Troubles nerveux

195 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie et une IRM, une partie enchaînant une batterie de tests comportementaux étalée sur trois semaines, dont le détail n'est pas précisé, pour modéliser une démence vasculaire par microinfarctus. Le porteur indique que les nuisances tiennent surtout à la chirurgie, douloureuse, et que l'IRM sous anesthésie peut provoquer détresse respiratoire et hypothermie. Il affirme qu'un tel projet de neurosciences intégratives ne peut être mené in vitro, le cerveau étant prélevé après la mise à mort.

Objectifs

L’incidence des démences augmente progressivement avec l’âge à partir de 65 ans et atteint 28,5% de la population après 90 ans, dont 20% des formes sont dites « vasculaires ». La démence vasculaire est caractérisée par un déclin lent et progressif de la mémoire, de la pensée, du jugement et de l’apprentissage, dû à un défaut d’apport sanguin. Diagnostiquée radiologiquement, la maladie vasculaire cérébrale comprends deux types de lésions tissulaires qui sont majoritairement retrouvées chez les patients atteints : (i) les micro-infarctus, et (ii) les lésions lacunaires, caractérisées par une absence de tissu. Les études post-mortem indiquent que 64% des patients déments vasculaires présentent ces lésions, contre 24% dans la population générale. Ces deux lésions sont engendrées par l’occlusion, transitoire ou définitive, d’artères cérébrales. Les vaisseaux concernés sont des artères qui partent de l’extérieur du cerveau (cortex) pour en gagner le centre, la substance blanche, constituée de faisceaux de fibres nerveuses. Outre les conséquences locales sur la structure cérébrale, les lésions entraînent chez l’Humain une désorganisation des tissus, une diminution des zones contrôlant les fonctions et des altérations du fonctionnement de certains structures. Les modèles génétiques de la maladie sont peu reproductibles et pas adaptés à l’étude radiologique. Les modèles préexistants comme les injections carotidiennes de particules synthétiques provoquent principalement des lésions lacunaires, et la destruction d'artères par laser nécessite une technologie peu accessible. Aussi, les objectifs du projet sont : (i) d'établir un nouveau modèle de microembolies (caillots sanguins) cérébrales chez le rat permettant la génération des microinfarctus, se rapprochant ainsi de la physiopathologie de la démence vasculaire humaine, et (ii) de comparer ce modèle aux données de la clinique humaine en imagerie par IRM, en histologie, par des tests de mémoire et de comportement (anxiété et dépression). Des outils pharmacologiques (antidépresseur, anxiolytique) seront administrés aux animaux pour ce dernier volet lors des tests de dépression et d’anxiété.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux appréhender les mécanismes d'apparition des troubles fonctionnels, neurocomportemenaux et cognitifs dans la pathologie microembolique cérébrale, d'en évaluer leur rôles dans l'évolution vers la démence cérébrale, et d'y tester des approches thérapeutiques. Ce modèle à l'avantage d'utiliser des thrombus naturels, qui n'ont jamais été utilisés jusqu'à présent et se rapprochant donc de la clinique humaine.

Procédures

Tous les animaux subissent : une chirurgie sous anesthésie générale de 20 minutes, une IRM post-chirurgie d'une heure sous anesthésie générale, une ponction de LCR sous anesthésie léthale. Les animaux de la procédure 2 subissent, en sus : une batterie de test comportementaux répartis sur 3 semaines, à raison de 1 test par jour d'une durée variable de 10 à 120 minutes. Cette batterie est appliquée à J0 et à 3 mois post chirurgie; Une IRM d'une heure sous anesthésie générale. Pendant les tests comportementaux, 45 animaux receveront une dose unique de carbamazépine avant chaque test, 45 autres animaux receveront une dose unique de desipramine avant chaque test.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux seront essentiellement dues à la chirurgie, qui entrainera une douleur, et la pathologie qui peut entrainer les troubles fonctionnels. L'imagerie en IRM sous anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie chez certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur l'impact de microembolies sur le fonctionnement cérébral et l'apparition de toubles comportementaux, un tel projet de neurosciences intégratives ne peut pas être mené avec des méthodes alternatives in vitro et nécessite l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 195 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études neurocomportementales et la réponse aux différentes conditions présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie. L'utilisation de l'imagerie par résonnance magnétique permet un suivi non invasif des lésions et de fait, l'économie de 135 animaux.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air), avec enrichissement. Des mesures de cocooning seront mise en place afin de diminuer au maximum la douleur, et l'anxiété des animaux. Des mesures de surveillances post-anesthésiques seront mise en place afin de s'assurer que les animaux ne présentent pas de stress majeur dans les 48 heures suivants la chirurgie à raison de 2 visites par jours, les animaux seront ensuites évalués une fois par jour. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas, et les animaux seront mis à mort en fonction des points limites décrits.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces très employées dans le cadre de l'étude des maladies neurodégénératives. Les caractéristiques anatomiques et physiologiques vasculaires sont similaires à celle de l'Humain. Les rats ont une taille d'encéphale permettant une étude approfondie en imagerie. Les animaux de la phase 1 de l'étude seront inclus à l'äge de 10 semaines. Les animaux de la phase 2 seront inclus à l'âge de 6 semaines. Compte tenu du conditionnement opérant d'un mois pour le test du Touchscreen, ils seront ainsi opérés à l'âge de 10 semaines.

Pour chercher comment le cerveau récupère d'une héminégligence, perte de perception d'une moitié du champ visuel après un AVC, 15 singes écureuils vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Tous ont déjà subi des procédures légères dans un projet antérieur. Dix d'entre eux subissent une lésion chirurgicale du cerveau sous une anesthésie pouvant durer huit heures, et jusqu'à trois singes du groupe témoin reçoivent, après retrait d'une partie du crâne, un dispositif de fixation de la tête, avec jusqu'à quatre chirurgies chacun. Tous passent jusqu'à quatre IRM et des enregistrements cérébraux sous anesthésie, et les singes implantés en font aussi éveillés, pendant des tests visuels que le résumé ne détaille pas. Les singes lésés sont tués trois ou douze mois après la lésion. Le porteur écrit que chez les primates la récupération est "rapide et spontanée", grâce à un mécanisme "qui n'existe pas chez l'être humain", et juge pourtant le primate non-humain le plus "pertinent" pour une transposition à l'humain.

Objectifs

Une très large majorité des cas d’accident vasculaire cérébral droit montre des troubles de la perception consciente qui conduisent à des symptômes neuropsychologiques handicapants tels que l’héminégligence. Ce trouble se caractérise par une perte de la perception de la moitié du champ visuel. Les patients héminégligents semblent vivre dans un monde amputé d’une moitié ; ils ne mangent pas la partie gauche de leur plat, ne voient pas les obstacles situés sur le côté gauche, mais plus important encore, la vie quotidienne d’un patient héminégligent présente plusieurs dangers, qui incluent des risques d'accidents de la route et des chutes graves. Seulement 40% des patients héminégligents récupèrent une capacité visuelle normale dans les 6 mois qui suivent leur accident vasculaire. Cela signifie que chaque année, 480.000 nouveaux patients européens resteront héminégligents, ce qui nuit à leur qualité de vie et les empêche de retourner au travail. Il a récemment été démontré qu'une bonne communication entre deux aires du cerveau (le lobe frontal et le lobe pariétal) est essentielle à la récupération de l’héminégligence. Cependant, chez l’animal, la récupération de l’héminégligence est rapide et spontanée même dans les cas de coupure de communication entre ces deux régions du cerveau. Les primates utilisent donc un mécanisme de récupération qui n’existe pas chez l’être humain. C’est pourquoi ce projet propose d’étudier la récupération de l’héminégligence chez le primate afin de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques chez l’être humain.

Bénéfices attendus

En étudiant la récupération de l’héminégligence chez le primate, ce projet a pour objectifs de mieux en comprendre les mécanismes et ainsi d’en déduire de nouvelles pistes thérapeutiques. A terme un traitement pourrait améliorer la récupération des patients souffrant d’héminégligence suite à un accident vasculaire cérébral. De plus, en validant l'utilisation du primate comme modèle d’héminégligence et en proposant des tests d’évaluation de ce trouble adaptés, notre étude apporte une base indispensable aux tests de traitements pharmacologiques. Cette étape est nécessaire avant la mise en place des essais chez l’être humain. Cela représente un gain de temps important dans le processus de développement d’éventuels traitements.

Procédures

• Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) : Les 15 animaux (le groupe contrôle et les deux groupes lésés) réaliseront au maximum 4 IRM (séquences complètes) avec une durée d’anesthésie maximale de 7 heures pendant toute la durée du projet. • Afin de maintenir la tête des animaux pendant les enregistrements, un dispositif doit être implanté sur la tête de l’animal. Ce dispositif comprend également une chambre d’enregistrement dans laquelle une partie du crâne a été retirée pour permettre l’enregistrement de l’activité cérébrale. Cette chirurgie aura lieu une fois pour 1 à 3 animaux du groupe contrôle avec une durée maximale d’anesthésie de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. Il est possible que d’autres chirurgies soient effectuées (3 au maximum par animal) dans le cas où l’animal perdrait le dispositif ou si les soins d’entretiens deviennent difficiles. Ces 1 à 3 animaux du groupe contrôle auront ainsi au maximum 4 chirurgies (1 pour la pose de la chambre d’enregistrement/retrait d’une partie du crâne, 1 pour la remise en place du dispositif et 2 pour entretiens du dispositif). • Afin de créer le trouble de l’héminégligence, une lésion chirurgicale du cerveau est réalisée durant une chirurgie chez 10 animaux (les 2 groupes lésés) avec une durée d’anesthésie maximale de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. • Les animaux implantés du dispositif d’observation (3 animaux du groupe contrôle) participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau et des neurones pendant qu’ils réalisent des tests visuels. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. • Les animaux anesthésiés (15 animaux) participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. • Les animaux (15 animaux) seront euthanasiés. Les deux groupes ayant eu une lésion (2 groupes de 5 animaux chacun) seront euthanasiés respectivement 3 et 12 mois après la lésion. Le groupe contrôle (5 animaux) seront euthanasiés après que l’euthanasie des deux autres groupes ait été réalisée.

Impact sur les animaux

Il est attendu que la lésion réalisée induise une perception altérée de la moitié de leur vision et impacte leur comportement (déplacement et alimentation difficiles pouvant entraîner une perte de poids). Les animaux ayant eu une chirurgie (retrait d’une partie du crâne, lésion et pose de chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête) pourront ressentir de la douleur à la suite de la chirurgie. La chirurgie peut, dans certains cas, causer une accumulation de liquides et/ou abîmer la couche de tissu protectrice du cerveau. Les animaux soumis à une anesthésie pourront présenter des difficultés à se déplacer (de 1 à 4 jours). L’implantation d’une chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête peut induire une difficulté à se déplacer et des collisions à cause de l’encombrement (pendant quelques jours avec une variabilité individuelle). L’isolement nécessaire aux tâches comportementales peut induire un stress chez l’animal concerné. Celui-ci peut notamment se manifester par des stéréotypies (gestes répétitifs, rythmés sans but apparent) ou des dépilations. Suite à des bagarres, une chute ou un choc, l’animal pourrait perdre son dispositif composé de la chambre d’enregistrement et du système de fixation de la tête. L’installation de la chambre d’enregistrement peut faciliter une infection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures afin de pouvoir effectuer différents prélèvements (cerveau…) pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler à des fins thérapeutiques les processus de récupération du cerveau suite à un accident vasculaire chez le primate. Ces processus sont complexes ce qui rend difficile/impossible à l’heure actuelle leur modélisation. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Par ailleurs, il est indispensable d’obtenir des données d’études sur les modèles animaux avant de pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques chez les patients humains. Le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.

Réduction

La taille des groupes et le nombre total d’animaux nécessaire pour cette étude a été déterminée par des calculs de puissance. Il a été ainsi établi que 3 groupes de 5 animaux pour 15 animaux au total seraient essentiels pour la réalisation de ce projet. Des tests statistiques seront nécessaires pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Tous les animaux de ce projet ont déjà réalisé des procédures de classe légère lors d’un précédent projet validé par le comité d’éthique et ayant obtenu un agrément.

Raffinement

Etat Général : - Entraînement des animaux avec renforcement positif (récompense) pour créer une routine qui limite les contentions et le stress lors des manipulations et les tâches demandées. - Adaptation de l’hébergement, de l’enrichissement et l’alimentation pour stimuler les animaux (recherche nourriture, jeux, vidéo…) et limiter les comportements anormaux (mouvements répétitifs, immobilité…). Chirurgies et IRM : - Actes réalisés sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après l’opération), surveillance accrue de l’animal anesthésié pour éviter toutes les complications (déshydratation, baisse de la température, rythmes cardiaque et respiratoire, infection…). Ces risques sont bien identifiés et une réponse est apportée à chaque point. Par exemple : tapis chauffant pour la température, gel ophtalmique pour l’hydratation des yeux, désinfection et utilisation de matériel stérile pour éviter l’infection, anesthésique local pour l’intubation et l’installation des barres d’oreilles (dispositif de maintien de la tête fixe), intubation pour sécuriser la respiration, matériel chirurgical permettant d’avoir un geste précis et en limitant les saignements… - Le dispositif implanté sera le plus petit possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie… - Limitation des IRM à une fois toutes les 2 semaines. Post-opératoire : - A chaque anesthésie, la récupération de l’animal doit être complète avant la poursuite du reste du projet. - Après lésion, les animaux sont hébergés par 2 dans des cages ajustables pour prévenir les chutes. Ces cages conservent des aménagements permettant une stratification de l’espace tout en préservant l’animal des risques de chute. Une alimentation riche pourra être proposé pour faciliter la récupération. - Suite aux différentes chirurgies, les comportements alimentaires et sociaux des animaux peuvent être modifiés, ils feront donc l’objet d’une surveillance augmentée. Des observations post-anesthésie et post-chirurgie régulières et rigoureuses seront faîtes pour détecter le moindre inconfort de l’animal. Points scientifiques : - Dès que les données permettant de répondre à nos questions scientifiques seront obtenues, les expérimentations impliquant les animaux seront arrêtées.

Choix des espèces

La complexité des processus de récupération d'un accident vasculaire cérébrale rend indispensable d’utiliser un modèle suffisamment proche de l’Homme pour tester ensuite de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le primate non-humain est ainsi un modèle particulièrement approprié pour notre étude. De plus, les capacités d’apprentissage des singes permettent la réalisation de tâches comportementales similaires à celles réalisées par l’Homme. La complexité du cerveau rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation de ces processus. Il est primordial d’étudier ces aspects dans un modèle primate non-humain. Il y a plusieurs raisons motivant le choix du singe écureuil par rapport à d’autres espèces de primates : Le choix de cette espèce a été fait car le singe écureuil est plus facile d’accès et est particulièrement adapté à ce genre d’étude en comparaison du macaque. La taille de cette espèce est un paramètre intéressant puisqu’il permet d’utiliser des appareils IRM plus puissants dont le diamètre d’entrée est plus petit. De plus, le choix ne s’est pas porté sur les rongeurs car contrairement aux primates non humains, les rongeurs ne semblent pas présenter de symptômes d’héminégligence. Par ailleurs, nous n’avons pas choisi le macaque car il a été démontré qu’une lésion de la zone cérébrale causant le trouble de l’héminégligence chez cette espèce induisait des symptômes qui pouvaient perdurer plusieurs mois, voire même plusieurs années. Ces différents points expliquent les raisons pour lesquelles nous avons décidé d’utiliser le modèle du singe écureuil pour ce projet. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge supérieur à 3 ans). Étant donné que l’âge est un facteur de risque pour les accidents vasculaires cérébraux, nous utiliserons des animaux les plus âgés possibles. En effet, il a été observé chez d’autres espèces de primates que par rapport aux plus jeunes, les animaux âgés étaient plus sensibles à la lésion et que le syndrome obtenu était généralement plus stable.

2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection virale, avec douleur post-opératoire, puis une restriction alimentaire faisant perdre 10 à 15 % de leur poids pour les motiver aux tests de mémoire. Le porteur teste des molécules censées retarder le déclin cognitif dans un modèle de maladie d'Alzheimer, les pistes thérapeutiques restant attendues. Il indique que l'évaluation de la mémoire ne peut se faire que sur des animaux.

Objectifs

L’hippocampe est une des premières structures cérébrales atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Une dysfonction de ce dernier entraîne des troubles de la mémoire épisodique, celle qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Deux processus cognitifs sous-tendent cette mémoire : le pattern separation – qui permet la discrimination de deux souvenirs plus ou moins similaires – et le pattern completion – qui permet de reconstruire une information globale à partir de souvenir partiels. Des défauts en pattern separation et pattern completion ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. Notre équipe a récemment découvert des molécules permettant d’améliorer le pattern separation et du pattern completion, chez la souris non-transgénique, sans aucun effet délétère. A la suite de cette découverte, nous souhaitons les utiliser afin d’améliorer le pattern separation et le pattern completion dans un modèle de souris Alzheimer. L'objectif de ce projet est de tester si ces nouvelles molécules permettent de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus permettant d’exprimer une molécule candidate, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris non-injectées. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer (MA) avec ce même virus, nous espérons retarder leur déclin cognitif. En utilisant d’autres constructions virales liées à cette molécule candidate, nous souhaitons restaurer à la fois le pattern separation et le pattern completion chez les souris modélisant la MA. Ce projet permettra donc la caractérisation et l’utilisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant de nouvelles pistes thérapeutiques. En fonctions des résultats obtenus, nous pourront développer une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer (MA). Il est à noter que les virus utilisés servent uniquement à faire exprimer une molécule dans une zone précise du cerveau et n’ont aucun effet nocif ou délétère sur les animaux.

Procédures

Nous souhaitons retarder le déclin cognitif de souris modélisant la maladie d'Alzheimer en injectant directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Pour ce faire, les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus. La durée de la chirurgie est d'environ 40 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux non-aversifs. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate.

Impact sur les animaux

Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique nous permettant d’injecter des virus dans une zone très précise du cerveau, particulièrement touchée dans la maladie d’Alzheimer. Cette méthode est stressante pour les animaux et entraîne une douleur post-opératoire pendant environ 48h. L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Nous avons deux tests non-aversifs basés sur le principe de récompense qui nécessite une restriction alimentaire, afin de motiver nos animaux à apprendre ces tests. Cette restriction alimentaire entraine une perte maximale de 10 à 15% du poids initial des souris, privation classiquement utilisée dans ce test, qui peut entraîner un stress léger mais ne met pas en péril le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux injectés passés en tests expérimentaux ne seront pas gardés en vie à la fin de l'expérience et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires réalisés dans le laboratoire. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux. De plus, les modèles de souris Alzheimer que nous utilisons dans ce projet sont bien référencés et caractérisés.

Réduction

Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux et que 6 animaux par groupe étaient nécessaire pour nos analyses morphologiques et biochimiques.

Raffinement

Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Le transport est réalisé plusieurs jours avant le début des expérimentations, pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire le stress du transport. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal, sont surveillés régulièrement et des points limites suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un analgésique et anesthésique (gazeux) pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite. Concernant les tests comportementaux (non-aversifs en eux-mêmes) nous devons effectuer une restriction alimentaire chez nos animaux, entraînant une légère perte de leur poids initial.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier la mémoire et la cognition chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous souhaitons évaluer les souris modélisant la maladie d’Alzheimer et leurs contrôles à plusieurs stades de développement afin de 1. Caractériser leur déficit en pattern separation et pattern completion et 2. Tester nos molécules candidates afin de stopper ou retarder ces déficits en intervenant à un âge précoce de la maladie d’Alzheimer. Ainsi, nous utiliserons des souris à deux stades de développement (âge précoce : 4-7 mois ; âge tardif : > 7 mois).

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la leucodystrophie métachromatique, une maladie neurodégénérative infantile, elles reçoivent par chirurgie un implant sous-cutané de cellules encapsulées et jusqu'à six prélèvements sanguins mensuels, puis sont euthanasiées pour analyses post-mortem. L'étude évalue une enzymothérapie visant les patients déjà symptomatiques, pour lesquels il n'existe à ce jour aucun traitement. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro et que la souris est la "seule espèce" pour laquelle un modèle de cette maladie a été créé.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une aggravation très rapide et un décès des patients. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques et notamment sur l'inflammation cérébrale, une composante majeure de la maladie. Nous proposons d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie via une sécrétion continue de la protéine (mode d'administration confidentiel) dans le modèle murin de la maldie déjà bien caractérisé.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de MLD ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique chez les patients déjà symptomatiques pour la LDM.

Procédures

- prelevement sanguin une fois par mois soit 6 au maximum, durée d'environ 5min sous anesthésie - une chirurgie d'implantation une fois à 6 mois avec une procédure par animal d'une durée maximale de 20min sous anesthésie et analgésie - euthanasie à la fin du projet

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Enfin, l'implant de ce projet a une taille minimale comparé à notre étude précédente avec des implants rectangulaires de 25mmx12mmx13mm d'épaisseur, qui était déjà bien tolérés. Il y a de plus un risque anesthésique et un risque de douleur post chirurgical.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires post-mortem.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la Leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de l'implantation en sous cutanée des cellules encapsulées permettant une sécrétion continue d'arylsulfatase A. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 384 souris (comprenant 2 répétions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés. Enfin, en terme de raffinement nous avons réduit la taille de notre dispositif. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard avec mise à disposition d'enrichissement

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la MLD et surtout pour évaluer l’effet thérapeutique de la sécrétion en continu d'ARSA par des cellules encapsulées. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD déficient pour l’enzyme ARSA, le modèle murin de la pathologie, génétiquement modifié est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Les souris développent tardivement à partir de 15-18 mois, un phénotype ataxique et moteur. Ce phénotype tardif n’est pas dommageable, sachant que nos souris seront euthanasiées à 12 mois soit avant l'apparition des anomalies motrices. Les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (acclimatation à la zone A1 de l’animalerie, et habituation au manipulateur) avec un début du traitement à 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris (souris symptomatiques). La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois selon la durée du traitement et selon les différents groupes.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une incision de la peau et du muscle de la patte arrière sous anesthésie pour induire une allodynie, puis reçoit des candidats médicaments par diverses voies avec parfois des prélèvements de sang répétés. Le porteur indique que le modèle repose sur la douleur provoquée par l'incision plantaire et signale des risques de non-réveil ou de mauvaise cicatrisation. Il présente ces deux modèles comme intégrés à "l'offre de service" de l'entreprise, destinée à des clients développant des analgésiques.

Objectifs

Dans le cadre de son travail, le laboratoire teste des candidats médicaments. Le but de ce projet est de tester des molécules dans un modèle de douleur post-opératoire chez la souris. Les douleurs post-opératoires sont des douleurs survenant à la suite d’une intervention chirurgicale. Les patients atteints de ces douleurs présentent des symptômes caractéristiques tels qu’une hyperalgésie (sensation douloureuse ressentie comme encore plus douloureuse) et une allodynie (sensation non-douloureuse ressentie comme douloureuse). Ce type de douleur est encore principalement traité par des opiacées, mais aussi des antiépileptiques ou anti-inflammatoires. Le traitement ne peut donc pas rester perdurer sur du long terme sans entrainer dépendance, accoutumance ou de lourds effets secondaires. Aux vues du nombre d’opération réalisées chaque jour, il est important de trouver des molécules fiables et efficaces pour traiter les douleurs post-opératoires. Deux modèles précliniques de douleur ont donc été mis au point pour étudier les nouveaux traitements contre ces douleurs post-opératoires. Un de ces deux modèles consiste à inciser seulement la peau plantaire, alors que l’autre consiste à inciser en plus les tissus profonds. L’incision de la peau et des tissus profonds induit une douleur plus importante que l’incision de la peau seule. L'incision de la peau et des muscles imite mieux la chirurgie invasive (une douleur aiguë intense) et conduit à une douleur chronique (entre 4 et 5jours). Ce modèle de douleur post-opératoire peut être associé avec des tests d’allodynie mécanique : von Frey électronique ou monofilament de von Frey. Ces tests sont couramment décrits dans la littérature. Le test de monofilament de von Frey est utilisée avec la méthode dit “up-and-down” et va permettre de déterminer le seuil 50% de retrait de la patte en gramme. Le von Frey électronique va, lui, permettre de donner une valeur en gramme du seuil de retrait de la patte.

Bénéfices attendus

Ces deux modèles seront intégrés dans l’offre de service de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés avec un modèle proche de la clinique, qui permet de proposer de tester ces candidats médicaments sur l’allodynie mécanique chez la souris.

Procédures

Les animaux sont soumis à une incision de la peau et une incision du muscle de la patte arrière droite, cela dure environ 4-5min par animal. Ils sont soumis à l’administration de composés à potentiel anti-douleur par voie p.o., ip., sc., i.v. ou i.m. Les souris peuvent recevoir une injection ou deux si le client demande une co-admnistration. Le geste de l'admnistration dure 1minute environ. Les souris peuvent aussi être soumises à des prélèvements de sang afin de surveiller la pharmacocinétique d’un composé. Cela peut être des prélèvements uniques ou répétés en fonction de la demande client.

Impact sur les animaux

La nuisance principale est liée au modèle lui-même qui consiste en l’induction d’une allodynie par incision de la voute plantaire des animaux. Pour limiter la douleur lors de l’induction du modèle, l’incision est réalisée sous anesthésie gazeuse. De plus, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie sous isoflurane ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Des nuisances associées à la pharmacologie peuvent également apparaitre (tremblement, sédation, déshydratation). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, rétro-orbital). Les administrations et prélèvements peuvent donc présenter des nuisances pour les souris.

Devenir

Le modèle de douleur post-opératoire chez la souris entraine une activation des processus inflammatoires. Les processus inflammatoires sont mobilisés dans de nombreux modèles de douloureux même chronique comme les neuropathies. Il est donc difficile d’évaluer l’impact que pourrait avoir cette chirurgie sur un autre modèle de douleur. De plus, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par la société. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV.

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Le test avec les monofilaments de von Frey comporte une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Pour limiter le stress les animaux sont habitués au dispositif de tests aussi. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien du laboratoire (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II). Concernant l'anesthésie, les animaux pour la chirurgie POP sont sous isoflurane durant maximum 5minutes, un système de chauffage et d'aspiration sont intégrés à la table d'anesthésie gazeuse afin de garantir un réveil plus confortable pour les animaux.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature. 1560 souris seront utilisées pour ce projet. Le découpage de ce nombre par procédure se présente ainsi : - 780 souris subiront la procédure n°1 - 780 souris subiront la procédure n°2 Soit un total de 1560 souris Lots 10 animaux/groupes x 5 groupes + 2 animaux x 3 études/an x 5ans = 780souris par procédure

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant un mois, puis sont soumis une fois à une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer un stress, avant que leurs organes soient prélevés pour des mesures électrophysiologiques. Le porteur présente ce travail comme une prestation pour des "clients" des industries pharmaceutique et biotechnologique évaluant leurs molécules. Il affirme que l'usage de tissus fraîchement prélevés est "nécessaire" car la complexité des réseaux neuronaux ne se reproduit pas in silico.

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). Le développement de modèles rongeurs génétiquement modifié (GM) permettent de créer des mammifères mimant des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) à l’échelle d’une tranche et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Nous induirons donc un stress chez le rat et enregistreront l’effet de molécule d’intérêt, soit par une exposition, in vivo, au préalable, ou soit par une exposition, ex vivo, sur nos tranches ou cellules. Nous pourrons alors déterminer les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet : - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés une fois par jour, au maximum et pendant 3 minutes, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est d’un mois. Les contentions répétées nécessaires à ces différentes injections génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée ou soit par intrapéritonéale. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures, au maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier.

Impact sur les animaux

Notre procédure amène des effets indésirables : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; + effets secondaires potentiels des molécules *-Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée d’une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.

Remplacement

Les réactions, après un stimulus générant du stress, sont complexes et mettent en jeu les organes sensoriels, les nerfs sensoriels et une intégration au niveau le système nerveux central, permettant une réaction adaptée. Parce qu’il n’est pas envisageable de réaliser sur l’homme les tests que nous proposons et que la gestion de stress pathologique présente un intérêt de recherche important, nous évaluons et et/ou caractérisons des molécules d’intérêt dans le traitement du stress induit chez le rat. Il nous est nécessaire de réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Et ces réseaux doivent être en situation de stress. Pour cela nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un rat préalablement stressé. De plus, nos techniques nous obligent à l’utilisation de tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Par nos techniques, nous réalisons plusieurs tranches pour une noyau cérébral donné, chaque tranche peut subir un protocole particulier. Nous pouvons, par exemple, à partir d’un même cerveau tester plusieurs concentrations d’un même composé, ou plusieurs composés, ou plusieurs protocoles d’enregistrement, chaque protocole répondant à une question particulière. Alors, notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses au stimulus stressant dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en proposant quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (2 rats adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront quatre jours d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 2 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes (minimum 6 semaines d’âge) ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.