Troubles nerveux

18 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent un test de mémoire en labyrinthe en Y après administration de candidats médicaments ou de molécules mimant la maladie d'Alzheimer (scopolamine) ou la schizophrénie (MK-801), avant un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à l'inconfort des injections et à une possible sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer les fonctions cognitives et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le test d’alternance spontanée en labyrinthe en Y est utilisé pour évaluer l'état des fonctions cognitives des rats et des souris dans des modèles expérimentaux. Le comportement normal d’un animal se caractérise par des alternances de visites des bras. Une alternance est définie comme une visite consécutive des 3 branches. Un animal avec une mémoire de travail intacte (donc des fonctions corticales préfrontales intactes), se souviendra du bras précédemment visité et montrera une tendance à entrer dans un bras moins récemment visité. Un déficit mnésique se caractérisera par un pourcentage d’alternance proche de 50% (visites au hasard). Le projet présenté ici a pour objectif la mise en place d’un test de mémoire « le test d’alternance spontanée en labyrinthe Y » chez le rongeur (rat/souris) pour : 1) étudier les effets potentiels induits par un médicament candidat sur les fonctions cognitives ; 2) tester l’efficacité de médicament candidat sur les déficits cognitifs induits soit par une molécule amnésiante tel que la scopolamine (l’administration de scopolamine induit des changements de connectivité cérébrale observés dans la maladie d’Alzheimer, elle est donc utilisée comme modèle pharmacologique de la maladie d’Alzheimer chez le rongeur) soit par un antagoniste non compétitif du récepteur du N-méthyl-D-aspartate tel que le MK-801 (le dysfonctionnement des récepteurs NMDA est maintenant bien connu dans la schizophrénie, le MK-801 est donc utilisé comme modèle pharmacologique de la schizophrénie chez le rongeur).

Bénéfices attendus

La compréhension des déficiences fonctionnelles et des processus pathologiques est d'une importance vitale afin de développer des thérapies efficaces. En utilisant le comportement exploratoire naturel des rongeurs, le labyrinthe d’alternance spontanée en labyrinthe Y permet d’évaluer la mémoire de travail spatiale à court terme. Le protocole de test du labyrinthe en Y est simple et nécessite des ressources minimales. Il peut également être appliqué pour étudier la mémoire à court terme dans des modèles de rongeurs âgés.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les fonctions cognitives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR.....) Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées (SHR) 5 -52 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes et personnes âgées.

4200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique d'un candidat médicament, le plus souvent par gavage, avant un test d'activité locomotrice, puis un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute de méthode alternative pour ces mesures sur le système nerveux.

Objectifs

Lors du développement d’un candidat médicament, il peut être pertinent d’évaluer si celui-ci peut induire des effets sur le niveau d’activité générale, l’activité locomotrice globale ainsi que les habitudes d’exploration chez la souris. La modification de l’activité locomotrice peut entraîner des biais pour l’évaluation correcte du candidat médicament dans certaines thématiques. Pour exemple, une diminution de l’activité locomotrice peut entraîner un comportement de type anxiolytique (une diminution de nombre de billes enfouies dans le test d’enfouissement de billes). Il est donc important de vérifier avant toute caractérisation des effets d’un candidat médicament dans ce type de modèle. L’objectif de ce projet sera d’étudier, chez la souris, l’effet d’un candidat médicament dans le test de mesure de l’activité locomotrice spontanée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier les potentiels effets indésirables de nouveaux candidats médicaments sur l’activité locomotrice afin d’éviter de biaiser son développement.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier les effets potentiels induits (fonction motrice, l'exploration, l'anxiété, l'hyperactivité ou la sédation) par des médicaments candidats sur le SNC. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6J De 5 à 10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

3 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats spontanément hypertendus servent de modèle du trouble de l'attention avec hyperactivité, testés jeunes entre trois et six semaines pour se rapprocher de l'enfant, placés seuls dans une enceinte pendant 150 minutes après administration d'un composé, puis tués pour prélever sang et cerveau. L'effectif est important et les procédures sont décrites brièvement. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer le TDAH et que le recours à l'animal de laboratoire est "nécessaire".

Objectifs

Le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention (TDAH) est un trouble complexe du développement cérébral caractérisé par l'hyperactivité/l'impulsivité et l'inattention. Cette affection touche principalement les enfants et les adolescents, mais elle peut également perdurer à l'âge adulte. Les rats SHR sont des rats spontanément hypertendus présentant une hyperactivité locomotrice et qui sont considérés comme un modèle animal validé du TDAH. Les rats WIstar Kyoto (WKY) servent de souche témoin. L’objectif de la présente étude est d’examiner l’effet d’un composé sur l’hyperactivité des rats SHR dans un test d’activité locomotrice spontanée. Ce modèle animal est un outil précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux ainsi que le développement neuronal mis en jeu dans le TDAH.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, seul des médicaments modulant les transmissions aminergiques tels ques les psychostimulants (ex :Méthylphénidate) et non psychostimulants (ex : Atomoxétine) sont utilisés actuellement comme pharmacothérapies. Ces médicaments augmentent les transmissions dopaminergiques et noradrénergiques; ces systèmes de neurotransmission sont les cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux traitements. De nombreuses recherches sur ce trouble, utilisant des approches génétiques, pharmacologiques et de neuro-imagerie, ont été réalisées. Plusieurs modèles animaux de TDAH tels que : le rat spontanément hypertendu (SHR) ou les souris knock-out DAT, ont également été utilisés. Ces modèles animaux sont donc des outils précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux du TDAH.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

1) L’un des modèles animaux du TDAH les plus utilisés est le rat spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Le rat SHR montre des niveaux élevés d’hyperactivité et d’impulsivité ; ces traits sont présents avant que le rat SHR ne développe une hypertension à l’âge adulte, c’est-à-dire vers l’âge de 7- 8 semaines. Dans ce projet, l’âge des animaux est compris entre 3 à 6 semaines au moment du test ; étant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est plus pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles. Par conséquent, les animaux de ce projet n’ont pas encore développé l’hypertension spontanée. 2) Le test consiste à placer les animaux individuellement dans une enceinte et à les laisser se déplacer librement pendant une période de 150 minutes comprenant une première période d’habituation de 30 minutes et une deuxième période de test de 120 minutes. 3) Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test à un intervalle de 2 semaines. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée ou intraveineuse peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer TDAH. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

►1) Les animaux sont hébergés selon les normes d’hébergement (annexe II de l’arrêté relatif à l’agrément des EU). Les rats seront hébergés collectivement. Les cages comporteront une litière de sciure, des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger... ► 2) Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet sont : les rats spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Les rats SHR présentent des déficits d'attention soutenue, d'impulsivité motrice et d'hyperactivité dans un nouvel environnement. De plus, ils présentent une signalisation DA réduite et une expression accrue du transporteur DA (DAT), similaire aux patients atteints de TDAH. De même, le méthylphénidate (MPH) corrige les déficiences attentionnelles et motrices chez les rats SHR, apportant un soutien supplémentaire aux rats SHR en tant que modèle de TDAH humain. 3-6 semaines au moment du test. Etant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles.

3 912 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dystonie cervicale, l'équivalent d'un torticolis spasmodique, leur est provoquée par micro-injection intracérébrale de DTG dans le noyau rouge après pose d'un guide-canule sous chirurgie stéréotaxique, puis des molécules d'un donneur d'ordre sont testées avant une perfusion au paraformaldéhyde. L'effectif est important pour une étude comportementale, et le projet relève d'une prestation pour un client industriel. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif de dystonie cervicale n'existe et que la démonstration se fait sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, souvent douloureux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Des études comportementales et biochimiques ont montré que les récepteurs σ sont impliqués dans la régulation du mouvement et de la posture. Ces récepteurs σ sont concentrés dans des structures cérébrales, telles que le noyau rouge et la substantia nigra. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et par la suite de tester les molécules du donneur d’ordre pour étudier leur potentiel effet sur les récepteurs σ : soit en induisant, par eux-mêmes, des dystonies cervicales (effet agoniste sur les récepteurs σ2) soit en inhibant les dystonies cervicales induites par l’administration de DTG, un agoniste σ2, (effet antagoniste sur les récepteurs σ2).

Bénéfices attendus

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Ce modèle est utile pour tester le potentiel agoniste ou antagoniste des récepteurs σ2 de molécules induisant des dystonies cervicales.

Procédures

Le but de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et ainsi permettre le développement de différentes molécules. Une micro-injection intracérébrale dans le noyau rouge de 1,3-di- (2-tolyl) guanidine (DTG), qui est un agoniste des récepteurs σ 1 et σ 2, est réalisée pour induire une dystonie du cou chez le rat. A la fin de l’étude, pour vérifier le site d’injection, les animaux sont perfusés au paraformaldehyde (PFA) et des coupes histologiques sont réalisées par la suite.

Impact sur les animaux

•1- Chirurgie -Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Un guide canule (tubes en acier inoxydable de calibre 24) est implantée verticalement à 1.00 mm au-dessus du noyau rouge •2- Administration -Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour vérifier le site d’injection au niveau du cerveau, les animaux seront perfusés au paraformaldehyde (PFA) à la fin de l’étude.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle de dystonie cervicale alternatif à l’animal.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables. • Justification du nombre de groupes: 1) Le groupe témoin est nécessaire à chaque expérience 2) Le groupe DTG est nécessaire pour valider l’expérience et pour comparer l’efficacité du produit testé 3) Il est généralement nécessaire de tester le produit à trois doses pour mesurer la relation dose-effet mais un nombre de doses inférieur ou supérieur peut être justifié en fonction de l’état de connaissance du produit. L’effet attendu du produit testé est une diminution de déviation de torsion de la tête par rapport au plan horizontal. Le DTG est administré en intracérébrale. Selon les études, le produit testé et son placebo sont administrés en intracérébrale ou par voies orale (gavage), intrapéritonéale, sous-cutané, intraveineuse ou intranasale. • Justification du nombre d’animaux par groupe. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 12 animaux par groupe. L’utilisation d’un nombre inférieur d’animaux a une probabilité importante d’entraîner la non-validité de l’étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d’animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée et ils sont placés individuellement. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. La lignée de rat utilisée est : Wistar 7 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau, puis passent une série de tests comportementaux (labyrinthe surélevé, open field, reconnaissance d'objet et reconnaissance sociale, enfouissement de billes, nidification), pour tester une thérapie génique contre le syndrome de l'X fragile sur une lignée de souris Fmr1-KO. Le porteur revendique une preuve de concept déjà obtenue in vitro et affirme que ces mécanismes comportementaux ne peuvent être étudiés que dans un "organisme complexe" comme la souris. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au stade de la preuve de concept, l'objectif immédiat étant de mesurer une correction du comportement avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’X fragile (FXS) représente la première cause héréditaire de déficience intellectuelle et d’autisme pour lequel il n'existe à ce jour aucune thérapie. Nous avons récemment découvert un mécanisme moléculaire qui serait à l’origine du FXS. Nous proposons maintenant de tester une approche par thérapie génique afin de corriger le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS. Pour mettre en œuvre cette approche expérimentale, nous utiliserons un modèle animal FXS qui a été développé chez la souris. La souris FXS récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Ainsi ce projet vise à déterminer : 1. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS ? 2. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le comportement du modèle de souris FXS ?

Bénéfices attendus

Notre étude a pour but de fournir la preuve de concept que le mécanismes moléculaire que nous avons identifié précédemment contribue à la pathologie du FXS. Nous proposons des nouveaux outils de thérapie génique pour corriger ce mécanisme moléculaire défaillant et le comportement du modèle de souris FXS. Jusqu'à présent, toutes les stratégies thérapeutiques envisagées pour traiter le FXS ont échoué cliniquement. Notre projet s'appuie sur des connaissances nouvelles acquises au laboratoire, et qui pour la première fois, lient le FXS à un nouveau mécanisme moléculaire. Notre approche repose ainsi sur des données préliminaires publiées et solides pour fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter le FXS.

Procédures

480 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests comportementaux : semaine 1. Analyse du rythme circadian (36H) + Labyrinthe surelevé (5min). semaine 2.Open field (15min), toilettage (15min). semaine 3. nidification (24h) + reconnaissance d’objet (2x10min) + enfouissement de billes (15 min) semaine 4. Reconnaissance sociale (3x10min).

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées et publiées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Il convient maintenant de valider in vivo nos données. Etant donné que le phénotype comportemental est l'un des traits les plus importants du FXS, ces mécanismes complexes ne peuvent être étudiés que dans des organismes complexes tels que la souris

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. Pour toutes ces raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prennant en compte les contraintes experimentales.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

L’utilisation des souris se justifie par l’existence d'une lignée génétiquement dans laquelle la protéine Fmr1 est invalidé. La souris Fmr1-KO récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme (altération de la mémoire, perte d’interaction sociale, hyperactivité, macro-orchidisme, anomalie des épines dendritiques) et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux chez les nouveau nés à P0 pour prévenir le phénotype du FXS. Chez des souris âgées de 8 semaines (jeune adulte), stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées et chez des anuimaux adultes de 20 semaines afin de corriger le FXS Les animaux seront injectés dès l'âge de 8 semaines pour la première partie du projet (PE1).