l’âge de 4 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle nous observons des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique. Le comportement des animaux sera testé à partir de 4 mois, et ce pendant environ 15 jours. 4) Stade adulte à l'âge de 5 mois. A ce stade les animaux seront mis à mort. Tous les animaux reçoivent une injection de virus à la naissance mais certains d'entre eux seront mis à mort à 1 et 2 mois sans participer aux tests comportementaux.

5 202 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue parce qu'elles auront été en contact avec une bactérie pathogène pour l'humain. Chacune subit une biopsie d'oreille par semaine pendant 42 jours, une prise de sang hebdomadaire pendant 42 à 92 jours, jusqu'à sept injections sous-cutanées et deux intramusculaires, et des piqûres de tiques dont les nymphes restent accrochées cinq jours. 216 souris sont utilisées uniquement pour produire des tiques infectées. L'infection par Borrelia peut provoquer des arthrites aiguës, une démarche anormale, une perte de tonicité et une paralysie des pattes, et le porteur écrit par ailleurs que les piqûres de tiques sont indolores pour l'animal.

Objectifs

La borréliose de Lyme (BL), maladie à transmission vectorielle prédominante en Europe, est causée par les spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato (sl). Cette maladie peut affecter divers tissus tels que la peau, le système nerveux, les articulations, le cœur, et occasionnellement, d'autres organes. La transmission des bactéries se fait par la morsure de tiques dures du genre Ixodes, parasites de nombreux hôtes, y compris petits et grands mammifères, oiseaux et reptiles. Les manifestations chroniques de la maladie incluent des complications neurologiques rares liées à l'infection par B. burgdorferi s.l. La pathogenèse de la maladie dépend de la génétique bactérienne, de la capacité de l'hôte à contrôler l'infection et des facteurs liés à la tique. 1. Objectifs Principaux du Projet : o Comprendre en détail les mécanismes de transmission de la maladie de Lyme par les tiques. o Identifier de nouveaux modèles murins d'infection à Borrelia reproduisant la gamme complète des symptômes humains en tirant parti de la diversité génétique de lignées murines pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. o Améliorer les connaissances pour une meilleure prise en charge des patients et des stratégies préventives. 2. Procédures Expérimentales : o Dans une première procédure, évaluer la sensibilité de 13 lignées murines après injection sous-cutanée de trois espèces de Borrelia burgdorferi européennes, choisies pour leur infectiosité élevée chez la souris de référence. o Dans une deuxième procédure, tester la réponse des souris à une infection naturelle par des tiques infectées par trois souches de la bactérie Borrelia. o Dans une troisième procédure, évaluer l'effet d'antibiotiques couramment utilisés dans le traitement de la borréliose de Lyme, ainsi qu'une combinaison de molécules agissant sur les formes persistantes de la bactérie. o Enfin, dans une quatrième procédure, évaluer l'effet protecteur de préparations vaccinales vis-à-vis de l'infection par des tiques infectées. Signification et Impact : • Contribuer à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie de Lyme. • Proposer de nouveaux modèles murins reflétant davantage la diversité des symptômes humains. • Tester l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à combler les lacunes dans la compréhension de la borréliose de Lyme, en mettant l'accent sur des approches novatrices pour les modèles murins, les traitements et les préventions, avec un objectif ultime d'amélioration des soins aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des biopsies d’oreille un fois par semaine pendant 42 jours. Cette procédure ne dure que quelques secondes. Des prélèvements de sang au niveau du sinus retro mandibulaire seront réalisés toutes les semaines (durée 30 secondes) pendant une période pouvant varier de 42 à 92 jours. Des injections par voie sous-cutanée (1 à 7 fois) et intramusculaire seront réalisées (2 fois). Chaque injection ne dure que quelques secondes. Les souris seront également soumises à des piqures de tiques. Les nymphes restent attachées pendant 5 jours et les larves 3 jours. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Douleur, lésion, maladie : arthrites aiguës (gonflement des articulations), atteintes neurologiques aiguës (mouvements limités, démarche anormale, manque de tonicité, paralysie des pattes) lors de l’infection par les bactéries Borrelia. Environnement non adapté. Il y aura isolement des animaux pendant la durée du gorgement des tiques, pour une durée inférieure à une semaine On peut observer une perte de poids éventuelle durant le gorgement des tiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été en contact avec un agent pathogène pour l’homme.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.

Réduction

Nous envisageons lors de la première procédure de travailler dans le cadre de l’expérience 1 sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées les plus sensibles aux trois souches de Borrelia. Les 8 individus seront répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de l’expérience 2, nous aurons 20 souris par groupe. Dans le cadre de la procédure 2, lors de l’expérience 1, le nombre de souris utilisées (216) pour l’obtention de tiques infectées est strictement lié à la biologie des tiques dont nous avons une excellente connaissance. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 10 individus par groupe pour pouvoir faire des mises à mort à différents temps et disposer de 2 individus dans le cadre des analyses que nous souhaitons mener. Dans le cadre de la troisième procédure, nous utiliserons 12 souris par groupe. Ces trois procédures nécessiteront lors de leur analyse d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. Dans le cadre de la quatrième procédure, nous avons choisi d’utiliser 20 souris par vaccins. Ce chiffre est issu d’expériences déjà menées et qui ont montré que la sensibilité des expériences qui seront menées afin de démontrer l’efficacité d’un vaccin nécessite ce nombre d’animaux. En supposant un effet cage d’un certain niveau, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, un risque à 5% et une puissance à 80% de détecter des effets marqués ou forts.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Les atteintes neurologiques seront évaluées plus précisément par l’utilisation de tests comportementaux. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Un renforcement de l’enrichissement sera effectué notamment dans le cadre de la procédure 1 afin que les animaux soient dans une ambiance confortable. Dans le cadre des procédures au cours de laquelle les animaux seront infectés par des piqûres de tique, les souris devront être isolées et nous ajouterons dans la cage des objets pour les distraire : bâtonnets, balles, coton. Les cages étant totalement transparentes et filtrantes, un contact olfactif, visuel et acoustique sera possible entre les animaux.

Choix des espèces

La souris est reconnue comme une espèce qui développe au moins certains des symptômes de la maladie de Lyme. Nous avons mis au point chez la souris un modèle expérimental d'infection prenant en compte les différentes conditions qui seront testées ici (salive de tiques, infection par des tiques). C'est la seule espèce à posséder des lignées présentant une large diversité génétique telles que celles du Collaborative Cross. Les souris seront des femelles et des mâles âgés de 5 à 7 semaines. S’il s’avère que l’un des deux sexes est plus sensible que l’autre à l’infection, nous n’utiliserons alors qu’un sexe sur les deux. Nous souhaitons que le système immunitaire soit mature lors de l’infection. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 42j et nous souhaitons que les souris aient au maximum un âge de 12 semaines à la fin de l’expérience pour pouvoir les comparer avec les données déjà obtenues sur d’autres souris.

Pour corriger l'hyperexcitabilité cérébrale associée à la maladie d'Alzheimer, 918 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un prélèvement d'oreille pour le génotypage, une chirurgie cérébrale de vingt minutes suivie d'une heure de pose d'électrodes, puis quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré vingt-quatre heures sur vingt-quatre. Des tests sont répétés chaque mois pendant une semaine, dix minutes trois fois pour la mémoire et une heure en arène pour les mouvements, sans que le porteur nomme les épreuves employées. Il annonce de nombreux critères permettant de détecter une détresse et d'arrêter la procédure, sans en citer un seul.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux pour le génotypage auront unprélèvement d'un bout d'oreille (3mm maximum). Les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement un léger stress lors de la contention et une douleur légère pendant le prélèvement. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles génétiquement modifiésont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Pour savoir si les animaux sont porteurs du gêne d'intérêt, une biopsie d'oreille sera faite entre 7 jours et 15 jours après la naissance Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés. Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

1 280 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles subissant sept séances d'ouverture de la barrière sang-cerveau par ultrasons et quatorze injections intraveineuses sous anesthésie. S'y ajoutent, pour d'autres, une chirurgie cérébrale de trente minutes, un prélèvement de queue vers le dixième jour de vie, et vingt et un essais de nage de quatre-vingt-dix secondes dans un bassin circulaire répartis sur six jours. Le porteur reconnaît que ces souris développent vers sept ou huit mois une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement lié aux difficultés d'accès à la nourriture, et que l'épreuve de piscine peut provoquer une hypothermie. Les retombées annoncées pour les malades d'Alzheimer restent au conditionnel et à long terme, quand la paralysie, elle, est programmée par le génotype des animaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. L’autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients et s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, une technologie de molécules thérapeutiques de petites tailles, appelée « nano-anticorps » a été développé, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Par ailleurs, un moyen d’ouvrir cette barrière a récemment été décrit par l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, permettant de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autoriser la pénétration de molécules thérapeutiques. De plus, le développement des thérapies géniques a aussi ouvert de nouvelles opportunités pour surmonter les limitations dues à la présence de cette barrière sang-cerveau. En conséquence, ce projet vise à combiner ces technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. En particulier, l’utilisation de nano-anticorps visant les agrégats de protéines Abéta et tau, associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau ou à l’emploi d’une thérapie génique, pouvant permettre de freiner la propagation de ces agrégats d’une aire cérébrale à une autre. Ce projet sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine Abéta et tau, caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante combinant les technologies de nano-anticorps visant les agrégats des protéines Abéta et tau, et celles des thérapies géniques. L’efficacité de cette première stratégie sera comparée avec l'utilisation de nano-anticorps associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau pour faciliter leur passage. Les multiples tentatives d’utilisations d’anticorps classiques dirigés contre les protéines Abéta et tau pour traiter la maladie d'Alzheimer ont montrées, jusqu'à présent, une efficacité clinique limitée. Cela est dû à la grande taille des anticorps et à l’existence de la barrière sang-cerveau qui réduit leur efficacité. Les nano-anticorps sont beaucoup plus petit que des anticorps classiques et ont un potentiel plus élevé de traverser cette barrière et atteindre des cibles thérapeutiques dans le tissu cérébral. Par ailleurs, plusieurs études récentes chez l’animal ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons et de microbulles, favorisant le passage d’anticorps anti-Abéta et montrant une diminution des dépôts dans le cerveau. De plus, plusieurs équipes de recherches ont récemment montrées que l’utilisation de thérapies géniques pouvait permettre de libérer à long terme des molécules thérapeutiques ciblant les agrégats de protéine tau directement dans le cerveau. L’utilisation de nano-anticorps en combinaison avec l’ouverture de la barrière sang-cerveau ou produits dans le cerveau par thérapie génique pourrait donc être une stratégie probante afin de délivrer des molécules thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques sont des modèles de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces (entre 5 et 7 mois selon les souris). Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée du projet (examen et pesée 1-2 fois par semaine). -Tous les animaux produits auront un prélèvement d'un fragment de queue à l'âge de 7 à 10 jours pour définir leur génotype (patrimoine génétique) (moins d’une minute par animal, une fois) -Pour une partie des animaux une chirurgie cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes environ et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux des séances d'ultrasons seront effectuées pour ouvrir transitoirement et sans effets secondaires la barrière sang-cerveau et faciliter l’accès des thérapies au cerveau. 7 séances d’ouveture (10 minutes par séance) couplée à deux injections intraveineuses (14 injections au total, durée de chaque injection : 30 secondes), le tout sous anesthésie générale et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux, on procédera à des tests de mémoire non-invasifs sur une durée de 9 jours : 1) une observation du comportement spontané dans une enceinte carrée (3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours) et 2) une observation d’un comportement inné de nage dans un bassin circulaire (21 essais de 90 secondes max. distribués sur 6 jours de tests). Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse vigile (1 minute par animal, une fois) A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 7-8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur génotype. Les chirurgies sous anesthésie générale sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. L’inoculation intra-cérébrale de matériel accélérant la propagation des lésions neuropathologiques pourrait également favoriser l’apparition d’effets indésirables à un âge où ils ne sont normalement pas observés (entre 4 et 6 mois). Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané et inné de l’animal, impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement et un stress plus important lors de l’épreuve de nage en piscine, pouvant également induire une hypothermie.

Devenir

A l’issue de toute les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.

Remplacement

L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études « vitro », dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permi ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux produits (1280) et maintenus sur site est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature.

Raffinement

L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes ou en trio (cages de reproducteurs) et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme de suivi rapproché de nos lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé à partir de 4-5 mois et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale. Les étapes chirurgicales du projet (inoculations intracérébrales et ouvertures de la barrière « sang-cerveau ») sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, déshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. Les chirurgies d’inoculation intra-cérébrale pourraient de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant à priori pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel envirronnment avant les tests pour minimiser le stress induit.). Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris. En fin d’étude toutes les souris seront euthanasiées par des méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux reproducteurs pour générer nos lots expérimentaux seront utilisés de 2 mois à 8 mois maximum. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 6 mois). Les traitements thérapeutiques seront eux aussi initiés à 3 ou 4 mois (début des lésions) sur une durée de 6-7 semaines avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 5 ou 7 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.

Une trentaine de minutes de chirurgie crânienne, répétée trois mois plus tard pour près de la moitié d'entre elles, puis six séries de tests moteurs étalées sur un an. 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des fibrilles d'alpha-synucléine leur sont injectées dans le cerveau pour y provoquer une maladie de Parkinson, avec ralentissement des mouvements et perte d'équilibre attendus trois à six mois plus tard chez les souris non traitées. Le porteur nomme les tests, rotarod pour la coordination, épreuve de balance, mesure de force musculaire, et retient la souris parce que son petit cerveau favorise la diffusion des fibrilles, avec des animaux inoculés à 12 mois et suivis jusqu'à 24 mois pour reproduire l'âge tardif de la maladie humaine.

Objectifs

Notre objectif est d’évaluer l’effet thérapeutique d’un vecteur viral de type adénovirus (AAV) dans le cadre d’un projet de thérapie génique ciblant la maladie de Parkinson, en utilisant un modèle de souris âgées de plus de 12 mois atteintes de la maladie de Parkinson. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par la mort d’un certain type de neurones (dopaminergiques) et dont la fréquence augmente chez des personnes de plus de 60 ans. Cette affection provoque des difficultés motrices importantes voire invalidantes. Même s’il existe des traitements qui peuvent améliorer les symptômes, il n’existe pas à ce jour de traitement curatif de la pathologie. L’accumulation dans certains neurones d’agrégats de protéines composés d’alpha-synucléine est un mécanisme central de la maladie humaine qui conduit à la mort des neurones. Pour mettre au point une thérapie génique innovante, notre objectif est de créer un modèle d’étude de la maladie pertinent, pour cela nous utiliserons le modèle souris, dans lequel nous inoculerons des agrégats (fibrilles) d’alpha-synucléine dans le cerveau. Deux études ont déjà pré-établi la faisabilité de ce type de modélisation. Pour mimer la phase la plus sévère de la maladie, nous devrons recréer les conditions pathologiques chez des souris assez âgées. Nous inoculerons donc les fibrilles chez des souris âgées de 12 mois, pour mimer l’âge tardif de survenue chez l’homme. Nous étudierons les effets de transfert des gènes thérapeutiques introduits via des vecteurs viraux dans le cerveau de ces souris, pour contrecarrer les mécanismes de la maladie. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique sur les paramètres pathologiques, cliniques, cellulaires et biochimiques, des souris-modèles ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement chez l’homme. En résumé, l’objectif du projet est d’établir un modèle préclinique pour tester un nouveau vecteur de thérapie génique, constituant ainsi la première étape d’une démarche translationnelle en direction de la maladie humaine. Cette démarche nécessite l’établissement d’une preuve de concept thérapeutique dans l’espèce souris.

Bénéfices attendus

La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme (plus de 2000 patients, atteints de diverses maladies, ont reçu des vecteurs AAV). Elle est considérée comme un des principaux espoirs de traitement curatif, à condition de prouver ses effets, dans un premier temps, dans des modèles animaux pertinents. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère dont la fréquence augmente chez les personnes de plus de 60 ans. Elle n’a pas de traitement curatif et son évolution est invalidante. Cette maladie est caractérisée par la mort de neurones dopaminergiques entraînée par l’accumulation anormale d’agrégats de protéines riches en alpha-synucléine (une protéine présente normalement sous forme non agrégée dans les neurones). Pour tester un traitement innovant notre objectif est de créer un modèle d’étude pertinent de la maladie chez la souris, en inoculant des fibrilles d’alpha-synucléine dans le cerveau. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.

Procédures

Chirurgie : Préparation de l’acte chirurgical et de l’anesthésie -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Acte chirurgical : injection de fibrilles et/ou de vecteur thérapeutique et/ou d’une solution saline -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par souris et par jour, durant 5 jours consécutifs Tous les 2 mois, 6 fois au total Tests comportementaux : Trois types de tests comportementaux seront réalisés tous les 2 mois après l’injection de fibrilles sur afin d’évaluer la balance, la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le cerveau des souris pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Parkinson. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour cad 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de balance Durée : 20 minutes par jour Répétition : 4 jours consécutifs Test 3 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 3 jours consécutifs Ces trois types de tests seront réalisés au total 6 fois au maximum pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Les complications liées à aux chirurgies sont rares mais peuvent entrainer : - une altération grave du comportement, - des séquelles de traumatisme non-résolues par traitement, - un incident d’anesthésie avec séquelles (troubles respiratoires, fausse déglutition), - une hémorragie sévère en cours de chirurgie, - une perte de poids au cours de la semaine suivant l’intervention. L’injection de fibrilles d’alpha-synucléine entrainera un développement progressif de la maladie de Parkinson qui se traduira par des déficits moteurs (ralentissement des mouvements, perte d’équilibre). Ces symptômes devraient apparaitre environ 3 à 6 mois après l’injection de fibrilles dans le groupe des souris non traitées par vecteur thérapeutique. Une perte de poids peut en découler.

Devenir

A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d'effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques. Les cerveaux et les foies de ces animaux seront prélevés. Le but est de regarder l’effet des vecteurs thérapeutiques sur les marqueurs de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Toutes les constructions génétiques (vecteurs viraux) utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité des constructions génétiques pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées nous permettant d’obtenir des données statistiquement significatives pour évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une large recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche bibliographique nous a permis d'optimiser nos procédures et le nombre d'animaux à utiliser afin d'obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum. Ce nombre, validé par le un logiciel spécialisé, permettra de fournir un résultat fiable et statistiquement analysable pour chaque sous-groupe.

Raffinement

Pour l'administration des fibrilles et du vecteur thérapeutique, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure. Nous surveillerons l’état de santé des souris tout au long de l’expérience, et de manière accrue en post-opératoire. Cela permettra une intervention immédiate et de appropriée si des signes de souffrance apparaissent et les points limites sont atteints. Tout au long de l’expérience un suivi précis des souris sera mis en place : pesées et observations hebdomadaires des animaux. L'application de critères de points limites permettra de veiller au bien-être des animaux. Afin de suivre l’apparition des signes cliniques de la maladie de Parkinson et d’évaluer l’effet du vecteur thérapeutique sur la maladie, un suivi précis des animaux sera mis en place à + 2 mois post-opératoire, âge à partir duquel les premiers signes cliniques de la maladie de Parkinson devraient apparaître : mise en place de tests de comportement tous les 2 mois afin de suivre une éventuelle modification du comportement de l’animal et le développement de déficits moteurs. Les souris seront habituées progressivement aux protocoles comportementaux et aux examinateurs. Cela permettra d’avoir un suivi régulier et proche des animaux. Enfin, nous assurerons le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation en limitant leur angoisse grâce au suivi des conditions d’hébergement, et d’utilisation de cages proposant un environnement riche.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’établissement d’un modèle original chez la souris de la maladie de Parkinson à un stade avancé permettra des études des mécanismes de la maladie et permettra également de tester des traitements ; - l’existence de modèles souris de maladie peu sévère basés sur l’inoculation de fibrilles établit la faisabilité de notre projet ; - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer secondairement chez le primate ; - la petite taille du cerveau de souris est propice à la diffusion étendue des fibrilles, ainsi qu’à la diffusion du vecteur thérapeutique à partir de son point d’injection ; - la maitrise par notre équipe des tests moteurs chez la souris permet une étude fine des défauts neurologiques. Nous avons déjà testé des vecteurs comparables dans des souris modèles d’autres maladies. Nous utiliserons des souris âgées de 12 mois au moment de l’injection des fibrilles accompagnée ou non d’une injection de vecteur thérapeutique. Cela permettra de mimer l’âge avancé de la maladie humaine. Le comportement de ces souris sera étudié entre l’âge de 14 et 24 mois.