Troubles nerveux

90 souris et 80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie pour une injection intrathécale ou intracérébrale d'un candidat médicament, avant d'être tué par surdose d'anesthésique et exsanguination. Le projet étudie la distribution d'oligonucléotides dans le système nerveux au stade préclinique. Le porteur affirme que ce degré de complexité ne peut être atteint qu'avec un modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives sont causées par la mort de neurones, ce qui affecte le fonctionnement du système nerveux de manière chronique et progressive. Ces maladies sont fortement invalidantes et peuvent affecter la motricité, et les fonctions cognitives. Pour être efficace, un médicament doit pouvoir atteindre sa cible neuronale pour agir et ralentir les procéssus neurodégénératifs. Pour atteindre le système nerveux, les médicaments doivent traverser la barrière hématoencéphalique, ou, être directement injectés dans l'environnement neuronal. Cette dernière approche est particulièrement appropriée pour des composés tels que des peptides ou des nucléotides. L'objectif est d'étudier la distribution de candidats-médicaments, tels que les oligonucléotides antisens, dans le système nerveux de rongeurs après injections intra-thécales ou intra-cérébrales.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour des maladies neurodégénératives. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les animaux subiront une seule opération chirurgicale (injection intrathécale ou injection intra-cérébrale), sous anesthésie. Les stratégies d'anesthésies et d'analgésies impliquent des injections intra-péritonéales et sous-cutanées, ce qui peut induire à stress, avant la chirurgie et juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un acte chirurgical, sous anesthésie et analgésie, pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Les injections d'analgésiques et d'anesthésiques peuvent induire un stress lors de l'administration. La classe de composé utilisée ici n'est pas décrite comme toxique dans la littérature, cependant un effet indésirable des traitements ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique et par exsanguination.

Remplacement

La distribution de composés dans le système nerveux dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide qui entourne les neurones, et la capture par différents types de cellules. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 10 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec 10 souris ou 10 rats par groupe.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (rats et souris) et 4 au maximum (souris uniquement), avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs, dont les souris et les rats, possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Les rongeurs sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris ou des rats. Les procédures expérimentales utiliseront soit des souris, soit des rats. Le choix de l'espèce, pour chaque procédure, est motivée par les séquences des oligonucléotides, ainsi que par les analyses réalisées avec les échantillons biologiques.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit ou neuf semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections de virus dès les premiers jours de vie, puis huit tests dont l'immersion de la queue en bain chaud et la plaque chauffante pour mesurer leur sensibilité à la douleur, et une mesure musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise une "preuve de concept" de thérapie génique présentée comme une étape vers les essais cliniques, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme que les effets sur les nerfs et les muscles ne s'évaluent que sur l'organisme entier, hors de portée d'une culture de cellules.

Objectifs

Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.

Procédures

Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles passent par des tests de force et de coordination, suspension à une grille retournée, tapis roulant et barre crantée, puis une mesure de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche une "preuve de concept thérapeutique" par croisement génétique pour une maladie qu'il décrit comme incurable, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme qu'une étude sur cellules ne peut suffire car les effets sur la coordination et la force ne s'évaluent que sur l'organisme entier.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.

Procédures

Une partie des animaux (14) sera utilisée pour évaluer le phénotype des souris transgéniques (analyses purement observatoires de la naissance à 8 semaines). Une partie sera utilisée uniquement pour les croisements (21 ou 42). L’autre partie des animaux (entre 80 et 160 en fonction des résultats obtenus) seront soumis à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire et la coordination motrice. Pour évaluer leur force générale, leur durée de suspension à une grille retournée sera mesurée (durée 3x60s). Pour évaluer leur coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant (max 60s) et une barre crantée (10x30s environ). Pour évaluer la force musculaire développée, la mesure des propriétés contractiles se fera sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Pour les animaux transgéniques, la modulation d’expression du gène d’intérêt peut engendrer une faiblesse musculaire, nous effectuerons une étude de phénotype dommageable. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force générale, le fait d’être suspendu à une grille engendre du stress physique chez l’animal.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement quotidiennement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. Des nids seront disposés dans chaque cage et la litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Si les animaux transgéniques sont très faibles, de la nourriture en gel leur sera procurée. La plupart des tests réalisés sur les animaux dans cette étude sont non invasifs, ce qui limite la probabilité d’apparition de douleur. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de douleur observée au cours de l’étude, un analgésique sera administré (buprénorphine à différentes doses selon l'intensité de la douleur). L'étude sera stoppée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous ferons un croisement génétique de souris et nous étudierons les effets de ce croisement à 8 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts moteurs et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si la modulation de ce gène est bénéfique.