Troubles nerveux

Les cellules injectées dans le cerveau des souris et des rats de ce projet sont fournies par un client, et les effets indésirables à prévoir seront anticipés d'après les informations que transmettront les donneurs d'ordre. 2 250 rongeurs, 1 125 souris et 1 125 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue puis autopsiés pour prélever leurs organes. Nourris chaque jour d'un aliment contenant 0,2 % de cuprizone pour provoquer une maladie démyélinisante, ils reçoivent selon les groupes une injection unique de cellules par stéréotaxie sous anesthésie, pour des protocoles de deux jours à six mois. Le porteur évoque des phases de douleur aiguë puis chronique, des points limites et un suivi de la locomotion et de la sensibilité mécanique deux ou trois fois par semaine. Sur le remplacement, il recopie mot pour mot son paragraphe sur les effets indésirables, sans citer aucune méthode de substitution.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)

Procédures

L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.

Remplacement

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

Les femelles sont achetées déjà gestantes chez un fournisseur, et les mâles employés pour la défaite sociale sont d'anciens reproducteurs de plus de quatre mois. 510 souris C57Bl/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe met au point un protocole de stress précoce dérivé de la défaite sociale, comparé à une séparation maternelle couplée à un sevrage précoce, pour faire apparaître chez les petits devenus adultes des comportements apparentés à l'anxiété et à la dépression. Une partie des souris subit jusqu'à deux prises de sang à la queue, éveillée, et des séances de comportement cinq jours sur sept pendant trois à quatre semaines, sous une restriction alimentaire qui maintient leur poids à 90 % de la normale, sans que les tests soient nommés. Les petits sont tués pour prélever leur cerveau, et les mâles et les mères sont tués ou réutilisés dans d'autres expériences du laboratoire "à chaque fois que ce sera possible", soit 150 souris déclarées réutilisées.

Objectifs

L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.

Procédures

Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure.

Impact sur les animaux

- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).

Devenir

Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.

Réduction

Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Huntington, elles subissent des injections intracérébrales sous anesthésie, des gavages répétés sur quatre mois, de l'imagerie cérébrale et une batterie de tests comportementaux évaluant motricité, sociabilité, vocalisation, anxiété et anhédonie, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur n'attend que peu d'effets indésirables hormis la douleur des chirurgies et le stress de la contention. Il affirme que les interactions entre neurones et astrocytes ne sont pas reproduites in vitro ou in silico et qu'un modèle murin est nécessaire pour tester cette thérapie génique.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique sans traitement curatif. Elle se caractérise par la mort de neurones du système nerveux central, ce qui provoque d’importants troubles moteurs, cognitifs et comportementaux chez les patients. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la maladie de Huntington. La production et l’élimination du cholestérol, qui est essentiel pour le cerveau, est altéré dans la maladie de Huntington. Le métabolisme du cholestérol implique un dialogue finement régulé encore mal compris entre les neurones mais aussi leurs partenaires, les astrocytes. Les études pilotes montrent que la thérapie génique avec CYP46A1, qui vise à rétablir le métabolisme du cholestérol, impacte aussi les astrocytes et les rend réactifs. Nous faisons l’hypothèse que les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets bénéfiques de cette stratégie thérapeutique. L’objectif de ce projet est de mieux définir le potentiel thérapeutique de CYP46A1 dans un modèle murin pertinent de la maladie de Huntington et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. D’une part, il s’agit d’établir si les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets thérapeutiques de la CYP46A1 : une approche préclinique complète évaluera les effets thérapeutiques au niveau moléculaire, histologique, biochimique, métabolique, comportemental et de la connectivité cérébrale. Il s’agit également de comprendre quels sont les effets de CYP46A1 sur la morphologie des astrocytes du striatum et leur transcriptome (ensemble des gènes exprimés par une cellule). Pour cela, les souris anesthésiées recevront des injections intracérébrales de vecteurs viraux dans le striatum ou un traitement pharmacologique oral qui mime les effets d’une surexpression de CYP46A1. Ces souris seront analysées par un panel d’approches précliniques (analyse des performances motrices et des altérations comportementales par des tests du comportement, de l’imagerie cérébrale non invasive sur souris anesthésiée, par résonance magnétique nucléaire pour identifier des altérations morphologiques et du métabolisme cérébral et enfin par des techniques d’analyses post-mortem variées).

Bénéfices attendus

Cette analyse préclinique va permettre de confirmer les effets bénéfiques d’une thérapie génique et pharmacologique sur les altérations comportementales typiques de la maladie de Huntington mais rarement étudiées dans les protocoles précliniques. De plus, l’analyse par une méthode non-invasive par imagerie cérébrale va permettre d’évaluer l’effet de ces approches thérapeutiques sur un ensemble de paramètres fonctionnels pertinents pour une future étude clinique. Enfin une meilleure compréhension du rôle des astrocytes, des partenaires essentiels aux neurones, permettra de mieux comprendre les effets intracérébraux de ces thérapies et d’affiner leur utilisation clinique.

Procédures

Certaines souris seront soumises à une injection unique intracérébrales sous anesthésie et analgésie pendant environ 30 min, puis à des tests comportementaux étalés sur plusieurs jours avec au moins 2 jours de repos entre chaque tests, qui visent à évaluer les capacités motrices, la sociabilité, la vocalisation, l’anxiété et l’anhédonie des souris. Chacun de ces tests durent moins de 30 min par souris, sauf la cage d’activité qui permet de suivre le comportement spontané de la souris dans une cage dédiée pendant 24h. Certaines souris auront aussi deux sessions d’imagerie cérébrale sous anesthésie (moins de 2h30/souris). Certaines souris recevront à des injections intracérébrales sous anesthésie et analgésie de 30 min, puis une injection retro-orbitaire 6 mois plus tard, sous anesthésie gazeuse, pendant 5 min. D’autres souris recevront des gavages en contention pendant 1 min, 3 fois par semaine pendant 4 mois. souris seront habituées à l’expérimentateur et à la contention avant de démarrer les gavages.

Impact sur les animaux

Très peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole à part la douleur lors des chirurgies intracérébrales, le stress lié à la contention lors du gavage et à la manipulation lors des tests comportementaux.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets bénéfiques de la modulation du métabolisme du cholestérol dans le contexte de la maladie de Huntington. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules, dont les astrocytes. Ces interactions qui sont très probablement à la base des effets thérapeutiques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris transgéniques modèles de la maladie de Huntington qui ont la mutation génétique responsable de cette maladie et permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques très importants de la maladie de Huntington : les altérations comportementales (ex. atteintes motrices, anxiété), les déficits métaboliques et les altérations des connections cérébrales, ainsi que leur potentielle restauration par nos stratégies thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 370 souris. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple, les mêmes souris auront une évaluation extensive de leur comportement ainsi qu’une analyse de plusieurs paramètres par imagerie et pour finir une analyse histologique complète du cerveau avec quantification d’une dizaine de paramètres/souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant les sessions de tests comportementaux et l’habituation à la contention permet de réduire le stress des souris. Un soutien thermique sera mis en place lors des chirurgies et sessions d’imagerie.

Choix des espèces

Les souris modèles de la maladie de Huntington permettent d’étudier les cellules cérébrales (neurones, astrocytes…) in situ, dans un contexte génétique permettant le développement de la maladie de Huntington. Ces souris présentent des altérations moléculaires, cellulaires et comportementales caractéristiques de la maladie de Huntington. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés. La MH est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.

320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.

Bénéfices attendus

L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.

Impact sur les animaux

Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).

Choix des espèces

Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un composé par voie orale ou intraveineuse, puis jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour étudier le devenir de molécules dans l'organisme. Le projet relève de l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de kinases, la sélection des meilleures molécules étant située à "plus long terme". Le porteur affirme que les tests in vitro "ne constituent pas des méthodes alternatives" et que le recours au modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine: maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie, dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacocinétique. L’étude de la pharmacocinétique in vivo d’un nouveau composé permet d’affiner la compréhension et l’analyse du devenir du composé dans l’organisme afin de mieux caractériser son mode d’action et appréhender de potentiels effets indésirables. L'objectif du projet est d'étudier l'effet du système biologique d'un organisme entier sur le devenir d'un composé test au cours du temps suivant son administration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les propriétés pharmacocinétiques de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées dans le but de déterminer leur capacité à atteindre leur cible in vivo. Cela permettra d’optimiser leur posologie (dose et fréquence d’administration) pour l’évaluation de leur toxicité d’une part et de leur activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines d’autre part. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer un composé test une fois par voie orale (quelques secondes) ou intraveineuse (inférieur à 1 minute). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps après le traitement n’excédant pas 3 prélèvements par animal (durée du prélèvement inférieure à 1 minute).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. Les animaux se verront administrer le composé test une fois : par voie intraveineuse pour la moitié d’entre eux, et par voie orale pour l’autre moitié. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront faits au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire, 3 fois maximum par animal, répartis sur une durée maximale de 48h.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de sélectionner les meilleures molécules candidates d'une part, et d'autre part d'avoir une première approche de la pharmacocinétique des composés (absorption, métabolisme), mais ils ne peuvent fournir l'ensemble des éléments caractérisant le devenir du composé dans un organisme vivant. Ils ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, il est nécessaire d'avoir au minimum 3 prélèvements par temps pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques fiables en tenant compte de la variabilité biologique. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons la technique du microsampling : des micro-prélèvements de sang seront réalisés sur un même animal à différents temps de prélèvements réduisant ainsi la variabilité des résultats et le nombre d'animaux nécessaires. Il n'est pas prévu de faire une étude statistique sur ce projet. Les effectifs seront limités à 9 animaux par groupe pour tenir compte de la variabilité biologique (3 animaux par temps de prélèvement) et du nombre de prélèvements répétés possibles (chaque animal sera utilisé pour 3 prélèvements maximum).

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Durant cette période les animaux seront manipulés et habitués à la boite de contention qui sera utilisée pour réaliser les injections intraveineuses. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. Pour les prélèvements de sang, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera utilisée.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant les résultats obtenus serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (dose maximale tolérée et efficacité). Il est donc prévu d’utiliser des souris de même fond génétique que les souches nécessaires et choisies pour la cible thérapeutique considérée. De plus, la souris est un modèle tout à fait pertinent pour les études de pharmacocinétiques en raison de ses similitudes avec les humains dans les processus d'absorption, de métabolisme et d'élimination. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Huntington, elles subissent une injection intracérébrale par chirurgie stéréotaxique vers deux à trois mois, puis, pour une partie, des tests moteurs que le porteur qualifie de "peu stressants" et des séances d'imagerie sous anesthésie. Les souris sont ensuite tuées pour une analyse complète des tissus. Le porteur affirme que seul un mammifère doté d'un striatum et de comportements complexes permet de valider les cibles thérapeutiques visées.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie génétique héréditaire provoquant la dégénérescence (mort) de neurones ce qui se traduit par l’apparition progressive de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques extrêmement invalidants. Le symptôme le plus visible est la chorée, qui se manifeste par des mouvements brusques, imprévisibles et involontaires qui s’étendent progressivement à tous les muscles. La maladie apparaît généralement à l’âge adulte, entre 30 et 50 ans. Il y a plus de 6000 patients en France. Cette maladie est due à une mutation affectant le gène HTT, codant pour la protéine huntingtine (HTT). Bien que cette protéine soit normalement exprimée dans tout l’organisme, la forme anormale (mutée) de la protéine HTT qui est toxique, affecte plus spécifiquement le striatum, une région du cerveau jouant un rôle central dans le contrôle du mouvement, la mémoire procédurale (mémoire dite « à long terme ») et les mécanismes d’adaptation cognitive (comme la perception ou l’apprentissage). La maladie s’étend ensuite à d’autres structures du cerveau et les patients décèdent environ 15 ans après le début des symptômes. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement permettant de ralentir l’évolution de cette maladie. Une meilleure connaissance des mécanismes de la maladie est nécessaire pour trouver des nouvelles cibles thérapeutiques et développer des traitements adaptés. Selon notre hypothèse de travail, des gènes sélectivement exprimés dans le striatum pourraient être impliqués dans sa vulnérabilité spécifique dans le contexte de la MH. En partant de cette hypothèse, une comparaison des gènes exprimés par le striatum en conditions normales ou en conditions pathologiques nous a permis d’identifier des protéines spécifiques du striatum et dont l’expression est diminuée dans la MH. Nos résultats préliminaires indiquent que certaines d’entre elles ont une fonction protectrice vis-à-vis de l’huntingtine mutée. Ce projet vise à comprendre quels mécanismes moléculaires expliquent ces effets protecteurs, et fait appel pour cela à la lignée de souris transgéniques R6/1, un modèle génétique bien caractérisé de la MH. Cela nous permettra de valider sur les plans comportementaux, anatomopathologiques et biochimiques l’effet neuroprotecteur des protéines que nous avons identifiées.

Bénéfices attendus

La maladie de Huntington est une maladie génétique héréditaire qui entraine des troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques extrêmement invalidants et qui évoluent inéluctablement jusqu’au décès du patient. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette maladie. Il est donc nécessaire de poursuivre des recherches pour identifier des cibles thérapeutiques et développer des nouvelles stratégies de traitements. C’est le but poursuivi par ce projet qui a pour objet de tester trois nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle de souris pertinent et bien caractérisé de la MH. Au-delà du cas spécifique de la MH, ce projet pourrait également permettre l’identification de cibles thérapeutiques d’intérêts pour l’ensemble des maladies neurodégénératives qui impliquent des mécanismes se rapprochant de la MH et pour lesquels les options thérapeutiques sont actuellement très limitées et largement insuffisantes.

Procédures

L’ensemble des animaux seront soumis à une procédure d’injection intracérébrale pratiquée à l’âge adulte (2-3 mois) par chirurgie stéréotaxique. Cet acte chirurgical dure environ 30 minutes, est peu invasif, et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. Ils seront toutefois sous surveillance quotidienne pendant une semaine à la suite de cette chirurgie, période à l’issue de laquelle les agrafes ou fils de suture utilisés pour refermer la plaie seront retirés. Certaines souris (224 animaux) seront soumises à des tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacité motrice de façon longitudinale en 4 sessions de 12 jours, avec 1 à 2 jours de repos entre chaque test. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris. Lors des sessions d’imagerie qui concernent 192 animaux, le crâne des souris sera immobilisé dans un cadre stéréotaxique sous anesthésie gazeuse légère (isoflurane 1-2%) tout au long de l’acquisition des données d’imagerie qui dure de 12 à 45 minutes en fonction du type d’image réalisé.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui pourront entrainer différents types de nuisances ou d’effets indésirables tels que : - Une douleur post-opératoire modérée provoquée par la chirurgie stéréotaxique. - Un stress lié à la contention lors des sessions d’imagerie. - Un stress lié à la manipulation par l’expérimentateur lors des tests comportementaux .

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet fait appel à un modèle de souris transgéniques déjà caractérisé de la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, ce projet ne peut, ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques (moteurs et cognitifs) de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, l’expression des protéines d’intérêt pour le striatum est quasi absente dans les modèles de cultures de cellules striatales. Leur expression est détectée principalement dans le cerveau « adulte », totalement « différencié » (ayant subi toutes les étapes du développement) et requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation du cerveau. Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe doté d’un striatum et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre de valider des nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques d’intérêts pour la MH.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 672 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum (comprenant des groupes témoins de référence) a été déterminé en fonction des expériences à réaliser et des différents groupes expérimentaux requis pour pouvoir répondre à notre question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les groupes inclus dans les différentes procédures puissent être étudiés sur différents paramètres. Par exemple les animaux inclus dans la procédure 1 permettront de déterminer l’effet des cibles étudiées sur des critères comportementaux et histopathologiques, et ceux inclus dans la procédure 3 permettront une caractérisation par imagerie in vivo, qui sera corrélée à une analyse histologique.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières permettant d’évaluer l’état de santé des animaux, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.

Choix des espèces

La région la plus touchée du cerveau des patients atteints de la maladie de Huntington est le striatum. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones striataux dans leur environnement cérébral complexe. Ces souris expriment la partie du gène qui porte la mutation, mimant ainsi le défaut génétique observé chez les patients atteints par la maladie de Huntington. Elles présentent aussi des altérations motrices et cognitives et des altérations cellulaires caractéristiques de la maladie de Huntington. La maladie de Huntington est une maladie qui se déclare chez l’adulte mais qui présente des déficits subtils dès le début du développement du cerveau et qui s’aggravent avec le temps. Ce projet vise à valider des cibles thérapeutiques susceptibles d’avoir un effet neuroprotecteur dans la maladie. Pour cette raison les animaux seront traités avant l’apparition des symptômes (2 mois) et les effets sur la pathologie seront étudiés à des stades précoces (jusqu’à 5 mois).

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris exprimant une forme humaine mutée de la protéine tau reçoivent des injections intrapéritonéales ou orales deux fois par semaine pendant deux mois, avant mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur teste des sucres complexes censés freiner les tauopathies comme la maladie d'Alzheimer, dont il affirme déjà qu'ils "se révèlent utiles". Il présente la souris comme "la seule espèce mammifère" modifiée pour exprimer la tau humaine mutée et juge la confirmation in vivo "nécessaire".

Objectifs

Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (=tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, notre laboratoire étudie le rôle de certains sucres complexes (=oligosaccharides), sur la modification anomale de la protéine tau. Il a notamment été montré que certains sucres complexes sont critiques pour le développement et l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La forme anormale de tau dans les cellules neuronales résulte de l’interaction de la protéine avec ces oligosaccharides complexes internalisées dans les neurones des sujets malades. Enfin des études préliminaires ont montré la capacité d'un oligosaccharide mimétique à diminuer le développement des tauopathies en rentrant en compétition avec les sucres complexes de la membrane cellulaire et en diminuant la propagation de la tauopathie. Les oligosaccharides mimétiques se révèlent dès lors être utiles dans le traitement des tauopathies, et tout particulièrement dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre objectif va être de démontrer qu'il est possible en utilisant nos oligosaccharides mimétiques de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle murin exprimant la protéine Tau humaine mutée responsable du développement de la maladie. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans ce modèle, sélectionné pour sa capacité à reproduire plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancé…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Actuellement les traitements sur le marché sont uniquement symptomatiques et ont un bénéfice clinique limité pour les patients. Il est ainsi important de développer un traitement capable de stopper ou ralentir les mécanismes impliqués dans le développement de la maldie d'Alzheimer. Ce projet consiste donc à caractériser l'effet d'une nouvelle classe de molécules thérapeutiques ciblant un mécanisme impliqué dans l'agrégation anormale de la protéine Tau, qui mène aux troubles cognitifs de la maladie.

Procédures

Les procédures 1 et 2 consistent en des traitements 2 fois par semaine (les matinées du lundi et jeudi) pendant 2 mois par injection intra-péritonéale ou administration par voie orale des molécules d'intérêt (max 0,1 ml/souris) ou des mises à mort afin de récupérer le tissu cérébrale en vue d'analyses. Pour un groupe d’animaux (6 animaux par cage) il faut environ 10 min par traitement. Cela comprend la pesée et l’injection intra-péritonéale (ou administration par voie orale) des 6 animaux du même groupe.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans nos procédures sont liés à l’élevage en captivité des animaux sur plusieurs mois et la manipulation des animaux (contention, change). Pour information, les animaux sont utilisés à des âges inférieurs à 5 mois, c'est-à-dire avant le début des signes cliniques moteurs modérés induits par la tauopathie dans ce modèle. Nos deux procédures sont classées modérées et les nuisances et effets indésirables attendus sont liés à la contention et à l'insertion répétée de l'aiguille en intra-péritonéale même si le site d'injection est alterné (droite et gauche). Pour information l'analyse toxicologique de nos molécules faite chez la souris C57BL6 par un laboratoire pharmaceutique n'a pas montré de toxicité même à forte dose (500 mg/kg) pour la voie orale. Les effets indésirables pourront également être évalués lors des études de biodisponibilité des produits qui seront réalisées par la même société en amont de cette partie expérimentale. Par ailleurs de précédentes études utilisant nos molécules n'ont pas mis en évidence de potentiels effets toxiques de la molécule aux doses utilisées (voie intra-péritonéale, 2 mois, 2x/semaine, 25 mg/kg).

Devenir

Les animaux de l'ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.

Remplacement

La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine Tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie caractéristique de la maladie d'Alzheimer. Des résultats antérieurs obtenus sur des cellules primaires issues de ce modèle de souris montrent des effets prometteurs de notre molécule d'intérêt. La confirmation dans un modèle murin est maintenant nécessaire.

Réduction

Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par groupe (12 souris / groupe pour la procédure 1 et 20 souris / groupe pour la procédure 2) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. Pour chaque animale, différentes régions du cerveau seront étudiés afin de caractériser l'évolution de la pathologie. Ainsi chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 12 ou 20 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2 et 4 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 256 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux dans le cadre de la sélection de la dose optimale, la biodisponibilité des molécules les plus efficaces a été réalisée en externe par un laboratoire pharmaceutique.

Raffinement

Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : poil hérissé -Sa posture, sa démarche et comportement : dos voûté, léthargie ou réticence à se déplacer, état défensif, grattage ou morsure. -On explore son environnement : absence de toilettage, redressement sur ses pattes arrière, diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée. L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort (sacrifice). En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée pour un effet antalgique et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse.

Choix des espèces

Notre objectif est de valider l’importance de certains sucres complexes, dans un modèle mammifère de tauopathie. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 4,5 mois (mise à mort à 4 et 4,5 mois), c’est -à-dire de l'âge où la tauopathie commence à se développer (2 mois) et sacrifiées avant l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris « contrôle » de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).

60 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'injection de vecteurs viraux dans le cerveau, puis des prélèvements mensuels de sang et de liquide céphalo-rachidien, avant d'être tués par perfusion intracardiaque pour prélever leur cerveau. Le projet valide des outils de thérapie génique avant un passage chez l'humain. Le porteur justifie le recours au primate en invoquant explicitement l'"éthique spéciste" qui interdit ces approches invasives chez l'humain, et la proximité anatomique du macaque avec l'espèce humaine.

Objectifs

En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitements curatifs, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, Alzheimer et autres démences, sclérose latérale amyotrophique…) a considérablement augmenté au cours des dernières décennies et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu’elles soient génétiques ou acquises, un grand nombre de ces affections pourraient bientôt bénéficier de l’apport de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux. La famille des virus adéno-associés (AAV) sont des outils de thérapie génique très utilisés. De nombreuses recherches « in vitro » sont menées pour améliorer sans cesse leur efficacité en termes de quantité /qualité produite, de tolérance, de diversité de molécules rapportées, de ciblage des cellules au sein des organes à soigner. La phase suivante de validation de ces outils sont des études « in vivo » chez l’animal pour vérifier leur non toxicité, leur tolérance, leur diffusion, leur capacité d’entrée dans les cellules cibles (on parle de transfection). Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs viraux pour l’heure est l’injection intracérébrale par stéréotaxie. La mesure des effets des vecteurs viraux se fait ensuite par des analyses biochimiques sur de prélèvements biologiques puis cellulaires après leur mise à mort pour prélever le cerveau. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils chez le Primate Non Humains (PNH). Le but de ce projet est de valider dans le cadre d’une activité pré-clinique de service chez le macaque de nouveaux vecteurs viraux qu’ils soient porteurs d’une molécule « contrôle » fluorescente ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouveau composé à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes précoces et sévères (formes génétiques en particulier) des maladies neurodégénératives.

Procédures

Procédure chirurgicale: 1 par animal, la durée de la chirurgie est de 60-120 min en fonction du nombre de structures ciblées et leur volume d’injection. Prélèvement sanguins: 2 par animal mensuel et LCR (liquide céphalo-rachidien): 1 par animal mensuel, la durée d'un prélèvement est de environ 15 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou au prélèvement biologique fait sous anesthésie générale. Pour la chirurgie: stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour les prélèvements (sang, LCR) : : stress de la contention et de l’anesthésie, stress, hématome, douleur possible. L’effet l’administration des AAV et de leur toxicité possible est l’objet de ce projet, même si les AAV sont réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis pour étudier l’efficacité du traitement sur le modèle animal pathologique. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Des études préliminaires réalisés chez le rongeur ont permis de valider la diffusion et la non-toxicité des vecteurs AAV. Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies (ce qui est le cas avec les AAV) testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre évalués à 3 études par an, comprenant 4 animaux par étude (soit un total de 60 animaux sur 5 ans). Nous bénéficions d’un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les composés testés en traitement sur nos PNH auront été préalablement testés in vitro par nos clients, pour déterminer les doses à utiliser et s'affranchir d’éventuels effet toxiques. Enfin, les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude s’ils sont destinés de prime abord pour des études histologiques visant à confirmer l’efficacité au niveau cellulaires des différents traitements, peuvent également renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque). Ceci afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bienêtre et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud autour d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. Pour un score sup à 10, le sujet sort immédiatement du protocole d’expérimentation, pour réaliser les traitements et les soins nécessaires en accord avec le vétérinaire jusqu’à son rétablissement (score inférieur à 5). Au-delà de 15 , la décision d’euthanasie compassionnelle sur avis vétérinaire est prise. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

L’utilisation des vecteurs viraux a déjà fait l’objet d’une validation préalable chez les rongeurs (rats, souris) tant chez des modèles naifs que sur des modèles de maladies neurodégénératives. Bien que notre projet n’implique pas la modélisation d’une maladie neurodégénérative per se chez le PNH, l’utilisation de la thérapie génique en tant qu’expérience préliminaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les déficit mnésiques et/ou moteurs observés dans ces pathologies. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance de notre stratégie de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes précoces et sévères (formes génétiques en particulier) de ces maladies. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger les patients, en démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus prêt de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.