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Étude du remodelage veino-lymphatique chez la souris pour comprendre la physiopathologie de l’hypertension intracrânienne idiopathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
714 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'étude de leur dure-mère et de leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent une ligature des deux veines jugulaires, une injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou la pose d'un cathéter intracrânien laissé 12 à 14 jours, avec un isolement pendant toute cette durée. Le protocole prévoit aussi un régime gras pour rendre les souris obèses, 31 jours d'isolement en cage d'activité et des tests comportementaux étalés sur deux jours et demi, que le porteur ne nomme pas. Le but est de reproduire chez la souris l'hypertension intracrânienne idiopathique, une maladie qui touche spécifiquement les femmes jeunes en surpoids. Le porteur juge le recours à ces souris "indispensable", alors que le même projet prévoit une IRM du réseau veino-lymphatique chez des patients et des témoins humains.
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de *714* souris non transgéniques.
Bénéfices attendus
D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**
Impact sur les animaux
Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.
Réduction
Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 *et 11 (n=54)* dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux. Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé. Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de *714* souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.
Raffinement
A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.
Développement d’un modèle de souris transgénique CX3CR1-GFP pour analyser dans le cortex cérébral in vivo par microscopie à deux photons les thérapies anti-inflammatoires et l’imagerie de neuro-inflammation
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
100 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des approches anti-inflammatoires sur le cerveau par microscopie à deux photons. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de deux heures puis trois séances d'imagerie sous anesthésie, certaines recevant une lésion inflammatoire au cortex, un implant délivrant du dihydrogène ou une stimulation magnétique transcrânienne. Le porteur indique que la stimulation peut causer de petites hémorragies cérébrales, que les chirurgies présentent un risque infectieux et que les souris peuvent aggraver leurs plaies, avant d'être tuées pour les analyses. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro d'un "cerveau complexe vivant" pour ces mécanismes.
Objectifs
Objectif 1 : Analyser les effets anti-inflammatoires du dihydrogène sur la neuro-inflammation. Objectif 2 : Valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3 : Analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus des projets sont multiples : objectif 1, valider ou pas l'effet du dihydrogène sur la diminution de la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est associée a beaucoup de neuropatologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Pour cette derniere , il a déjà été observé une ameliorations de symptomes chez les rats Parkinsoniens. Objectif 2 ,valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3: analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau. Ces effets sont à eviter chez l'homme, sauf dans le cas ou nous avons besoin transitoirement du passage d'un médicament.
Procédures
Toutes les souris subiront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale pendant 2 heures. Et, également sous anesthésie générale, 3 séances d'imagerie cérébrale sous microscope précédées d'une injection intra-veineuse d'agent de contraste, durant un maximum de 3 heures. Lors de leur chirurgie, pendant quelques secondes, certaines souris subiront une induction inflammatoire à l'aide d'une aiguille de biopsie à la surface du cortex cérébral. Certaines souris se verront implanter en sous-cutané dans le dos d'un électrolyseur délivrant du dihydrogène (chirurgie implantatoire de quelques minutes sous anesthésie générale). Enfin, quelques souris seront soumises pendant 30 minutes à un champ magnétique en disposant une bobine électrique au-dessus de leur tête.
Impact sur les animaux
Nous pouvons causer des petites hemoragies cérébrales lors de la stimulation magnétique transcrânienne. Les chirurgies présentent un risque infectieux. Les souris peuvent agraver leurs plaies en se blessant.
Devenir
La mise à mort des animaux est necessaire pour faire les analyses immunohistochimiques quantitatives de la neuroinflammation.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible avec des modèles in vitro ou in silico. La complexité des reactions neuro-inflammatoires in vivo ne permet pas de les étudier in vitro . Il n'existe pas de modèle in vitro d'un cerveau complexe avec les interactions intercellulaires et cellulaires-vasculaires en place. De ce fait, les mécanismes étudiés dans un cerveau vivant ne peuvent être analysés que dans un organisme complexe vivant.
Réduction
Les animaux sont suivis dans le temps par imagerie pour reduire leur nombre par groupe expérimental. Les nombres d’animaux par groupe ont été fixés en tenant compte d'une part de la complexité de la chirurgie et des implantations et d'autre part de la variabilité inter-individuelle. On utilisera les tests statistiques pour le calcul du nombre d'animaux minimum permettant l'obtention de résultats significatifs.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre en suivant toutes les règlementations en vigueur : animalerie agréée, personnel formé et autorisation de projet validée. Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement enrichi et contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. La fréquence de surveillance des animaux sera adaptée à la temporalité de l'expérience, impliquant si nécessaire l'arrêt des expérimentations. Si les points limites sont atteints : 1) Perte de poids , Perte de poids 5% > 10%> 20%, score 1/2/3 2) Etat du pelage, de la peau et des yeux, manque de soins / lesions, score 1/2, Grattage/ infection/ Ulcération / inflammation chronique, score 1/2/3/, adminstration d'une crême apaisante. 3) Mobilité anormale: claudication/ inactivité/ prostration , score 1/2/3. 4) Fèces liquides, score 1 5) respiration , anomalies, score 2. Score limit = 3, adminstration d'un antalgique dans le biberon systématique en post-chirurgie. S'il n'y a pas d'amélioration de l'état de la souris en 24h , elle sera sacrifiée sans demande d'autorisation au responsable scientifique du projet. Les différents gestes chirurgicaux et toutes les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie et analgésie générale et locale. La méthode chirurgicale la moins invasive sera retenue pour le bien-être animal, comprenant la sévérité des suites opératoires. Il y a un traitement antalgique (Carprofène) suite aux chirurgies dans toutes les procédures expérimentales selon les conseils de notre vétérinaire référent. Les animaux pourront être vidéosurveillés en continue si nécessaire (surtout en post-opératoire) grâce à la mise au point d'une caméra infra-rouge. Bien que génétiquement modifiée, le transgène étant transmis de façon systématique et stable, les souris seront identifiées par tatouage sans geste plus invasif.
Choix des espèces
L'espèce animale retenue correspond au modèle le plus pertinent pour la modalité d'imagerie utilisée : la microscopie intra-vitale. De plus, nous avons besoin d'un modèle in vivo qui exprime des cellules immunitaires rendues fluorescentes telles que chez une souris transgénique existante. Nous utilisons les souris adultes (> 6 mois ) pour faire une chirurgie osseuse sur la boîte cranienne. Ces operations ne sont pas possibles sur une souris en croissance pour laquelle la bôite cranienne n'est pas à sa taille definitive.
Electrorétinographie et thérapie génique chez des souris modèles de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
744 souris modèles de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés et sans réveil pour une partie. Sous anesthésie, elles reçoivent des injections intraoculaires et intraveineuses et des enregistrements d'électrorétinogrammes par électrodes posées sur la cornée, après un test comportemental en environnement nouveau, pour étudier les troubles visuels de la maladie et une thérapie génique. Le porteur indique que les injections oculaires peuvent provoquer déshydratation, ulcère de la cornée ou cataracte, et que les souris sont tuées pour analyser leurs rétines, 80 individus surnuméraires étant gardés pour la reproduction. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico pour ces tests fonctionnels.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations du gène DMD qui conduisent à une dégénérescence musculaire pouvant être associée à des troubles cognitifs et divers autres troubles sensoriels et cérébraux. Les patients atteints de DMD peuvent notamment développer des rétinopathies. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des protéines de la famille des dystrophines, qui sont impliquées dans cette maladie et présentes dans la rétine, d’étudier les conséquences pathologiques de leur perte chez des souris modèles de la DMD, et les possibilités de traitement basés sur des approches de thérapie génique. Ce projet est important pour le diagnostic et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le système nerveux dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD).
Bénéfices attendus
Les patients atteints de DMD peuvent développer une rétinopathie proliférative, une cataracte, des anomalies de l'électrorétinogramme (ERG), une altération de la sensibilité aux contrastes, des pertes de vision des couleurs et des seuils élevés de détection des stimuli visuels dans l'obscurité. Ces troubles ont été très peu étudiés mais ne peuvent plus être aujourd’hui considérés comme secondaires, car vu l’évolution des thérapies et prises en charge dans cette maladie, la durée de vie des patients s’accroit considérablement et les troubles affectant le système nerveux prennent progressivement une place de plus en plus importante dans la vie des patients. La présence et la sévérité des troubles sensoriels et cérébraux semblent liées à la position des mutations dans le gène et au nombre de protéines impactées (plusieurs protéines dystrophines sont produites par ce gène), et une meilleure connaissance des effets de différentes mutations a donc un intérêt diagnostique majeur qui permettra d’anticiper la sévérité et l’évolution des troubles sensoriels et cognitifs dans cette maladie. Ces évaluations sont très rarement effectuées chez les patients, d’où les connaissances très parcellaires de ces dysfonctions. De plus, les approches thérapeutiques développées ces dernières années et actuellement en phase d’essai clinique ont principalement été validées pour leurs effets sur les muscles, mais leur capacité à améliorer les fonctions liées au système nerveux restent très peu étudiée. Il est donc important d’apporter des réponses à ces questions au cours d’études précliniques sur des modèles animaux de la maladie, porteurs de différentes mutations. Les résultats de ce projet permettront ainsi de préciser les relations entre mutations et sévérités des déficits visuels. Nous évaluerons également si ces troubles sont sensibles aux thérapies géniques actuellement disponibles et s’ils peuvent servir de marqueur, non seulement pour le diagnostic, mais aussi pour suivre de manière peu invasive l’impact d’un traitement sur le système nerveux. Le cas échéant, ce projet aura démontré que l’évaluation des fonctions visuelles a un intérêt majeur en clinique pour cette maladie.
Procédures
Test comportemental : 3 essais quotidiens de 10 min espacés d’une heure, pendant 3 jours – Animal placé dans un environnement nouveau et libre de ses mouvements sur une surface de 8 cm2 au cours de chaque essai. Anesthésie générale et placement d’électrodes (lentilles de contact sur la cornée et électrode sous-cutanée), enregistrement d’électrorétinogrammes (30 min). Anesthésie générale et analgésie pour injections intraoculaires (intra-vitréennes) : durée de l’injection inférieure à 3 min. Anesthésie générale pour injections intraveineuses (sinus retro-orbitaire) : durée de l’injection inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable potentiel dans ces lignées à cet âge est de l’anxiété et une plus forte réactivité au stress, de manière temporaire en fonction des conditions et évènements. Le test comportemental peut potentiellement induire un léger stress, dû à l’introduction dans un environnement nouveau et à la surface limitée de mouvement (8 cm2). Les injections intraoculaires et les enregistrements électrophysiologiques sont susceptibles d’induire une déshydratation oculaire, un ulcère de la cornée ou une cataracte.
Devenir
A la suite des tests comportementaux et des électrorétinogrammes, et après une période de récupération (1 semaine) les animaux seront euthanasiés pour prélèvements et analyses de leurs rétines pour préciser les bases cellulaires des altérations visuelles. Suite aux expériences incluant un traitement par thérapie génique, et après une période de récupération (1 semaine) les animaux seront euthanasiés pour prélèvements et analyses de leurs rétines pour vérifier et quantifier la réexpression des dystrophines induites par les traitements. Une partie des femelles et mâles surnuméraires sera gardée en vie et utilisée pour former de nouveaux accouplements (n=80), les autres seront euthanasiées.
Remplacement
Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont initialement menées sur des souris. Notre projet a pour but d’effectuer des tests fonctionnels qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants. Les traitements les plus prometteurs sont habituellement testés dans une seconde étape sur de plus gros mammifères, par nos collaborateurs ou d’autres laboratoires, avant d’envisager leur entrée en phase d’étude clinique si on pense qu’ils peuvent conduire à de nouveaux médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base de nos récentes études, la réussite des expériences nécessite 12 souris par groupe expérimental. Nous utilisons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons et des analyses statistiques régulières en cours d’expérience permettent d’interrompre éventuellement l’expérience avant d’atteindre l’effectif maximal. De plus, nous utilisons une approche longitudinale permettant d’obtenir les données comportementales, électrophysiologiques et morphologiques à partir d’un même groupe expérimental ; pour les injections intra-vitréennes, un seul œil est traité par souris, l’autre œil servant de contrôle interne non-injecté pour évaluer les effets de l’injection en évitant un groupe supplémentaire ; la répétition des mesures qui sont ensuite moyennées au sein de chaque expérience permet de réduire encore la variabilité et donc le nombre d’animaux. Un nombre réduit de souris non atteintes par la pathologie sera utilisé dans des groupes servant à contrôler les effets des injections. Alors que certaines procédures impliquent la comparaison de 4-5 modèles porteurs de mutations différentes, l’approche thérapeutique se focalise sur 2 souris modèles, l’une présentant les altérations les plus sévères, l’autre étant représentatives d’une importante population de patients. Enfin, l’expérience basée sur l’administration périphérique du traitement ne sera effectuée que si la procédure précédente a montré des effets thérapeutiques encourageants. L’ensemble de ces mesures permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Les injections/anesthésies, la récupération post-opératoire et les études fonctionnelles ont été optimisées en concertation avec notre vétérinaire. Elles comprennent une anesthésie/analgésie générale et locale au niveau de l’œil, une prévention de la déshydratation oculaire et un collyre cicatrisant antibactérien et anti-inflammatoire en fin d’expérience pour éviter notamment les risques d’ulcères cornéens. Toutes les manipulations sont effectuées par des personnels qualifiés parfaitement formés aux procédures mis en place dans ce projet, et le taux d’échec des expériences est très faible. Afin d’évaluer si un animal présente néanmoins des signes de souffrance ou d’inconfort, nous avons prévu un suivi quotidien et post-opératoire avec des grilles d’observations spécifiques, et mis en place des critères d’arrêt précis avec prise en charge des animaux le cas échéant (arrêt de la procédure, soins, ou euthanasie) en concertation avec notre vétérinaire, la cellule bien-être animal et l’équipe zootechnique. Les conditions d’hébergement sont enrichies jusqu’à la fin du projet et les souris expérimentales sont maintenues en groupe sociaux par fratrie. L’état général des animaux est suivi quotidiennement et en cas de signes de souffrance ou d’inconfort, des mesures correctives sont prévues selon un protocole mis en place avec notre vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les explorations précliniques dans le cadre de cette pathologie sont menées sur des souris. D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les souris modèles dans ce projet sont toutes sur un fond génétique spécifique, nous utiliserons donc aussi des mâles de cette souche provenant d’un éleveur agréé afin d’effectuer des croisements en « backcross » pour éviter toute dérive génétique au cours du projet. Les souris jeunes adultes seront étudiées (minimum 6-8 semaines). Des résultats récemment publiés montrent par exemple qu’en injection intraoculaire, l’ensemble de la rétine est ciblé par nos outils de thérapie génique après injection chez des jeunes adultes. Les électrorétinogrammes en condition basale ne seront pas effectués avant 8 semaines, car les réponses ne sont stables qu’à partir de cet âge, et il est important de ne pas inclure des variations liées à l’âge qui pourraient compliquer nos conclusions sur les effets des traitements.
Evaluation des interactions de substances pharmacologiques sur le système nerveux central et périphérique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent deux substances par injection, puis sont retournés sur le dos à plusieurs reprises pour observer le réflexe de retournement, afin de tester des candidats médicaments en interaction avec des barbituriques et de l'éthanol. Le porteur indique que les injections peuvent induire une douleur légère et que des tremblements ou des convulsions pourront apparaître, et précise que tous les animaux seront tués en fin d'étude pour rechercher une toxicité retardée sur les organes. Il conclut que ces tests réglementaires de pharmacologie de sécurité, exigés pour une autorisation de mise sur le marché, ne peuvent pas être remplacés, tout en reconnaissant l'existence de tests in vitro et in silico en amont.
Objectifs
Ce projet participe à anticiper des problématiques de toxicité pouvant apparaitre lors de l’évaluation clinique des médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament. Le but est d’identifier les potentiels effets indésirables lors d’études dites de pharmacologie de sécurité. Le projet concerne des tests comportementaux réalisés chez le rongeur visant à étudier les effets de substances pharmacologiques susceptibles d'interagir avec des hypnotiques sur le système nerveux central. Le contexte du projet est principalement l’évaluation de la sécurité. Ces évaluations sont fortement recommandées d’un point de vue réglementaire dans le cadre de l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les potentiels effets d'aggravation de l'état de somnolence induit par les barbituriques et l'éthanol, en cas d'interaction avec le candidat médicament. Ceci avant le passage en phase clinique des nouveaux traitements.
Procédures
Il s'agit principalement d'un test d'observation basé sur le réflexe de retournement. Les principales interventions subies sont l'administration des substances (2 au total, max 30 sec chacune) et la préhension pour la vérification du reflexe de retournement (animaux mis sur le dos) (10 max, durée 15 sec chacune) sur une période de 2 heures environ. En cas de perte du réflexe de retournement (animaux restés sur le dos), les animaux sont observés pour le retour sur leurs pattes sans manipulation pendant 6 heures max.
Impact sur les animaux
Les manipulations / contentions réalisées au cours des procédures d'administration, des tests de reflexe de retournement ou de prélèvement sanguin peuvent entrainer un stress. L'administration des substances par injection dans le péritoine ou sous la peau peut induire une douleur légère. Plusieurs effets indésirables inhérents au traitement reçu (seul ou liès à l'interaction avec l'ethanol ou le barbital) pourront être détectés au cours de l’étude, en particulier des signes de toxicité tels des tremblements ou des convulsions.
Devenir
L’effet à moyen et long terme des traitements reçus en interaction avec le barbital et l'éthanol n'étant pas connu (par exemple, risque de toxicité non détectable immédiatement au niveau d'un organe : foie, reins...), tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude)
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils permettent l’étude des potentiels effets secondaires de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques). Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Pour les données quantitatives, les tests non-paramétriques (Kruskal-Wallis et Mann-Whitney) seront appliqués et pour les données qualitatives (fréquence de réponse), le test exact de Fisher sera utilisé. Aussi, un prélèvement sanguin en fin d'étude pourra être envisagé, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse . Cette évaluation se fera au moment de chaque relevé (toutes les 15 minutes) et en cas d'atteinte des points limites, pourra conduire à l'euthanasie de l'animal avant la fin de l'étude. En cas de prélèvement de sang terminal, un traitement analgésique (carprofene à 5 mg/kg ou équivalent) pourra être associé à l'anesthésie (type isolflurane) afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...).
Choix des espèces
L’utilisation de rongeurs (rats et souris) pour évaluer l’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux central, en particulier l’interaction avec des hypnotiques est prédictif de leur activité en clinique (potentiellement un risque d'effets secondaires lors de leur future utilisation chez certains patients). Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) l’âge peut varier entre 4 semaines et 2 ans, conformément à la bibliographie scientifique et aux recommandations réglementaires .
Évaluation du potentiel thérapeutique d’antagonistes du récepteur NOP de la nociceptine dans des modèles de stress chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Elles subissent un conditionnement de peur par chocs électriques, un confinement avec sons intenses, un jeûne de vingt-quatre heures et jusqu'à quatre injections, développant une anxiété et une hypervigilance pendant les quatre semaines suivantes. L'objectif est de tester si des antagonistes de la nociceptine préviennent les symptômes de stress post-traumatique, une partie des souris étant tuée pour prélever des tissus cérébraux. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal pour étudier ces comportements complexes.
Objectifs
Les troubles du stress post-traumatique se développent chez les individus exposés à un événement traumatisant et altèrent de façon significative la vie personnelle, sociale et/ou professionnelle. A l’heure actuelle le traitement de ces troubles est très insuffisant. Ainsi il est primordial d’identifier de nouvelles cibles pour permettre notamment de prévenir l’apparition de la pathologie dans les populations à risque ou d’empêcher son développement de façon précoce après le trauma. La nociceptine est un neuromédiateur impliqué dans la réponse au stress. Des études antérieures nous ont permis de montrer que le blocage des effets de la nociceptine améliorait les symptomes cognitifs et émotionnels dans des modèles de stress chronique. Des données suggèrent également que cette stratégie pourraient aussi empêcher le développement des symptomes de stress post-traumatique. C'est cette hypothèse que nous souhaitons tester dans ce projet. Les deux objectifs principaux sont donc: 1) Déterminer si le blocage du système nociceptine par des molécules antagonistes empêche le développement des symptômes de type stress post-traumatique dans un modèle souris; 2) Identifier les circuits cérébraux modulés par le système nociceptine lors du stress qui pourraient expliquer ces effets bénéfiques.
Bénéfices attendus
Les études comportementales permettront de valider le potentiel des antagonistes nociceptine pour prévenir le développement ou traiter les symptômes du TSPT dans un modèle préclinique. L'étude des circuits cérébraux associés fournira des données fondamentales sur le mécanisme d’action de cette nouvelle classe de régulateurs de la réponse au stress. Des antagonistes nociceptine sont déjà en développement clinique, notamment pour le traitement de la dépression. S'ils sont positifs, nos résultats fourniront une preuve de concept pour étendre leur utilisation et évaluer leur capacité à soulager les symtômes du TSPT chez l'humain. Ils permettront aussi de savoir si des différences d'effet liées au sexe sont à prévoir.
Procédures
Exposition à 2 stimulations électriques de 2 secondes d'intensité faible à modérée. 1 à 4 injections intra-péritonéales (10 secondes). Confinement dans un compartiment de petite taille et exposition à des sons brefs et intenses pendant environ 15 minutes. Jeûne de 24 heures avant un test comportemental.
Impact sur les animaux
Le conditionnement de peur classique produit un stress aigu chez les animaux au moment des stimulations électriques (2 chocs de 2 secondes) ainsi qu'une anxiété lorsque le son est de nouveau présenté lors des premières séances d'extinction. Le modèle TSPT produit également un stress aigu chez les animaux au moment des stimulations électriques (2 chocs de 2 secondes), une anxiété lorsque le son est de nouveau présenté lors des premières séances d'extinction, ainsi qu'une anxiété et une hypervigilance modérées pendant les 4 semaines qui suivent le conditionnement. Le test de réflexe de sursaut implique un stress modéré associé au confinement dans le compartiment de test. Les animaux recevront aussi de une à quatre injections qui impliquent un stress d'environ 10 secondes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car les procédures auxquelles ils ont été exposés peuvent modifier leur comportement ultérieur. Pour une partie des animaux, des tissus doivent être prélevés pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les comportements observés.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes, le conditionnement de peur et les symptômes associés, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des conclusions valides : 16 animaux pour les études comportementales et 10 pour les analyses post-mortem. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes d'anxiété et d'hypervigilance seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de respecter des pauses d'au moins 5 jours entre les tests. Le nombre total d'animaux utilisés pourra être réduit si certaines étapes du projet ne donnent pas de résultats positifs: 1) la deuxième molécule sera testée uniquement dans les conditions pour lesquelles la première aura montré un effet positif, 2) l'étude n'utilisera le modèle TSPT que si celui-ci est validé préalablement, 3) l'activité des neurones ne sera étudiée que dans les conditions pour lesquelles les molécules testées auront montré des effets positifs sur le comportement.
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont ensuite habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation. Les animaux ayant subi un stress aigu développent un phénotype anxieux mais celui-ci est relativement subtil. Il est révélé lors des différents tests comportementaux mais ne se traduit pas par des symptômes spontanés dans la cage d'hébergement. Les animaux sont cependant suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin. Si une altération de l'état est observée (isolement, baisse du comportement exploratoire, attitude prostrée, expression faciale modifiée, défense à la manipulation), une grille de scoring est utilisée pour déterminer la conduite à tenir en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Les modèles de conditionnement de peur et de TSPT sont bien caractérisés chez la souris et reproduisent une partie des symptômes observés chez l'humain. Le système nociceptine a également été très étudié chez la souris et présente de fortes similitudes avec celui de l'humain. L'objectif de l'étude est d'étudier l'effet des antagonistes NOP chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines dont on considère que le système nerveux est mature.
Utilisation d’un modèle de souris pour comprendre les bases cellulaires des troubles du spectre de l’autisme liés au gène Tshz3 et tester un traitement pharmacologique visant à réduire les stéréotypies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Tshz3 présentée comme un modèle d'autisme, elles reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours et passent trois tests comportementaux censés mesurer des stéréotypies, dont le RNT ne précise pas le protocole. L'objectif est de tester si un médicament utilisé dans la maladie d'Alzheimer réduit ces comportements répétitifs. Le porteur affirme que les troubles du spectre autistique "ne peuvent être étudiés qu'in vivo" et que des souris génétiquement modifiées sont "indispensables".
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies et des comportements de type persévérant chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester si un traitement pharmacologique qui augmente les niveaux de cette substance est capable d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.
Bénéfices attendus
Cette demande s’inscrit dans la suite de travaux précédents du demandeur et des autres responsables du projet. Nous avons identifié un gène dont la mutation est impliquée dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dan ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements pharmacologiques permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation de ce gène.
Procédures
Ce projet comprend 2 types d’intervention : un traitement qui consiste en une injection une fois par jour sur une période de 10 jours ; 3 tests comportementaux (qui ne comportement pas de souffrances pour les animaux) pour détecter des comportements stéréotypés typiques des TSA : chaque test dure entre 15 et 20 min et sera effectué au 3ème et au 10ème jour de traitement.
Impact sur les animaux
Nuisances attendues : injections quotidiennes sur 10 jours, qui peuvent entrainer de la douleur au point de piqure ; tests de comportement répétés qui peuvent engendrer du stress ou de la fatigue.
Devenir
A la fin de la procédure, les souris ne seront pas utilisés pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les 40 souris seront mises à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité du traitement pharmacologique visant à améliorer les stéréotypies.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cela nous a fourni un nombre total de sujets = 18 (9 par groupe). Afin d’héberger les souris par groupes homogènes de 5 et compenser à une possible augmentation des écarts types due au traitement et à l’utilisation des deux sexes, nous avons choisi d’utiliser 10 animaux par groupe : 10 mâles mutantes et 10 mâles contrôle, ainsi que 10 femelles mutantes et 10 femelles contrôle, pour un total de 40 souris.
Raffinement
Les souris sont élevées en groupes sociaux de 5 animaux, dans des environnements enrichis par la présence d’objets (igloos en carton, « Nestlets » déchiquetables en fibre, briques en bois), au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires sont strictement contrôlés. Les animaux sont examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/mal être et veiller à ne pas dépasser des points limites. Etant donné l’absence de procédures chirurgicales ou d’autres sources de douleur dans ce projet, nous n’utiliserons pas d’anesthésiques ou d’analgésiques.
Choix des espèces
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des comportements stéréotypés, afin de tester l’effet d’un traitement pharmacologique, utilisé en clinique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre hypothèse est que ce traitement peut restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA, le striatum, et ainsi améliorer les comportements stéréotypés qui caractérisent ces souris. L’âge des souris utilisées sera de 6 à 8 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.
Influences des gènes Cdkn1a et Cdkn2a sur les déficits cognitifs observés dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer, elles subissent un test de reconnaissance d'objets puis le test de la piscine de Morris, qui les oblige à nager, pour étudier le rôle de la sénescence cellulaire dans les déficits de mémoire. Le porteur reconnaît que la nage forcée est stressante et présente un risque d'hypothermie et de fatigue. Il justifie le recours à la souris par la "nécessité" d'un organisme vivant proche de l'humain.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer résulte d'une lente dégénérescence des neurones. Elle se caractérise par des troubles de la mémoire, de l'orientation dans le temps et dans l'espace. Le patient perd progressivement son autonomie. Bien que plusieurs hypothèses aient été avancées, les causes exactes de la maladie restent complexes. Ces dernières années, la recherche a montré un intérêt croissant pour l'étude des cellules sénescentes. Les cellules sénescentes sont des cellules qui ont définitivement cessé leurs activités initiales ainsi que leur multiplication. Elles restent cependant très actives et produisent des protéines qui peuvent être nocives pour le tissu cérébral. La sénescence cellulaire est un des mécanismes naturels du vieillissement, mais elle peut devenir pathologique si les cellules sénescentes s'accumulent. Des recherches ont montré un lien entre l'accumulation des cellules sénescentes et la maladie d'Alzheimer chez l'Homme et la souris. Cependant, les mécanismes par lesquels la sénescence contribue aux symptômes de la maladie d'Alzheimer ne sont pas clairs. Pour tenter de comprendre le rôle de la sénescence dans la maladie d'Alzheimer, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées capable de développer la maladie d'Alzheimer. Chez ces souris, nous empêcherons la production de p21 ou de p16, deux protéines impliquées dans l'activation de la sénescence cellulaire. Nous examinerons l'effet de l'inhibition de l'une ou l'autre de ces protéines sur les capacités de mémoire et d'orientation spatiale des animaux.
Bénéfices attendus
En bloquant la production de ces protéines, nous espérons réduire, modifier ou retarder les symptômes associés à la maladie d'Alzheimer. Comme p16 et p21 semblent jouer des rôles distincts, nous pensons que la perte de chaque protéine entraînera des changements spécifiques.
Procédures
À 4 mois, l'ensemble des animaux seront soumis à deux tests comportementaux. Le premier, le test de reconnaissance d'objets, il n'induit pas de stress et dure 5 jours consécutifs. Le second, la piscine de Morris, d'une durée de 15 jours, est considéré comme provoquant une légère nuisance. Pendant les six premiers jours, 4 sessions de 90 secondes sont organisées par jours. Les jours 7, 14 et 15 une session de 60 secondes par jours est organisée.
Impact sur les animaux
La réalisation du test de la piscine de Morris implique de faire nager les souris. Les souris savent nager spontanément mais l’eau n’est pas leur élément favori. Ainsi le test est considéré comme stressant. Les nuisances potentielles sont le risque d’hypothermie et la fatigue due à la nage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés après 15 jours de tests. Les cerveaux seront prélevés pour l'analyse des marqueurs de sénescence cellulaire de la maladie d'Alzheimer.
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal, ici la souris, se justifie par le fait que les anomalies observées (altération de la mémoire) nécessitent un modèle vivant suffisamment proche de l'Homme.
Réduction
Pour assurer la fiabilité des tests statistiques, il faut utiliser au moins 16 animaux par groupe. Au total, il y aura 8 groupes d'animaux. Nous utiliserons donc 128 animaux. Nous utiliserons 64 femelles et 64 mâles.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement du début à la fin de l'expérience. Si les animaux montrent des signes de souffrance, d'inconfort ou de douleur, ils seront exclus des tests et traités ou euthanasiés en fonction de leur état. Les animaux seront habitués au manipulateur avant les tests et seront gardés en groupes d'au moins deux individus. Ils auront un accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un nid sera placé dans leur cage. Pendant l'essai en piscine de Morris, les souris seront surveillées par caméra. Les individus présentant des signes de fatigue seront retirés de la piscine. Pendant l'intervalle entre les essais (15-20 minutes), l'animal sera séché et placé sous une lampe chauffante pour une période de repos.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiopathologiques et moléculaires des maladies neurodégénératives nécessite l'étude d'un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n'y a donc pas d'autre méthode que l'étude chez l'animal. La souris est une espèce physiologiquement proche de l'homme chez laquelle il est possible d'effectuer des manipulations génétiques afin d'obtenir un modèle de pathologies humaines. De plus, les études sur le modèle humain sont limitées, contrairement au modèle murin qui permet d'accéder à différents tissus et différents stades de la pathologie. Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de l'âge de 4 mois. Cet âge correspond à l'apparition des symptômes chez la souris.
Effet de l’exercice physique sur la santé mentale en lien avec les désordres nutritionnels.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime gras dès le sevrage, elles sont soumises à un test de coordination motrice, à des prélèvements sanguins et à l'isolement, pour évaluer si l'exercice volontaire réduit des comportements dépressifs. Le porteur indique que le régime provoque surpoids, fatigue et troubles de la glycémie, et que l'isolement est source de stress. Il affirme que cette approche intégrée ne peut pas être reproduite in vitro et renvoie les retombées, une meilleure efficacité des antidépresseurs, à un usage futur.
Objectifs
L’obésité entraine une inflammation chronique qui altère la santé physique et mentale. Elle favorise notamment la dépression et réduit l’efficacité des antidépresseurs, renforçant ainsi l’intérêt de trouver des stratégies alternatives de traitement et d’en comprendre les mécanismes d’action. Dans ce contexte, l’activité physique est une option prometteuse. Ce projet collaboratif vise à déterminer si l’exercice volontaire peut réduire les comportements dépressifs dans un modèle de dépression inflammatoire (souris sous régime enrichi en graisses). Les mesures seront réalisées dans différents tissus afin d’appréhender l’impact de l’exercice sur les signalisations inter-organes, qui sont rarement prises en compte dans ce contexte. L’objectif sera ainsi d’obtenir une vision intégrée des mécanismes reliant les effets de l’exercice sur la santé mentale et de tester la pertinence de l’exercice dans le cadre d’une médecine personnalisée ciblant la dépression liée à des déséquilibres nutritionnels.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la connaissance des mécanismes impliqués dans l’effet de l’exercice physique sur la santé mentale en lien avec les désordres nutritionnels. La réduction de l’inflammation par l’activité physique pourrait augmenter l’efficacité des traitements antidepresseurs chez les personnes souffrant d’obésité. Dans une optique de valorisation, nous vérifierons aussi les modifications du microbiote en réponse au régime obésogène et à l’activité en lien avec les comportements dépressifs pour renforcer les connaissances sur l’axe microbiote-cerveau en lien avec l’activité physique. Ce projet constitue donc une étape essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de la dépression.
Procédures
Tous les animaux subiront des tests non-invasifs pour caratériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur état de stress ou dépression. Nous réaliserons sur animal vigile 3 petits prélèvements de sang (2 gouttes à chaque fois) espacés d’un mois, pour effectuer le dosage du sucre et du lactate dans le sang. Voie et volumes respectant les recommandations. En fin de procédure, l’animal sera anesthésié par injection (voie et volume respectant les recommandations - durée 5 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux sous régime enrichi en graisse présenteront des symptômes similaires au cas d’obésité chez les humains (mobilité réduite et fatigue à cause du surpoids, problèmes de régulation du taux de sucre dans le sang). L’ensemble des animaux pourront subir du stress lié à l’isolement et lors de la réalisation du test de coordination motrice.
Devenir
Pour mener une étude intégrée et identifier les mécanismes d’interaction liant dépression, inflammation, obésité et activité physique, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure.
Remplacement
Notre procédure intégrée vise à identifier les mécanismes pouvant relier activité physique et réduction de l’état dépressif des animaux ce qui ne peut pas être réalisé in vitro. Il n'est pas encore possible de recréer de manière physiologique la communication inter-organes que nous souhaitons étudier puisque c’est l'impact de l'activité physique sur le métabolisme à travers la connexion des tissus hépatique, musculaires et nerveux via la circulation sanguine que nous observons. De plus, il est impossible d'observer les phénomènes dépressifs sur des cellules en culture. Les approches cellulaires pourront dans un deuxième temps présenter un intérêt pour aller décortiquer les bases biologiques et neurobiologiques des effets que nous aurons observés dans cette première partie plus globale.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de statistique et des résultats précédents pour le calcul du nombre minimal d’animaux nécessaires dans ce projet. Nous utiliserons un logiciel pour la répartition aléatoire des animaux en lots en nous basant sur leur composition corporelle et leur glycémie. Nous profiterons de cette procédure pour prélever les fèces des animaux afin d’évaluer les modifications du microbiote en réponse au régime riche en graisse et à l’activité physique en lien avec les comportements dépressifs. Ces analyses conduites dans un second temps nous permettrons de renforcer les connaissances sur l’axe microbiote-cerveau en lien avec l’activité physique et de déposer une demande de projet future. Les données collectées concernant la croissance, la composition corporelle et l’activité physique viendront alimenter notre base de données et pourront servir ultérieurement.
Raffinement
La nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives des souris. Pour le change et la réalisation des tests comportementaux, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués afin de réduire le stress. Les animaux seront préalablement habitués aux différents tests. Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des obèses, nous utiliserons une grille de suivi adaptée avec des points limites. Nous avons défini des points limites ainsi que la conduite à adopter pour chaque situation pour éviter toute souffrance à l'animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris mâles et femelles nourries dès le sevrage avec une diète enrichie en graisses (60% de lipides) et qui seront donc en situation d’obésité à leur arrivée. La même diète sera poursuivie pour ces animaux pendant toute la durée de la procédure. Nous avons choisi ce modèle car il est proche de l’obésité humaine sur le plan des causes, et permet de contrôler le degré d’obésité grâce à la durée et la période d’exposition à la diète riche en graisses. Tout comme ce qui est rapporté chez l’Homme, ce modèle est également associé à des troubles métaboliques et au développement d’une inflammation, qui jouent ensemble un rôle majeur dans les conséquences de l’obésité sur la santé physique, mais également mentale, en particulier les symptômes de dépression. Pour avoir des animaux développant le syndrôme métabolique (obésité, troubles de la glycémie) et dépressif, nous utiliserons des animaux ayant suivi un régime obèsogène pendant 12 semaines. Ce régime étant dispensé chez notre fournisseur à partir de l’âge de 4 semaines, nous commanderons donc des animaux âgés de 16 semaines à réception.
Comparaison de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV en fonction de la voie d’administration dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou directement dans le cerveau par stéréotaxie sous anesthésie prolongée, passent des tests de mémoire, puis subissent des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien avant mise à mort. Le porteur indique des risques de saignement lors de la craniotomie, de traumatisme lié à l'aiguille dans le cerveau et d'infection oculaire après injection rétro-orbitaire. La retombée annoncée, remplacer l'injection intracérébrale par une voie intraveineuse chez les patients, reste renvoyée aux étapes précliniques à venir.
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle de souris de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA..
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (virus adeno-associé) induisant l'expression de la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (70 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d'un anti-douleur, injection stéréotaxique). Deux tests comportementaux permettent de mesurer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes sous anesthésie) et sanguin (1 minute) sera réalisé sous anesthésie avant d'appliquer une méthode d'euthanasie réglementaire (après injection d’un anti-douleur). Plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques (anti-douleur) seront effectuées lorsque nécessaire.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirable s attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (virus adeno-associé) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux et un risque d’hypothermie.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (482) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l'injection sur les yeux de l'animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L'applicateur est formé au geste d'injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (entre 6 et 12 mois) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 4-6 mois puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Efficacité de l’injection dans le liquide céphalo rachidien de cellules souches mésenchymateuses dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'étude de leurs organes et de leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après l'injection d'un peptide qui déclenche une encéphalomyélite auto-immune, c'est-à-dire une paralysie progressive notée de 0 à 5, elles reçoivent dans le liquide céphalo-rachidien des cellules souches ou une solution témoin, avec deux ponctions de ce liquide à quinze jours d'intervalle au moins et jusqu'à quatre prises de sang dans la veine sous-mandibulaire. Le seul bénéfice annoncé reste interne à l'expérience : le porteur écrit que le projet permettra "d'évaluer l'efficacité d'une thérapie cellulaire dans un modèle de neuroinflammation chez la souris mimant la sclérose en plaques". Il cite des études in vitro sur des cellules souches issues de tissu adipeux humain, et affirme que leurs effets en contexte inflammatoire "nécessitent le recours à un modèle murin d'EAE".
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui touche l’adulte jeune. Aucun traitement n’est actuellement disponible pour ralentir ou stopper la progression du handicap et le pronostic de la progression est très péjoratif sur le plan fonctionnel. Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) ont des capacités bien connues pour limiter l'action du système immunitaire et pour réparer des tissus endommagés. Dans ce projet nous souhaitons évaluer la diffusion de ces cellules dans le système nerveux lorsqu'elles sont injectées dans le liquide céphalo rachidien mais également leur efficacité dans un modèle murin de SEP.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d'une thérapie cellulaire dans un modèle de neuroinflammation chez la souris mimant la sclérose en plaques.
Procédures
Les animaux développeront une Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), c’est à dire une paralysie avec une phase d’aggravation avant une phase de rémission. Pour cela ils seront soumis à une injection du peptide capable de déclencher la maladie . La procédure dure 5 minutes par souris (temps d'anesthésie et d'injection). Deux injections sont réalisées à l'induction et 24/48h après . Une injection unique de cellules souches ou d’une solution contrôle sera réalisée dans le liquide céphalo rachidien (LCR) chez toutes les souris . La procédure sera couplée à un prélèvement de LCR et durera 15 minutes par souris (temps d’anesthésie, de prélèvement et d’injection). Des injections d'une molécule fluorescente seront également réalisées pour détecter la diffusion des cellules souches au bioimageur chez des souris anesthésiées. Des prélèvements sanguins sur ces animaux seront réalisés pour le suivi immunologique, maximum 4 prélèvements au niveau de la veine sous-mandibulaire par animal, distants au minimum de 7 jours. La procédure de prélèvement dure maximum 6 minutes par animal (1min de prélèvement, 5 min de compression du saignement). Deux prélèvements de LCR seront réalisés sur ces animaux anesthésiés, distants au minimum de 15 jours (15min) dont le premier qui sera couplé à l’injection de cellules ou de solution contrôle. Pour les deux prélèvements de LCR isolés, la procédure dure 10 minutes par souris (temps d’anesthésie et de prélèvement).
Impact sur les animaux
La procédure de déclenchement de l’EAE entraînera une paralysie progressive des animaux. Les animaux seront également soumis au stress lié aux multiples expérimentations. Les symptômes seront évalués et des actions adaptées seront mises en oeuvre pour soulager l'inconfort selon le score établi. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué . Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
La totalité des animaux expérimentés sera mise à mort afin de réaliser les études scientifiques sur les organes et sur le sang. La mise à mort sera réalisée par une personne autorisée et expérimentée .
Remplacement
Des études in vitro ont permis de caractériser l’effet immunosuppressif des CSM dérivés du tissu adipeux humain. Cependant leurs capacités immunosuppressives et leurs capacités de réparation par sécrétion de facteurs trophiques en contexte de neuroinflammation in vivo restent mal connues et nécessitent le recours à un modèle murin d’EAE.
Réduction
Un maximum d'informations et d'analyses seront réalisés sur les animaux (prélèvement de la rate, ganglions, sang, LCR, SNC) afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Nous travaillerons avec des groupes de 8 animaux par groupe pour obtenir des tests statistiques fiables. Le modèle EAE est déjà maitrisé au laboratoire, ce qui permettra donc d’utiliser moins d’animaux pour l’optimisation du protocole.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 3 à 5 animaux, dans un environnement enrichi, avec du coton cardé, l'accès à la nourriture sera facilité dès les premiers symptômes de paralysie : nourriture au sol dans la cage, gel pour l'hydratation. Le modèle EAE étant dépendant du stress, les souris ne seront manipulées que par un nombre réduit de personnes, les cages changées au moment du suivi des animaux. Une anesthésie légère est utilisée pour l'injection du peptide immunisant pour éviter stress et inconfort au moment de l'injection qui est réalisée à 2 endroits pour éviter une réaction locale importante en cas d'injection unique. La procédure de déclenchement de l’EAE entraînera une paralysie progressive des animaux. Les symptômes seront évalués sur une échelle de 0 à 5 et des actions adaptées seront mises en oeuvre pour soulager l'inconfort selon le score établi. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué . Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint , l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier les maladies auto-immunes et inflammatoires. L’efficacité de l’induction de l’EAE dans les souris a déjà été démontrée dans la littérature, et le modèle est maitrisé dans l’unité. L’acquisition des cellules effectrices du système immunitaire étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des expérimentations seront menées sur des animaux adultes (6-12 semaines). Une meilleure pénétrance est observée sur des souris à 8 semaines, cet âge sera privilégié afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Evaluation de l’effet du BIO101 sur l’occurrence de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit de la vincristine, un anticancéreux qui provoque une hypersensibilité douloureuse au toucher, mesurée par l'application de filaments sous la patte à plusieurs reprises, avant que les animaux soient tués pour l'analyse des nerfs. Le porteur affirme que les souris ne présentent en dehors des tests aucun signe de souffrance ni de perte de poids, et teste un composé censé prévenir cette neuropathie. Les bénéfices avancés, un futur essai clinique chez des patients sous chimiothérapie, sont renvoyés au conditionnel et au long terme.
Objectifs
Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hépatotoxicité. Dans le domaine de l’onco-hématologie, la vincristine, un agent anticancéreux commumément utilisée pour la prise en charge des lymphomes, constitue une des chimiothérapies les plus neurotoxiques et est responsable de la neuropathie induite par la vincristine, caractérisée notamment par l'apparition d'une hypersensibilité tactile douloureuse. Cette complication impacte autant la qualité de vie des patients que la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de telles stratégies neuroprotectrices constitue un enjeu de santé publique. Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Il a déjà été démontré que la modulation pharmacologique des récepteurs à l’angiotensine II, permettait d’exercer un effet neuroprotecteur dans plusieurs modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Certains éléments du système rénine angiotensine, peu étudiés, pourraient jouer un rôle important dans les phénomènes de neuroprotection/neurorégénération du nerf périphérique. L’activation d'un récepteur du systéme rénine-angiotensine présenterait des propriétés analgésique et neurorégénérative au niveau du système nerveux périphérique. Nous supposons que l'activation de ce récepteur par un traitement préventif pourrait également avoir des effets neuroprotecteurs en l’administrant avant la chimiothérapie. A court terme, nous nous attendons à ce que ce traitement préventif améliore la sensibilité tactile chez des animaux ayant reçu de la vincristine et présentant une hypersentibilité tactile, et restaure/prévienne également les altérations morphologiques des tissus du système nerveux sensitif induites par la chimiothérapie. A plus long terme, nous espérons réaliser la même étude sur nos modèles de neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine, deux autres agents anticancéreux neurotoxiques, avec un effet bénéfique attendu du traitement préventif sur les troubles sensitifs et les atteintes nerveuses induites par les chimiothérapies. La mise en évidence d’un effet neuroprotecteur du traitement préventif dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur le développement des neuropathies induites par la chimiothérapie.
Procédures
Chaque animal (soit 100 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours. Sur les 100, 35 animaux subiront une injection i.p. le matin du traitement préventif puis une injection i.p de vincristine l'après-midi. Sur ces 35 animaux, 10 recevront en plus une injection sous-cutanée d'un bloqueur une heure avant l'i.p. du traitement préventif. L'ensemble des animaux sera également soumis au test des filaments qui permet d'évaluer le dégré de sensibilité tactile, une fois avant le début des traitements puis à J1, J3 et J7. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection intra-veineuse. Les injections seront répétées tous les jours pendant 7 jours, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour le test comportemental. L'injection du bloqueur, qui n'est pas un produit irritant, se fera en sous-cutanée, afin de ne pas dépasser le nombre de deux injections i.p. par jour.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà dévellopé et caractérisé le modèle de neuropathie induite par la vincristine. Dans ce modèle, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant de la vincristine et le traitement préventif présentent une amélioration de leur symptômes, à savoir un retour à la normale de la sensibilité tactile.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées à la vincristine et aux traitements seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des tissus du système nerveux sensitif. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêts seront prélèvés sur chaque animal.
Remplacement
Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la vincristine et de sa combinaison avec le traitement préventif sur des neurones sensitifs humains dérivés est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mis en jeu au niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.
Réduction
Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine. L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, le test de comportement puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur de cadavres.
Raffinement
Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement préventif sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide d'un test d'évaluation de la sensibilité tactile. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, et que le traitement préventif ne présente pas d’effet positif sur la neuropathie, alors la même étude sera réalisée sur deux nouveaux groupes de 5 souris. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement préventif présente un effet positif sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale, à la dose efficace. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul un test d'évitement sera utilisé pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la vincristine et/ou au traitement préventif doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôle pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses au test comportemental seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.
Choix des espèces
Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies d’origine auto-immune et diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 365
2 043 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une partie subit une chirurgie d'induction de neuropathie, une électrophysiologie du nerf sciatique sous anesthésie et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, avec trois tests comportementaux répétés, pour évaluer des candidats médicaments contre des neuropathies auto-immunes et diabétiques. Le porteur décrit des douleurs neuropathiques, une baisse sévère de la mobilité au pic de la maladie et les effets du diabète induit, obésité, hyperglycémie et retard de cicatrisation. Parmi les bénéfices avancés figurent une banque de tissus, des publications et une mise sur le marché "prévue d'ici 2035".
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé au niveau des pattes arrière permettant à la fois leur motricité mais aussi de ressentir des sensations perçues à leur niveau (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une enveloppe autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire) ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie d’origine auto-immune lors de laquelle le système immunitaire s’attaque à la myéline. Dans ce projet nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques acquises qui touchent 4% de la population mondiale et pour lesquelles les traitements actuels ne ciblent pas spécifiquement la démyélinisation pathologique dans ces maladies. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements agissant directement sur la démyélinisation pathologique dans les modèles rongeurs transgéniques de ces maladies. Ils seront donc complémentaires de ceux déjà employés en clinique. Les résultats seront publiés auprès de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - Démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - Sélectionner les produits efficaces pour un futur passage en clinique. - Créer une banque de tissus. - Publier des résultats. Avantages à long terme : -Thérapies complémentaires de celles sur le marché pour les patients. -Une autorisation de mise sur le marché prévue d’ici 2035.
Procédures
- La chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum. - Le modèle de rat Guillain Barré sera induit par une réaction immunitaire. -Les prélèvements de sang via le sinus rétro-orbital et celui du liquide dans lequel baigne le cerveau (liquide céphalo-rachidien) seront effectués au maximum sur 914 animaux, une fois par animal et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances -Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. -Douleurs post-opératoires (4 jours) -Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (durée 5 semaines) entre-coupée d’une diminution sévère de la mobilité lors du pic de la pathologie (durée de 5 jours entre le 15ème et 19ème jour) puis réversibilité progressive des symptômes. -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) -Nuisances associées au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures car des prélèvements terminaux sont nécessaires à l'étude des effets des traitements.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Des méthodes existent pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénérescence et régénérescence du nerf périphérique ne sont pas reproduits in vitro. L'expérimentation animale reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
Un calcul de taille d’échantillon a été réalisé, basé sur la variabilité attendue, la différence biologiquement significative à mettre en évidence avec une puissance suffisante et un risque alpha déterminé. Ces calculs ont été réalisés sur les données d’électrophysiologie et de comportement moteur afin de connaitre le nombre minimum d’animaux à avoir par lot pour chaque test. Dans tous les modèles sauf ceux des souris développant une démyélinisation d’origine auto-immune, les deux sexes seront utilisés car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Pour les modèles de souris de neuropathies d’origine auto-immune uniquement les femelles seront utilisées car 100% présenteront la pathologie, contre 16 à 30% des mâles. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation aux expérimentateurs sera effectuée ; - Pour éviter les douleurs neuropathiques, nous utiliserons de la litière de cellulose. Cette litière présente également l’avantage d’avoir une bonne capacité d’absorption et sera donc particulièrement adaptée à la polyurie des souris diabétiques. De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons en fonction de l’évolution du diabète. - Des fiches individuelles de suivi pré- et post-opératoire seront utilisées ; - Deux fois par semaine, l’évaluation de l’état clinique des animaux sera faite, avec des scores corrélés à l’intensité de la souffrance, à l’aide de plusieurs fiches dont chacune est adaptée aux besoins spécifiques des lignées et au suivi post-opératoire. Selon la souffrance évaluée, il y aura une discussion avec le vétérinaire pour décider des soins à apporter ou de la nécessité d’une euthanasie. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple, en cas de déshydratation, apport d’eau gélifiée ou injections sous-cutanées d’une solution isotonique d’électrolytes. En cas de perte de poids ou d’état affaibli, mise à disposition de nourriture humide et d’eau gélifiée sur le sol de la cage. -Nous sédaterons les rats avant leur euthanasie par dislocation cervicale ; -Une fois par semaine (modèles de souris de neuropathie auto-immune) ou une fois par jour (rat SGB) nous évaluerons l’évolution de la paralysie par une fiche de scoring. -Pour éviter la perte d’identification des animaux et le stress de contention : les animaux seront marqués de manière permanente soit par des poinçons d’oreille, soit par des micro-puces sous-cutanées, soit à la queue par un stylo marqueur non toxique.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez des souris C57Bl6 sauvages ou db/db et sur des rats, ceci nécessitant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Rat/souris : juvéniles et adultes Les animaux seront reçus entre 3 et 6 semaines d’âge. Une partie d’entre eux commenceront à être traités entre 4 et 8 semaines d’âge (procédure 1, 2, 3, 4 et 5). L’autre partie des animaux sera traitée à partir de 20 à 30 semaines d’âge (une partie de la procédure 4). Il s’agit de souris modèles de neuropathie périphérique d’origine auto-immune chez qui les symptômes moteurs s’expriment tardivement. Ces femelles seront générées par FIV, aucun mâle ne sera commandé pour ces modèles.