Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
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- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
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- Troubles immunitaires
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- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etudes préliminaires des mécanismes d’action sous-tendant l’effet anti-épileptique de GAO-3-02
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche pharmacologiquement, sur animal vigile, soit une crise convulsive généralisée suivie pendant trente minutes puis interrompue par la mise à mort, soit un état de mal épileptique arrêté au bout de trente minutes. Tous les rats sont tués pour prélever leur cerveau et mener des analyses ex vivo. Le porteur revendique un "besoin fort" de nouveaux antiépileptiques et affirme que ni les modèles in vitro ni in silico ne peuvent reproduire les crises et les comportements associés.
Objectifs
Les épilepsies regroupent un ensemble de syndromes neurologiques se caractérisant par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, allant des absences aux convulsions. Leur origine peut être génétique mais le plus souvent elle est associée à une agression cérébrale sévère initiale, telle qu'un traumatisme crânien, une infection, ou un état de mal épileptique (EME). Bien qu’une épilepsie puisse se manifester à tout moment de la vie, les pics d’occurrence sont observés avant l’âge de 20 ans et après 60 ans. Plus de 20 médicaments sont disponibles pour contrôler les crises. Toutefois, un patient sur trois continue d’en faire malgré la prise de médicaments, et un grand nombre de ceux dont les crises sont contrôlées par ces médicaments se plaint de comorbidités affectant gravement leur qualité de vie. Il existe donc un besoin fort et urgent de développer de nouveaux candidats médicaments permettant non seulement de contrôler les crises pour ceux qui ne répondent pas aux médicaments, mais aussi de réduire le degré d’inconfort qui compromet une bonne observance thérapeutique. Le candidat médicament CM1 a été récemment développé pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Il s’agit d’un candidat-médicament de nature lipidique, dont le mode d’action diffère totalement des anti-épileptiques classiques. Il possède des effets anti-crises d’épilepsie (occurrence d’une seule crise) et des effets anti-épileptiques (occurrence de plusieurs crises spontanées), tout en protégeant certaines fonctions cognitives. Ces observations ont été réalisées dans le cadre d'un projet précédent. Des études in vitro et ex vivo ont montré : 1) que les effets anti-crises pouvaient passer par une augmentation des processus réduisant l’activité cérébrale ; 2) que l’activation d’un récepteur particulier, appelé ici CM1-R1, pouvait potentiellement être responsable des effets bénéfiques du CM1 ; et 3) que le CM1 pouvait modifier le profil lipidique cérébral. Les objectifs de ce projet sont d'apporter des réponses: 1) quant aux mécanismes par lesquels le CM1 augmente la réduction de l’activité neuronale ; 2) sur l’implication du récepteur CM1-R1 et d’un homologue R2 sur les mécanismes décrits en (1) ; 3) quant aux effets du CM1 sur les mécanismes de neurotransmission GABAergique et Glutamatergique, et l’implication de 2 récepteurs dans ces effets ; et enfin 4) sur les modifications de la composition lipidique cérébrale induites par le CM1.
Bénéfices attendus
Les épilepsies constitutent la seconde maladie neurologique après la migraine, et affectent près de 70 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent, mais malgré cela, près d’un tiers de patients continuent de faire de crises malgré la prise de ces traitements. En outre, parmi les personnes qui répondent aux traitements existants, le ralentissement de l’activité cérébrale qu’ils entrainent constitue un effet secondaire fortement handicapant pour une grande part d’entre elles, réduisant de ce fait l’observance du traitement. II est donc impératif de poursuivre le développement de nouveaux traitements, capables non seulement de réduire le nombre de crises ou leur sévérité, mais aussi de maintenir, voire même d’améliorer les capacités cognitives (mémoire). Le projet s’appuie sur le développement d’un potentiel candidat médicament, CM1, dont il a été montré qu’il exerce une activité anti-crise, anti-épileptique et cela sans altérer, voire même en améliorant, les capacités cognitives. L’objectif de ce projet est d’apporter des premiers mécanismes d’action in vivo de cette molécule, étape indispensable à la poursuite du développement de ce potentiel candidat médicament.
Procédures
Dans la procédure n°1, les animaux utilisés seront des rats soumis à un processus de déclenchement unique d’une crise convulsivante généralisée aiguë, induite pharmacologiquement. Les rats sont obligatoirement vigiles, car dans le cas contraire, aucune crise ne pourrait être induite. Dans les procédures 2 à 4, les animaux utilisés seront des jeunes rats soumis à un état de mal épileptique induit pharmacologiquement. Cette induction pharmacologique se fait sur animal vigile. L’état de mal est stoppé au bout de 30 min. Dans les procédures 2 et 4, il est important de chasser le sang des capillaires sanguins de tout l’organisme, en particulier le cerveau.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur 4 procédures, réalisées sur le rat. Pour la procédure n°1, les crises d’épilepsies généralisées, de classe sévère, seront suivies sur une période n’excédant pas 30 minutes, au-delà desquelles les rats seront euthanasiés. Les rats développent en général les premières crises tonico-cloniques généralisées (GTCS) dans les 10-20 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Si le traitement testé a un effet pro-convulsivant, les rats développeront en moyenne les GTCS avant les 10 premières minutes. Au contraire, si le traitement a un effet anti-crise, les GTCS apparaitront après 20 minutes. Ce modèle, très bien standardisé au niveau international, n’excède pas 30 minutes ; en effet, on considère que l’effet protecteur est total quand aucune GTCS n'est observée dans les 30 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Les procédures 2 à 4 seront réalisées chez le rat après un état de mal épileptique (EME, série de crises convulsivantes en continu sur 30 minutes) induit pharmacologiquement à l’âge de 21 jours. A l’issue des 30 min d’EME, il sera stoppé pharmacologiquement. L’EME induit une douleur de type sévère pendant 3 à 5 jours, pendant laquelle aucun analgésique ne peut être administré en raison du blocage provoqué sur le processus même de développement d’une épilepsie. Sur ces 3 à 5 jours, durant lesquels le poids est contrôlé quotidiennement, les ratons ont une activité réduite, avec dos voussé.
Devenir
Pour la procédure n°1, les rats auront tous été soumis à un protocole d’induction d’une crise convulsivante généralisée. Ils seront tous mis à mort pour éviter de prolonger un état épileptique. Pour les procédures n°2 à 4, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés, soit pour des études histologiques, biochimiques ou électrophysiologiques ex vivo.
Remplacement
Compte tenu du fait que les épilepsies regroupent une diversité de syndromes, il existe à ce jour très peu d’alternatives permettant d’évaluer les différents aspects de la pathologie sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, l’analyse de comportements complexes, comme ceux de l’anxiété et de l’apprentissage spatial, et de surcroît la manifestation de crises épileptiques ne peuvent être appréhendées au niveau préclinique autrement qu’in vivo chez des vertébrés, et ne peut aujourd’hui être remplacée par des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation d’un total de 730 rats sur une durée de 5 ans. Ce nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en ne compromettant pas l’atteinte des objectifs de l’étude. Il a été déterminé à l’aide d’outils statistiques, en tenant compte des résultats d’études antérieures (notamment de la variabilité observée) dans le laboratoire sur ces mêmes modèles. Pour les procédures 1 et 2, des étapes GO/NOGO ont été mises en place. En effet, elles ont pour objectifs d’évaluer l’implication de 2 récepteurs potentiels du candidat médicament testé dans les effets observés. Nous commencerons par tester l’effet du récepteur R1. Si tout l’effet du candidat médicament passe par ce récepteur R1, alors les expérimentations visant à étudier l’implications de R2 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux mâles arriveront suffisamment tôt pour permettre une semaine d'acclimatation avant le début des procédures. Leur poids sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être, pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Plus spécifiquement, pour la procédure n°1, qui dure au maximum 30 minutes, la mise à mort de l’animal sera réalisée dès qu’il a atteint la première crise convulsivante généralisée. Pour les procédures n°2 à 4, l’état de mal épileptique induit par la pilocarpine (Pilo-EME) entraîne une souffrance sévère sur les 3 à 5 premiers jours, avec perte de poids pouvant atteindre 25%. Afin de favoriser le recouvrement, nous maintenons les ratons avec la femelle nourricière jusqu’au terme de ces 5 jours (26 jours d’âge). En outre, nous massons quotidiennement l’abdomen des ratons pour stimuler à nouveau le transit intestinal, temporairement interrompu par l’administration de scopolamine (antagoniste des récepteurs muscariniques centraux et périphériques). Depuis que nous avons introduit ces deux améliorations, le taux de survie des ratons est passé de 75% à 95%.
Choix des espèces
L’ensemble des données antérieures de l’équipe a été obtenu sur des rats Sprague-Dawley. L’utilisation de la même souche de rat nous permettra de comparer les données de ce projet avec celles des études antérieures de l’équipe. Enfin, chaque fois que cela est possible, le rat est choisi à la souris du fait qu’il est physiologiquement, génétiquement et morphologiquement plus proche de l’humain. En outre, son répertoire comportemental, notamment au regard de certaines compétences cognitives, le rend plus pertinent que la souris. Nous travaillons sur des ratons jeunes (3 semaines), car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non génétique) chez l’humain se déclare chez le jeune de moins de 20 ans.
Rôle d’un dysfonctionnement lysosomal dans les pertes de neurones et de synapses dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer reçoivent une injection intracérébrale unique sous anesthésie, avec un risque d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire ou de douleurs post-opératoires. Une partie est tuée pour prélever le cerveau, l'autre tuée sans prélèvement pour l'entretien de la colonie. Le porteur cherche à savoir si moduler les lysosomes prévient la perte de neurones et affirme qu'aucune méthode autre que le modèle animal ne permet d'étudier cette dégénérescence.
Objectifs
Au cours de la maladie d’Alzheimer (MA), des pertes de neurones et de synapses se produisent dans des régions particulières du cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Cependant, le mécanisme des pertes neuronales reste mal connu. Des études ont montré une altération des lysosomes, de petits organelles intraneuronaux chargés de la dégradation des protéines. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans la MA pourraient être dues à cette altération des lysosomes. Pour cela nous allons déterminer si des traitements modifiant le fonctionnement des lysosomes permettent de prévenir les pertes de neurones et de synapses dans un modèle murin de MA.
Bénéfices attendus
Les mécanismes des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer (MA) sont encore très mal connus, et ce projet a pour objectif de tester un mécanisme qui pourrait orienter vers une thérapeutique. En effet, ces études permettront de déterminer si une modulation du fonctionnement lysosomal est une cible thérapeutique envisageable contre la MA.
Procédures
Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de neurones et de synapses sera effectué. Les souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, après avoir reçu l’injection en sous-cutanée d’un analgésique. L'analgésique sera également injecté en post-opératoire. Cette procédure durera une heure. Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien pour prélèvement et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris APPxPS1-KI développent spontanément une pathologie neurodégénérative avec l'âge, mais elles seront euthanasiées avant l'apparition d'un phénotype dommageable. La contention des souris pour l'injection d'un analgésique avant et après la chirurgie ou avant l'euthanasie peut entraîner peur et stress. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient souffrir de douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.
Devenir
Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement du cerveau et analyses, et l'autre partie euthanasiée sans prélèvement (maintien de la colonie).
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et synapses adultes se produisant dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Les 700 souris générées permettent (1) de renouveler les reproducteurs, (2) de réaliser les injections intracérébrales, et (3) de réaliser des analyses ne nécessitant pas de procédure expérimentale mais seulement la collecte de tissus après une procédure d’euthanasie. Le nombre d’animaux utilisés pour les injections intracérébrales (280) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, l’avis du vétérinaire sera demandé, et s'il le recommande les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance. Les souris sont anesthésiées durant la chirurgue, et nous administrons un antalgique en pré- et postopératoire pour éviter les douleurs post-opératoires suite à l’injection intracérébrale.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris transgéniques, modèle murin de maladie d'Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Les injections intracérébrales seront effectuées à 3 mois, avant que les pertes de neurones et de synapses ne soient observées chez les souris, et leurs effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 8 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.
Evaluation de la distribution tissulaire des radiotraceurs dans un modèle rongeur.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Rats : 750
1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va de l'absence de réveil à modérée. Sous anesthésie, ils reçoivent un cathéter veineux et fémoral, une injection de composé radiomarqué puis jusqu'à trente prélèvements artériels au cours de séances d'imagerie de deux heures. Tous sont ensuite tués pour extraire leurs organes. Le porteur qualifie les retombées de "majeures" pour la connaissance de la distribution des médicaments et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut évaluer cette distribution tissulaire.
Objectifs
L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments radiomarqués d’intérêt chez le rongeur en utilisant une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant aux isotopes utilisés et qui sont également utilisés en médecine humaine. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés concernent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction et également les neuroprotecteurs. Plusieurs séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le rongeur. Afin d’évaluer intégralement l’exposition tissulaire, la pharmacocinétique du traceur et du candidat médicament seront également étudiés.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations pertinentes sur l’exposition tissulaire et sur les spécificités de la distribution et de l’élimination des médicaments.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Pose d’un cathéter veineux (30 secondes) et fémoral (5 minutes) • Injection d’un radiotraceur associé ou non à un candidat médicament (1min) • Réalisation de prélèvements artériels sous anesthésie gazeuse (30 prélèvements qui durés 2-3 secondes espacés sur 120 minutes au maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : Les rongeurs seront anesthésiés lors des sessions d’imagerie (2h maximum). Lors du réveil les rongeurs peuvent être désorientées et stressées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc..., afin d’évaluer l’exposition tissulaire par le radiotraceur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier l’exposition tissulaire par le radiotraceur en présence et en absence de candidat médicament.
Réduction
L’utilisation des différentes modalités d’imagerie décrites permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.
Raffinement
Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue après à la réception des animaux. Ils seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés en groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions, avec un maintien et une surveillance de la température et du rythme respiratoire. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ces espèces présentent l’avantage d’être particulièrement adaptées aux études d’imagerie par TEP (Tomograhie par émission de positons) précliniques. Un certain nombre d’étude ont déjà été publiées dans la littérature ce qui nous permettra de limiter le recours aux rongeurs. L’évaluation de la distribution tissulaire nécessite des tissus pleinement développés (récepteurs, transporteurs, fonction hépatique etc..) et donc les rongeurs utilisés seront au stade adulte (5 semaines à 8 semaines). Le projet sera conduit sur des individus adultes (maturité et développement complet atteint).
Évaluation des vésicules sur la protection du cerveau du nouveau-né lors d’un accouchement avec complications
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
286 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À 12 jours de vie, les ratons sont séparés de leur mère, subissent une incision au cou pour isoler la carotide puis 90 minutes d'hypoxie qui provoque une hyperactivité proche de crises d'épilepsie, avant une injection de vésicules extracellulaires, le porteur signalant 10 % de mortalité. Tous sont ensuite tués pour prélever leur cerveau. L'effet neuroprotecteur espéré chez le nouveau-né humain reste une hypothèse à démontrer, et le porteur affirme qu'un organoïde cérébral in vitro, mené en parallèle, ne peut pas remplacer l'animal in vivo.
Objectifs
Deux nouveau-nés pour mille présentent des lésions cérébrales d’origine vasculaires induites lors de leur naissance difficile. Ces affections sont à l’origine de troubles neurologiques moteurs et cognitifs complexes à traiter. Des prises en charge sont connues, comme l’abaissement de la température cérébrale du nouveau-né. Ce procédé n’est que partiellement efficace, 50% des nourrissons traités développent encore des troubles neurologiques. Il y a aussi l’utilisation de cellules souches fœtales. Mais cette prise en charge présente certains obstacles : variabilité des cellules lors de leur préparation au laboratoire, rejet de greffe possible, problèmes de sécurité et d’éthiques liés à l’injection de cellules souches fœtales vivantes provenant de prélèvement en fin de grossesse. Il existe des cellules souches générées au laboratoire, qui lèvent ces obstacles. Elles sont dotées de qualités similaires aux cellules souches embryonnaires, elles peuvent être produites en grande quantité et sont immortelles. En plus, il est possible de récolter les vésicules extracellulaires des cellules souches. Ces vésicules extracellulaires sont de très petits sacs contenant des molécules thérapeutiques intéressantes pour soigner les lésions cérébrales, elles servent à communiquer avec des cellules cibles présentes dans leur microenvironnement pour en moduler le fonctionnement, de plus, leur contenu peut être modifié en incorporant des protéines connues pour leur effet bénéfiques. Les vésicules extracellulaires sont connues pour favoriser la récupération fonctionnelle notamment dans un modèle d’hémorragie intra-cellulaire chez le rat, ou lors de la protection des fonctions cérébrales dans un modèle chez le mouton. L’objectif de ce projet est de tester la neuro-protection des vésicules extracellulaires grâce à un modèle de lésion cérébrale chez le raton à 12 jours de vie (correspondant à un nouveau-né humain). Le contenu des vésicules extracellulaires sera modifié par l’enrichissement ou l’appauvrissement de la protéine d’intérêt connue pour contrôler l’inflammation et atténuer les lésions cérébrales. Nous montrerons que la protéine d’intérêt est plus efficace lorsqu’elle est administrée avec les vésicules extracellulaires. Nous procéderons à un ensemble de technique permettant d’évaluer les lésions cérébrales ainsi que les différentes populations de cellules du cerveau.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons montrer dans ce projet que l’injection de vésicules extracellulaires naïves (c’est à dire naturelle, sans ajout de molécules) peuvent diminuer les lésions cérébrales, et donc avoir un effet neuro-protecteur. Les vésicules extracellulaires représentent une alternative sûre à l’injection de cellules souches vivantes et permettent d’éliminer les risques liés à la transplantation de cellules vivantes, tels que les rejets immunitaires, les problèmes éthiques, la transformation des cellules souches en diverses cellules non cérébrales. Par ailleurs, nous allons montrer, qu’en modifiant le contenu des vésicules extracellulaires en leur ajoutant la protéine d’intérêt, que l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires naïves peut être augmenté. Comme le suggèrent des données pilotes, il est peu probable que la protéine d’intérêt soit le seul facteur naturel responsable des effets bénéfiques des vésicules extracellulaires. Cependant, les effets de l'injection de la protéine d’intérêt seule détermineront si la protéine d’intérêt doit être dans des vésicules pour être active. Les résultats obtenus vont permettre de valider l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires enrichies en protéine d’intérêt dans un modèle de lésion cérébrale chez le rongeur avant d’être validé dans un modèle plus gros (cochon), en tant que données préliminaires pour une étude clinique chez l’humain.
Procédures
La chirurgie des ratons se fera à 12 jours de vie sous anesthésie générale. Cette intervention dure 10 minutes. Puis l’hypoxie se fera pendant 90min. Vingt-quatre heures après la chirurgie, les ratons recevront une injection de vésicules extracellulaires, cette administration dure quelques secondes. L’ensemble du projet se fera donc sur 4 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Le jour de la chirurgie : du stress, de la faim et de l’hypothermie sont causés par l’isolement d’avec la mère. Une douleur au niveau de l’incision du cou pour isoler la carotide. Au moment de l’hypoxie on observe une hyperactivité ressemblant à des crises d’épilepsie. - Nous observons une stagnation de la prise de poids pendant 24h après la chirurgie - Les ratons peuvent avoir une douleur locale lors des injections intra-péritonéal ou sous-cutanées - La mortalité observée dans ce modèle est de 10% - Les ratons des groupes hypoxie ischémie prennent moins de poids que ceux des groupes contrôle (SHAM).
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin du projet pour prélever leurs cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques, ce qui correspond à l’analyse du tissu cérébral.
Remplacement
En parallèle de ce projet, une méthode alternative sera menée avec un modèle validé de cevreau humain fabriqué in vitro (appelé organoïde cérébral). Le but est de réaliser les mêmes traitements que sur les ratons pour ainsi comparer les résultats et d’élucider avec précision les mécanismes d’action des vésicules dans un contexte cellulaire humain. Toutefois, ce modèle récent a ses limites et ne peut remplacer totalement le modèle animal. Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle in vivo pour étudier les effets de la réduction du flux sanguin/oxygène cérébral sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découlent. La relation poumon/cerveau/circulation sanguine ne peut être modélisable in vitro. L’effet potentiellement neuro-protecteur des vésicules ne peut se faire que sur un organisme entier car il est difficile de reproduire in vitro la diminution du flux sanguin et une diminution de l’oxygène circulant.
Réduction
Nous utiliserons des données publiées dans les revues scientifiques afin de ne pas reproduire des expériences non utiles. Nous savons que la mortalité du modèle est de 10% nous compenserons en conséquence. Par ailleurs, compte tenu de l’hétérogénéité du modèle (réaction différentes selon les ratons), les groupes seront de 20 individus (10 mâles et 10 femelles pour mettre en évidence un éventuel effet sexe) pour obtenir des données analysables pour chaque point d’analyse (à quatorze et quinze jours de vie). Vingt animaux sont prévus pour transmettre le modèle à 2 nouvelles personnes. Si l’apprentissage se fait bien, nous en utiliserons moins. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, le nombre d’animaux dans notre étude sera maintenu au minimum nécessaire (286 ratons) afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques.
Raffinement
Afin de limiter le stress d’un nouvel environnement, nous procéderons à l’apprivoisement de la rate avant la mise bas. Nous l’habituerons à nous et aux bruits de déplacement dans la salle de chirurgie. Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid. Au moment de la naissance, si le comportement de la rate est anormal, c’est à dire qu’elle n’a pas fabriqué de nid et qu’elle ne s’occupe pas des petits, nous procéderons à une adoption par une autre rate. L’adoption se fera avec une rate qui pourra recevoir un nombre de ratons de manière raisonnable. L’adoption se fera en frottant doucement le raton avec la sciure de la nouvelle cage. Trente minutes avant la chirurgie, les ratons recevront une dose d’antidouleur, puis les ratons seront séparés de leur mère par groupe de 5 afin d’éviter un isolement trop long de toute la portée. Cinq ratons seront hébergés dans un environnement enrichi (sciure de la cage d’hébergement, papier doux absorbant et température contrôlée) pendant 1h. La chirurgie se fera sous anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale sur un coussin chauffant. Dès que les ratons seront réveillés ils seront remis à leur mère pour recevoir ses soins et se nourrir. Pour finir, les ratons seront mis dans la couveuse reliée à la bouteille de mélange gazeux à 8% d’oxygène. On surveillera l’état général des ratons dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les ratons dans la portée sans les déranger à nouveau car le jour de la chirurgie les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile. Une surveillance sera effectuée à +24h après la chirurgie afin de s’assurer de la bonne cicatrisation de la plaie et de la prise de poids. On surveillera la mobilité, la présence de lait dans l’estomac du raton. Les injections intra-péritonéales et sous cutanées seront réalisées avec une aiguille adaptée au raton (courte et fine) et par du personnel formé. Elles seront réalisées en même temps que la surveillance des points limites à 13 jours de vie afin de ne pas déranger plusieurs fois la portée.
Choix des espèces
Les revues scientifiques indiquent que les rats fournissent des informations pertinentes et qu’ils se remettent bien de la chirurgie. Le raton de 12 jours correspond à un nouveau-né à terme, au développement du cerveau et la maturation des cellules du système nerveux.
Evaluation de l’effet de la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés chez le singe Cynomolgus mâle et femelle : procédure d’IRM
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie pour être réutilisés dans un projet lié. Ils sont anesthésiés à plusieurs reprises pour des IRM, des scanners et une imagerie au produit radioactif, immobilisés en chaise de contention et transportés entre deux sites, avec un stress et des douleurs aux sites d'injection et d'intubation. Ce volet évalue une neurostimulation cérébrale par ultrasons en vue d'un essai chez l'humain, chaque animal servant de son propre témoin. Le porteur justifie le recours au singe par sa proximité phylogénétique avec l'espèce humaine.
Objectifs
Dans une première approche expérimentale, nous avons testé et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore sur rongeurs. Dans la continuité de ce projet, en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme. Pour cela, nous devons faire des IRMs cérébrales de nos animaux en dehors du site d’hébergement. Nous devons transporter et manipuler les animaux sur le site d’imagerie. Le projet d’origine est évalué par une autre DAP pour les procédures d’habituation, d’imagerie CT/TEP-18FDG et de neurostimulation qui seront réalisées au sein de l'établissement d'hébergement.
Bénéfices attendus
Dans le cadre des troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression), notre méthode de stimulation permettrait d'avoir une alternative thérapeutique aux traitements pharmacologiques classiques. De plus, cette méthode de neurostimulation serait plus précise et/ou moins invasive que les méthodes de stimulation actuelles (stimulation magnétique transcrânienne et stimulation cérébrale profonde).
Procédures
Sur l'ensemble du projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : *Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. *IRM cérébrale sous anesthésie générale : 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. *Scanner CT sous anesthésie générale : 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. *Adaptation du dispositif de neurostimulation : jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min. *Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale : cette imagerie sera réalisée 2 à 3 fois ; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. *Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique : 2 à 10 séances de stimulation ; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie pour intégrer les procédures décritres dans une autre DAP en relation avec celle-ci.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.
Réduction
Les méthodes d’imageries utilisées pour ce projet permettent d’utiliser un animal comme étant son propre contrôle. Nous n’avons donc aucun recours à un groupe d’animaux contrôle supplémentaire. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation ultrasonore aigüe (n=8 individus) et la neurostimulation ultrasonore chronique (n=8 individus). Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe pour garder des liens sociaux et en présence d’objets d’enrichissement (manipulation d’objet, vidéo, musique). Ils auront un accès ad libitum à l’eau et seront nourris 2 fois par jour dont au moins une fois avec une ration de fruit. Les animaux seront observés tous les jours. Les procédures expérimentales seront réalisées dans une salle correctement chauffée. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant, un monitoring cardio-pulmonaire sera effectué pendant toute la durée de la manipulation. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Pour le transport entre les sites de manipulations, les animaux seront placés en cage d’isolement. Autant que possible les animaux seront transportés par groupe de deux minimums. Des temps d’habituation entre les transports et la manipulation sont prévus pour faire baisser le stress des animaux.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce se justifie (1) par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et (2) par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques pubères seront utilisés pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubère ayant un âge supérieur à 3 ans et un poids inférieur à 5 kg.
Evaluation de la réponse aux antidépresseurs et de la rechute après différents traitements dans un modèle murin de dépression par imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
Privées d'enrichissement physique dans leur cage pendant 12 semaines et mises à jeun 12 heures avant l'imagerie ou les tests, les souris reçoivent une injection intrapéritonéale chaque jour pendant 28 jours et passent des séances de TEP sous anesthésie de deux heures au plus. 240 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes. L'objectif est de mesurer l'effet de candidats antidépresseurs sur des souris que le porteur dit "rendues anxio-dépressives". Il classe l'induction de ce phénotype dépressif en "nuisance légère" sans dire comment il l'obtient, et ne nomme pas les tests de cinq minutes censés mesurer la dépression et l'anxiété.
Objectifs
Même si les antidépresseurs actuels sont des traitements efficaces, ces thérapies peuvent encore être améliorées pour réduire en particulier le risque de rechute ou encore la fraction de patients qui demeurent non répondeurs et pour qui le risque de suicide est très important. La compréhension des mécanismes exacts par lequel les antidépresseurs agissent ainsi que le test de nouvelles molécules sont donc d'une importance majeure. L’objectif de ce projet préclinique est de mesurer les effets de différents antidépresseurs (candidat médicaments) par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), chez un modèle murin de dépression. En effet, l’imagerie TEP offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral qui, associés à des tests comportementaux, permettront de mieux caractériser ces mécanismes, impliqués chez des animaux modèles d'anxiété-dépression.
Bénéfices attendus
Cette étude examinera les mécanismes moléculaires associés à des mesures comportementales impliqués dans le fonctionnement cérébral de type anxiolytic-antidépressif de différents candidats médicaments chez des souris rendues anxio-dépressives. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations sur l’intérêt potentiel de l'utilisation de certains candidats médicaments pour le traitement de pathologies de type anxiété et dépression.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 5 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. • Mise à jeun 12h avant l’imagerie/test comportemental • Administration quotidienne d’un candidat médicament par injection intrapéritonéale (réalisée en 10 secondes) pendant 28 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif (considéré comme une nuisance légère) • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des études histologiques permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico des pathologies de type anxiété et dépression n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour étudier ces pathologies et les altérations au niveau cérébral.
Réduction
L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.
Raffinement
Les rongeurs seront hébergés par groupe. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse, complétées par une anesthésie locale. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser la pathologie dépressive ainsi que d'évaluer les différents effets des médicaments testés. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte.
Approches physiopathologiques et thérapeutiques du syndrome de Sanfilippo B EU 2/3
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles sont examinées par IRM sous anesthésie, décrite comme non invasive, puis tuées par prélèvement intracardiaque pour mesurer la teneur en fer de leur cerveau, geste que le porteur présente comme la nuisance principale du projet. Les retombées annoncées, valider l'IRM comme mesure remplaçant l'analyse post-mortem, sont censées à terme réduire le nombre d'animaux utilisés. Le porteur affirme que l'usage de l'animal en fin d'étude est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet réalisée dans l'EU 2/3, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet réalisé dans l'EU 2/3, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.
Procédures
L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.
Impact sur les animaux
L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort dans l'EU 1/3 à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur jusqu'à son dernier souffle.
Remplacement
Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.
Raffinement
Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.
Comparaison entre un entrainement en endurance individualisé d’intensité modérée et un entraînement intense sur la plasticité corticale et hippocampique et les fonctions sensorimotrices et cognitives chez des rats sains adultes vieillissants.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
98 rats Wistar vieillissants, 49 mâles et 49 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils suivent un entraînement d'endurance sur tapis roulant, des tests sensorimoteurs et cognitifs de force de préhension et de mémoire, et jusqu'à quatre prélèvements sanguins sur huit semaines, avant d'être tués pour prélever cerveau et muscles. Les retombées annoncées, transposer à l'humain les effets de l'entraînement sur le cerveau vieillissant, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire l'interaction muscle-cerveau sur une telle durée.
Objectifs
Dans ce projet, l’efficacité de programmes d'intensité modérée (Moderate intensity continuous training ou MICT) et de haute intensité (High-intensity interval training ou HIIT) est évaluée sur l’évolution des paramètres physiologiques de la performance d’endurance et de la performance sensorimotrice/cognitive ainsi que sur la plasticité musculaire et cérébrale sur 98 rats Wistar mâles (n=49) et femelles (n=49) adultes vieillissants (12-15 mois). Ce projet implique donc des tests sensorimoteurs/cognitifs, de performance d’endurance sur tapis roulant, 2 prélèvements de sang seront réalisés avant et après les 2e séances des semaines 2, 4 et 8 (après désinfection à l’alcool à 70°) au niveau de la veine caudale latérale de la queue. Ces échantillons seront ensuite conservés pour des analyses moléculaires ultérieures. Cela implique aussi des mesures moléculaires musculaires et cérébrales (hippocampe et cortex) à la fin du protocole après prélèvement des tissus pour quantifier les protéines clefs impliquées dans la neuroplasticité et l’activité métabolique.
Bénéfices attendus
Le projet peut révéler la spécificité de chaque méthode d'entraînement en endurance sur les fonctions cérébrales ainsi que les fonctions cognitives et sensorimotrices chez les individus âgés où des troubles moteurs et cognitifs apparaissent fréquemment. Les protocoles d'endurance seront individualisés à partir de repères physiologiques (voir procédure 1 pour la méthodologie utilisée) afin d'être facilement transférables à l'humain comme cela sera dans ce projet de recherche.
Procédures
Pas de chirurgie avec réveil dans ce projet. 1) Les intensités d'effort sont individualisées pour limiter les vitesses de course excessives et stressantes pour les animaux. 2) Pour le prélèvement du cerveau et muscles, ils subiront d'abord une anesthésie profonde. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier par un surdosage d'anesthésique. 3) Prélèvement de sang à la base de la queue sous anesthésie pour réduire le stress et les mouvements de l'animal (maximum 4 prélèvements de sang sur 8 semaines). Le volume prélevé sera inférieur au 20% du volume sanguin total dans la période de 7 jours, soit 2 ml maximum de sang prélevé pour des rats de 400-550g sur 1 semaine incluant le prélèvement PRE et POST séance (séance 2 des semaines 2, 4 et 8).
Impact sur les animaux
Globalement, le protocole n'induit pas d'effets indésirables importants. De légères blessures possibles peuvent subvenir aux niveaus des pattes. les autres procédures sont réalisés sous anesthésie n'induisant pas d'effets indésirables.
Devenir
Ils seront euthanasiés pour prélever les organes afin de les utiliser pour des analyses moléculaires ultérieures (Western blot et ELISA).
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d’un entrainement d'endurance au niveau musculaire et cérébral et qui puisse faire le lien entre ces 2 systèmes. L’utilisation de culture de neurones (in vitro) ne peut pas remplacer l’utilisation des animaux dans ce projet car il n’est pas possible de mimer précisément l’entraînement physique de manière chimique. De plus, la durée de l’entraînement prévue est trop longue (8 semaines) pour pouvoir réaliser la même expérience in vitro. Les neurones en culture primaire ne restent pas exploitables sur cette durée. Il est également nécessaire de tenir compte des contraintes mécaniques imposées aux muscles actifs lors de la course. Ces contraintes contribueraient à la plasticité cérébrale mais le modèle in vitro ne peut pas reproduire ces phénomènes physiologiques d’interaction muscle-cerveau.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux pour chaque groupe, nécessaire à la réalisation d’un test statistique paramétrique, soit un total de 98 rats Wistar, mâles et femelles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés respiratoires, s’il est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont soit non invasives, soit très peu invasives (prise de sang) soit sans réveil. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les rats afin d’assurer le bien-être de l'animal. Ce qui est prévu : L’environnement des cages sera enrichi et renouvelé toutes les semaines par la présence d'objets afin de réduire l'ennui des animaux (igloos cartonnés, des tunnels en Carton 5 mm et en polycarbonate ainsi que des mini-rouleaux de papier). Les mêmes expérimentateurs restent en contact avec les animaux tous les jours afin qu'ils s'habituent à eux. Les animaux sont familiarisés avec les dispositifs expérimentaux avant le début du protocole pour réduire le stress éventuel. Pour le protocole de la ponction de la veine caudale latérale (gauche ou droite) est réalisé sous anesthésie générale (gazeuse). Pour le prélèvement du cerveau et muscles, les rats reçoivent un antalgique 30 min avant la procédure et sont ensuite anesthésiés profondément. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier avec un surdosage d’anesthésique. Cette procédure n'induira pas de perte de poids de plus de 20%. Ils devraient même en prendre régulièrement. Dans le cas contraire, ils seront euthanasiés. le porteur du projet prendra cette décision.
Choix des espèces
Les répercussions musculaires et métaboliques à l'exercice montrent des similitudes entre un rat et un homme (par exemple, présence d'un seuil lactique, biogenèse mitochondriale, gains de masse musculaire) comme en témoignent de nombreuses publications. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux (sensibilité mécanique, force de préhension, mémorisation à court terme…) et immunohistologique, de vérifier l'efficacité de nouvelles stratégies d'entrainement. Les rats sains vieillissants seront inclus à partir de 12 mois (12-15 mois). Le taux de survie est plus important comparé aux rats âgés de 20 mois. De plus, ces animaux sont davantage susceptibles de courir sur le tapis roulant que des rats plus lourds. Ce modèle de rats vieillissants est fréquemment utilisé dans la littérature pour étudier les effets du vieillissement sur le cerveau.
Rythmes cérébraux hippocampiques et codage neuronal chez les souris modèle des troubles du spectre autistique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Certaines souris porteuses de la mutation étudiée meurent à la naissance, d'une hypotonie générale. 332 souris vont être utilisées, la déclaration en comptant 172 sans réveil et 160 en souffrance sévère. Une partie est enregistrée sous anesthésie profonde puis perfusée au fixateur sans réveil, une autre subit deux heures de chirurgie pour implanter des électrodes dans le cerveau, jusqu'à cinq semaines d'isolement et deux semaines d'enregistrements quotidiens, dans une arène circulaire et pendant le sommeil. Le porteur écrit pourtant que les mutants "ne présentent aucun phénotype dommageable s'ils ont survécu à la naissance". Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde, pour prélever le cerveau et vérifier l'emplacement des électrodes.
Objectifs
La sensibilité extrême aux informations sensorielles des personnes autistes sous-entend un traitement cérébral de l’information bien particulier. Ce projet a donc pour objectif d’étudier les propriétés du traitement cérébral de l’information chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme. Plus précisément, nous étudierons l’activité de groupes de neurones présents dans une région du cerveau appelée hippocampe, structure impliquée dans la mémoire épisodique (mémoire des évènements autobiographiques -vécus à la première personne) et sociale. Il a été montré, chez le rongeur puis chez l’Homme, que lorsque nous vivons une expérience certains neurones de cette structure s’activent dans un ordre temporel précis qui récapitule, dans une fenêtre temporelle réduite (quelques millisecondes) cette même expérience. Lorsque l’individu est hors contexte, ces mêmes neurones reproduisent à nouveau cette même activité séquentielle, rejouant sans la vivre directement l’expérience passée. Or, cette propriété de réactivation séquentielle, rendue possible par l’architecture des circuits neuronaux de l’hippocampe, joue un rôle primordial dans la mémoire et l’apprentissage. Puisque l’architecture neuronale de l’hippocampe est altérée chez la personne autiste et dans les modèles de l’autisme, nous émettons hypothèse qu’une des traits comportementaux propre à la personne autiste est due à une anomalie de ce traitement séquentiel. Nous tenterons de caractériser ces altérations ainsi que les mécanismes responsables de ces déficits chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques responsables des déficits cognitifs propres aux troubles du spectre autistique. A long terme, ceci pourrait permettre l'élaboration de traitements prévenant ou rémidiant à ces déficits.
Procédures
Un groupe d’animaux subira des enregistrements électrophysiologiques intracrâniens sous anesthésie profonde suivie de perfusion intracardiaque de fixateur. Le deuxième groupe se verra implanter des électrodes intracrâniennes sous chirurgie stéréotaxique (2h). Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgesie. Une semaine plus tard l'activité cérébrale sera enregistrée alors que l’animal explore une arène circulaire et lors de phases de sommeil, pour un total d'une heure par session, une session par jour pour un maximum de deux semaines. A la fin des enregistrements, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque, sous anesthésie profonde et analgesie. Une fois implantés les animaux seront hébergés en individuel pour 5 semaines maximum (3 semaines en moyenne), le temps des enregistrements.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : - L'anesthésie peut engendrer une détresse respiratoire; il peut survenir une douleur post-opératoire; un stress associé à l'isolement d'une partie des animaux ; un stress associé à la manipulation par l'experimentateur; la perte des implants par choc accidentel; la mort à la naissance de certaines souris portant le gène d'autisme (hypotonie générale).
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem caractériser leur état histologique et révéler la localisation des électrodes après les enregistrements.
Remplacement
L’étude de l’intégrité des oscillations hippocampique et de leurs fonctions nécessite l’observation de systèmes neuronaux intacts. Par conséquent, cette étude ne peut se faire que sur l’animal soit vigile en comportement, soit anesthésié. Ceci rend donc impossible l’utilisation de modèle in silico ou d'organoides. A ce jour, très peu d'enregistrements électrophysiologiques de l’activité hippocampique ont été réalisés chez les souris porteuses des gènes impliqués dans l'autisme que nous étudions. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles d’autismes qui nous intéressent nécessitent la réalisation de mutation de gènes. La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles).
Réduction
Afin de réduire au maximum les éventuelles souffrances induites par les chirurgies ainsi que le nombre d’animaux, la procédure d’enregistrements sous anesthésie (Procédure 1) a été mise en place pour déterminer en premier lieu, les phénotypes électrophysiologiques propres à nos modèles. Ainsi, elle permet de préciser à l’avance les paramètres et patrons à examiner lors des enregistrements chez l’animal en comportement. Par exemple si nos enregistrements anesthésiés révèlent une anomalie spécifique à un certain rythme cérébral dans une structure et non une autre, nous n’étudierons que la structure impliquée et le comportement auquel elle est associée. Ceci nous permettra donc de limiter le nombre d’implantation à des fins d’enregistrements en comportement. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet maintenant d’enregistrer un grand nombre de canaux, sur de multiples sites simultanément. Un grand nombre de nos analyses reposant sur le nombre de cellules enregistrées , ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Pour les souris des portées de modèles autistiques, les animaux présentant le génotype requis par l’étude constitueront la population cible ; les animaux ne présentant pas le génotype requis seront aussi étudiés en tant que contrôles de la population cible, réduisant le nombre de portées à produire dans le cadre de cette procédure. De même, les mâles et femelles seront étudiés dans le cadre des procédures TSA, aboutissant à une utilisation de l’ensemble des animaux de chaque portées. Enfin, les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). La souffrance animale est minimisée par les conditions d'élevage (cages collectives, les animaux sont mis en présence de matériel d’enrichissement : un dôme en carton permettant la nidification (sauf protocole 2) , une tige de papier pouvant être rongée et faisant aussi office de matériel de nidification, ainsi qu’une briquette en bois pour le rongeage), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie, regulation thermique), le suivi régulier des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet, dès lors qu’ils ont atteint l’âge adulte. Les souris sont habitués progressivement à la manipulation afin de minimiser le stress. Bien que les animaux soient sujets à une mutation génétique, ces derniers ne présentent aucun phénotype dommageable s’ils ont survécu à la naissance. Enfin les animaux ont un accès illimité à l'eau et la nourriture.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives, notamment des aspectis sociaux et de mémoire spatiale, a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus au sein de l’équipe et avec la communauté scientifique ainsi qu’une minimisation du nombre d'animaux utilisés. Les animaux seront de jeunes adultes (7-8 semaines) puisque nous nous intéressons à un système nerveux mature. Nous voulons aussi minimiser autant que possible la durée d'élevage en conditions d'animalerie de laboratoire.
Effets de différents candidats médicaments sur l’électroencéphalogramme du rongeur vigile et instrumenté
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2100
Une chirurgie de deux heures pour implanter un émetteur de télémétrie, parfois une seconde pour un cathéter, puis l'isolement jusqu'à la fin des expériences : 2 100 rats et 1 150 souris, soit 3 250 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la plupart, léger pour 500 d'entre eux. Ils reçoivent par injection, gavage ou perfusion intraveineuse de quatre heures au plus des candidats médicaments dont l'effet sur l'électroencéphalogramme est enregistré, et parfois de la phencyclidine, qui peut provoquer des stéréotypies. Les tests comportementaux, de dix minutes à vingt-quatre heures, ne sont pas nommés. 1 000 rongeurs peuvent ensuite être réutilisés dans un autre projet, les autres sont tués pour des prélèvements ou à la suite des effets indésirables des produits. Le porteur présente rats et souris comme "les espèces animales les plus pertinentes" pour ces enregistrements, et compte parmi les bénéfices attendus pour les rongeurs eux-mêmes une meilleure connaissance de leur espèce.
Objectifs
Le développement de médicaments pour le traitement des maladies du cerveau constitue un défi majeur du fait du manque de prédictivité des modèles comportementaux. Cela pourrait être amélioré par l'utilisation de techniques plus prédictives comme l’enregistrement de l'électroencéphalographie (EEG). L’enregistrement de l’EEG permet d'évaluer l'activité cérébrale via des électrodes. De plus, différentes études publiées montrent que l'EEG est altéré dans différentes pathologies du cerveau chez l'homme. La possibilité d'évaluer l'EEG chez le rongeur confère une valeur predictive importante à cette technique dans le cadre du développement de médicaments pour les maladies du cerveau. La combinaison de mesures EEG avec des mesures comportementales représente donc un intérêt important pour la recherche en neuroscience. Le but de ce projet est d'évaluer l'effet pharmacologique de candidat-médicaments sur l'EEG de repos ou lors de stimulations (visuelles/auditives) chez le rongeur vigile. Elles pourront éventuellement être complétées par des tests de comportement. Ces mesures auront des applications majeures telles que l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité du médicament.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter diverses pathologies neurologiques (par exemple la schizophrénie, une pathologie humaine touchant 1% de la population mondiale). En fonction de leur mécanisme d'action, certains composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les composés testés sont actifs ou d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat et souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.
Procédures
Les animaux seront sujets à une ou deux chirurgies pour implanter l'émetteur de télémétrie (2h) et le cathéter (20 minutes). Ces animaux seront isolés à partir de la fin de la chirurgie et ce jusqu'à la fin des expériences. Les animaux pourront être sujets à différentes administrations par voie intrapéritonéale (ip), sous-cutanée (sc) ou orale (po) (~1 min), intraveineuse (iv) (bolus: 1-2 min ou perfusion: 2min-4h) et également à des tests comportementaux (entre 10 min et 24h en fonction du test).
Impact sur les animaux
Les animaux seront susceptibles d'éprouver les nuisances suivantes : effets liés aux chirurgies d'implantation de l'émetteur ou du cathéter comme la perte de poids; stress ou douleurs liés aux injections par différentes voies (ip, po, sc, iv ...); effets indésirables (e.g. stéréotypies) liés à l'injection d'agents pharmacologiques de référence comme la phencyclidine (PCP), stress associé à la manipulation des animaux par les opérateurs; stress lié à l'isolement post-opératoire ou aux tests comportementaux.
Devenir
Les animaux pourront soit être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire, soit euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal, soit euthanasiés à la suite des effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ ou le modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat et/ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les ondes cérébrales par EEG. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité et la toxicité d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris représentent les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques pour tirer des conclusions pertinentes. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 8-12 / par groupe. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses • la formation du personnel • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux • le recours à des procédures les moins invasives possibles • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur l’électroencéphalogramme et ces animaux sont capables d’apprendre et de réaliser les tâches comportementales complexes utilisées dans ce projet. De plus, il existe ainsi une possibilité de confronter les résultats avec une littérature abondante. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l'EEG de l’animal à d’autres stades de développement.
Evaluation de 3 candidats médicaments dans l’étude de l’impulsivité chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction alimentaire destinée à les motiver, des tests d'impulsivité de choix, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des prélèvements sanguins sur animal vigile, pour évaluer trois candidats médicaments. Le porteur décrit un design où chaque rat est son propre témoin et teste les trois composés, présenté comme une réduction du nombre d'animaux. Il rattache le projet à une phase préclinique, une entrée en clinique restant conditionnée à des résultats positifs.
Objectifs
La prise de décision fait partie intégrante de notre quotidien. Un déficit connu de la prise de décision se traduit par des troubles de l'impulsivité. Cette dernière se traduit par une impossibilité à retarder le début d'une action, qui commencera donc de manière prématurée, c'est alors une impulsivité d'action. Il existe également une autre forme d'impulsivité, appelée impulsivité de choix. Il existe différentes tâches comportementales pour étudier cette forme d'impulsivité. Dans ces tâches, les animaux doivent choisir entre 2 ou plusieurs options ayant des rapports coûts/bénéfices différents. Dans ce projet, nous souhaitons tester l'effet potentiel modulateur de 3 candidats médicaments sur l'impulsivité de choix chez le rat.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégrè dans la phase pré-clinique du développement de candidat médicaments. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments retenus pourront, à terme, entrer dans des études cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ainsi qu'a des injections intrapéritonéales 2 fois par semaine. Les tests comportementaux seront rapides et se dérouleront pendant 4 semaines. A la suite des injections des candidats médicaments, les animaux, vigiles, seront également soumis à un prélèvement sanguin. De plus, à la fin de chaque protocole, les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Le traitement bi hebdomadaire des animaux par injection intrapéritonéale peut induire un stress, particulièrement lors des 1ères administrations. Ces injections peuvent également indurie une légère douleur. De plus, les tests comportementaux peuvent induire une nuisance chez les animaux, notamment à cause de la restriction alimentaire afin d'augmenter leur motivation à réaliser la tâche. Enfin les prélèvements sanguins, bien que réalisés par du personnel compétent et entrainé, pourront aussi entrainer une douleur légère chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de collecter le cerveau pour des analyses histologiques.
Remplacement
Les processus physiopathologiques de l'impulsivité impliquent l'interaction de différentes structures cérébrales. Les composés médicaments sont supposés agir sur des structures cérébrales précises. Ce degrè de compléxité et la validation du site d'action ne peuvent être atteints qu'avec un modèle animal. Le rat possèdant un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité, est donc un bon modèle pour notre sujet d'étude. De plus, les 1ères phases de validation des composés, de leur non toxicité ont été réalisées au sein du laboratoire de notre partenaire.
Réduction
En se basant sur la littérature scientifique et sur l'expertise de notre équipe en terme d'études comportementales, le nombre de rats (n=24 par expérience, n=8 par sous-groupe) a été optimisé afin d'avoir un groupe d'animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le design expérimental choisi permet de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque chaque rat sera son propre contrôle et testera les 3 candidats médicaments. Les 3 sous-groupes correspondent chacun à un ordre d'administration des candidats médicaments différents, afin d'éviter tout biais d'ordre. De plus, nous avons choisi de réaliser des tests statistiques de type régression linéaire multiple pour nos sorties comportementales de type temps de réaction, temps de mouvement (variable réponse numérique continu) ,ou de type modèle linéaire généralisé pour les paramètres comportementaux type nombre d'appui sur le levier, de réponses prématurées, d'entrée dans la mangeoire (variable réponse de type comptage) afin d'avoir une puissance statistique plus important et donc de pouvoir réduire notre nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs (par manipulation quotidienne) avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. De plus, des stratégies d'analgésie et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (poids) seront mis en place afin de veiller au mieux au bien-être des animaux durant toute la durée du projet. Une grille de score pour le suivi du bien-être des animaux sera utilisée pour surveiller au mieux les animaux et prendre les décision les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Dans le cas où les animaux atteindraient des points limites définis ou si le traitement analgésique n'était pas efficace, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le rat possède un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité. De nombreuses études ont déja été menées en neurosciences dans ce domaine là utilisant des modèles rongeurs. De plus, de part l'expertise de notre équipe, nous sommes en mesure de développer un modèle d'impulsivité fiable chez cette espèce. Nous disposons également de tout le matériel nécessaires à la manipulation et aux soins de ce type de rongeur. Nous utiliserons des rats jeunes adultes pour ce projet. Les animaux seront commandés à environ 10 semaines d'âge. Cet age correspond à l'age classiquement utilisé dans les études qui nous interessent et correspond à un stade de développement cérébral permettant de répondre à notre problématique scientifique. Après leur arrivée, les animaux auront 1 semaine d'acclimation. Ainsi, les rats auront 11 semaines au début des tests.
Étude du phénotype comportemental de souris présentant une délétion du gène Tbk1 dans les cellules immunitaires du cerveau – pour déterminer s’il s’agit d’un modèle de changements de comportement dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent deux tests de comportement mesurant la préférence et la reconnaissance sociales, à quatre mois puis à vingt mois après un isolement d'une semaine avant chaque test, puis sont tuées avec ou sans prélèvement d'organes. L'objectif est de savoir si la délétion d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau reproduit des troubles proches de la démence associée à la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur affirme que l'effet sur le comportement ne peut s'observer que chez l'animal et justifie le vieillissement de la cohorte par le lien de la maladie avec l'âge.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), On appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire ou d'interaction social, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT.
Procédures
Des souris d'une lignée transgénique d’intérêt et des souris contrôlés (non-transgéniques), subiront 2 tests de comportement consécutifs, une fois à 4 mois (jeune), et, 16 mois plus tard, une fois à 20 mois (âgées). Le premier test nécessite 25 minutes par souris et le deuxième nécessite 5 minutes par souris. Les deux tests sont faits sur deux jours consécutifs. Ces 2 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer la préférence sociale ainsi que la reconnaissance sociale. A la fin de la procédure (des 2 tests de comportement à l'âge vieille et/ou jeune), toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).
Impact sur les animaux
Pour les tests de comportements : Car l'animal à tester doit être isolé pendant une semaine avant ce type de test, cet isolement pourrait produire un stress. Aussi, avec ce type de test il y a un risque d'agression entre les animaux à testés, et ces tests de comportement peuvent eux-mêmes induire un stress/angoisse chez l'animal. Le vieillissement de la cohorte peut aussi augmenter le risque de pathologies générales liées à l'âge. A l’issue de la période de maintien, les animaux pourront subir deux types d’euthanasies réglementaires dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes.
Devenir
Parce qu’il s'agit d'une étude comportementale, les résultats des tests comportementaux sont collectés tout au long de la procédure. Toutes les souris sont donc utilisées pour ces tests de comportement. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).
Remplacement
Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocole, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (la prolifération et activation après stimulation, la phagocytose). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtil in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible dans un animal.
Réduction
Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour les deux tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype (avec 3 génotypes) et par sexe. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Pour tout test de comportement, les deux sexes sont nécessaires. En plus, car la SLA et la SLA-DFT sont liées à l'âge (l’âge est un facteur de risque majeur), nous allons réaliser ces tests sur des souris jeunes (4 mois) et des souris âgées (20 mois). Comme les deux différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous ré-utiliserons les mêmes souris pour ces deux tests consécutifs pour en utiliser le moins d'animaux possible. En plus, afin de réduire le nombre de souris utilisées, nous ferons vieillir la cohorte jeune (4 mois) pendant 16 mois pour obtenir la cohorte âgée (20 mois). Donc, 120 souris transgéniques (sans phénotype) sont nécessaires, plus des souris de contrôles non-transgéniques (90). Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 210
Raffinement
(Hébergement) Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton, et des fibres en carton, permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage, maximum 6), et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible avant les expériences, mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. (Présence de points limites) L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. Toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance (plaies, ulcères, tumeurs, fractures etc.), est considérée comme un point limite, et la souris sera euthanasiée. (Tests de comportements) Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant la semaine suivant les tests comportementaux. Pendant l'isolation nécessaire d'une semaine avant les tests de comportementaux, la stimulation environnementale reste présente (maison et fibres en carton), mais est renforcé en ajoutant aussi des carrés de coton compact (pour faire des nids). En cas de stress trop important suivant un test (souris prostrée, ne se déplaçant plus), l’individu sera euthanasié. Le test sera aussi suspendu en cas de comportement agressif. En cas de blessure, l’individu sera euthanasié. (Euthanasie pour prélèvement d'organes) A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés. Deux types d’euthanasies réglementaires sont utilisées, dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes. Le seul risque dans ce cas (défini comme un point limite), est le réveil pendant la chirurgie, mais c'est très peu probable en vue de l'anesthésie profonde (surdose d'anesthésique).
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie peut influencer le comportement chez la souris. De plus, des souris ont été utilisées avec succès pour modéliser les phénotypes moteurs de SLA-DFT. Par conséquent, nous pensons que la souris est le bon modèle pour notre question de l'effet de la modulation des microglies sur les défauts de comportements liée à la SLA-DFT. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois) et à l'âge vieille (à 20 mois).