Troubles nerveux

5 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées puis une injection intracérébrale sous anesthésie, avant d'être mis à mort par décapitation, y compris des nouveau-nés décapités à la guillotine ou après refroidissement, pour tester ex vivo des molécules candidates de laboratoires clients. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer stress, inflammations, infections et blessures de l'œsophage. Il décrit une activité de prestation pour l'industrie pharmaceutique et affirme que ces enregistrements sur tissu vivant constituent la "meilleure approche".

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleure prédictibilité d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phases précliniques réglementaires, il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grandes quantités d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié. Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central de rongeurs, traités par des molécules directement dans ce système nerveux central, permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur considéré. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique, le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec circuit imprimé d’électrodes et le Patch = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécules.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, injectés directement dans le cerveau constitue la meilleure approche car elle permet : - de franchir la barrière hémato-encéphalique ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons) ; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront administrés deux fois par jour avec une manipulation de 5 minutes maximum par animal, soit 10minutes da manipulation au total par jour. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne trois semaines au cours de nos études. Ces multiples manipulations et peuvent souffrir d’inflammation ou de blessure à l’œsophage en fonction des sites d’injections choisis. Tous les animaux subiront l’injection intracérébrale, durant 30-45 minutes sous anesthésie générale et analgésie. Les nuisances pouvant apparaitre sont des inflammations aigues, des infections et, en conséquence indirecte, un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus entre 0 et 21 jours post naissance (c’est-à-dire non sevrés). Les temps de mise à mort varient en fonction du moyen utilisé mais n’excèdent pas dix minutes sous anesthésie et analgésie quand cela est nécessaire. Pour les Rats et Souris < P5 sont anesthésiés sur un bloc froid réfrigérant, sans contact direct, jusqu’à perte des réflexes au pincement d’une patte postérieure, puis décapités avec une paire de ciseaux adaptés, il temps entre l’anesthésie et la mise à mort est de 7 min ; Pour lesP5 < Rats et Souris P10 : les animaux seront anesthésiés par induction gazeuse à l’isoflurane (3.5% rat et 2.5% souris) puis décapités grâce à une guillotine adaptée, pour un temps de manipulation de maximum 7min. Si les animaux sont mis à mort par exsanguination, la totalité de l’intervention est de 12 minutes et passe par une anesthésie gazeuse, puis une analgésie sous masque anesthésique, 5 minutes d’attente et enfin exsanguination.

Impact sur les animaux

Nous avons une procédure qui peut amener à des effets indésirables. La procédure peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection comme des inflammations, des infections, de blessure de l’œsophage ; *- la mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection intra-cérébrale peut induire des problèmes de type opératoire et post-opératoire, comme des inflammations aigues, des infections et une conséquence indirecte : un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus opérés entre 0 et 21 jours post naissance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Ces mises à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégénératives et à la maîtrise des protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé un nombre suffisant d’animaux nous permettant de valider nos enregistrements. Compte tenu des variations du taux de réussite attendu lors de l’injection intracérébrale au cours des études utilisant cette procédure, nous adapterons ce nombre grâce à une étude pilote qui sera réalisée avant d’introduire plusieurs conditions de test. Cette étude pilote ne sera pas réalisée si les données de notre client sont suffisantes pour garantir une significativité. Les enregistrements validés sont rassemblés par condition pour l’analyse. Nos analyses statistiques des résultats permettrons de déterminer l’efficacité du test. Lors de l’étude pilote, nous pourrons évaluer la significativité statistique et si elle n’est pas atteignable, l’étude sera suspendue. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant par 4 conditions différentes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. .Les animaux préalablement administrés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera effectué. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique. Ces animaux seront asymptomatiques. L’injection intracérébrale sera précédée d’une prémédication et suivi par des soins antalgiques et enfin d’une couverture antalgique et de suivi clinique deux fois par jours. Les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse et analgésique pour assurer l’enregistrement des activités neuronales.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie cérébrale leur implante des canules profondes, suivie de sessions de prélèvement de trois à quatre heures reliées par des câbles et d'un isolement post-opératoire. Le projet mesure l'effet de candidats médicaments sur l'activité cérébrale, le porteur qualifiant la technique de "translationnelle". Il affirme que les cultures de neurones ne suffisent pas et que le retrait de la canule laisserait des lésions "non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions".

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines conditions psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser certaines substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le petit animal.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. Lors de la collecte des microéchantillons ou dialysats, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène (les durées de sessions de perfusion/prélèvement sont en général de l'ordre de 3 à 4 h). Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique.

Impact sur les animaux

Des douleurs peuvent être liées à l'implantation d'électrodes au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Suite à la chirurgie, les animaux sont isolés pour protéger la canule de microdialyse (cependant, ils gardent un contact visuel, sonore et auditif avec leurs congénères). Les animaux peuvent perdre du poids ou une plaie peut se former au niveau de la zone d'implant en raison d'une infection post-chirurgicale. Lors du test, les animaux sont connectés pendant plusieurs heures à des cables pendant la diffusion du perfusat et la collecte du dialysat suite à l'administration d'une substance pharmacologique.

Devenir

Les rongeurs seront euthanasiés à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisées, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait de la canule implantée pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux; les tests qui seront appliqués ne sont pas encore connus (mise en place de la technique), des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux reçoivent un traitement analgésique général au début de la chirurgie puis pendant 48 h et un traitement analgésique local supplémentaire pendant la chirurgie. Lors de la chirurgie, l'implantation d'une canule peut induire une hémorragie. Si cette dernière ne peut être maitrisée, l'animal sera euthanasié. Suite à la chirurgie, les animaux vont être pesés quotidiennement pendant 48 heures pour évaluer leur récupération. Un rat montrant une perte de poids supérieure à 15%, des signes de souffrance (poil hérissé, manque de toilettage) ou une atteinte locomotrice (démarche anormale, chutes...) sera euthanasié. Les conditions d'hébergement sont également optimisées avec la présence d'un enrichissement adapté (bois à ronger par exemple). Les animaux isolés sont hébergés dans des cages transparentes leur permettant de voir, sentir et entendre leurs congénères. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. Il arrive que l’animal se gratte au niveau de l’implant, endommageant les tissus autour de l’implant. Dans ce cas, l’animal est désinfecté quotidiennement avec une solution antiseptique. Un antibiotique peut être administré, le cas échéant.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalablement réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et à la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Le choix de l'espèce peut aussi être lié au modèle expérimental choisi. Par exemple, certains modèles mimant la maladie de Parkinson ont été préférentiellement développés chez le rat. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique).

Pendant les quatre semaines du test TouchScreen, des souris mutantes reçoivent une eau acidifiée progressivement jusqu'à un pH de 2,3, et pour un autre test elles sont enfermées environ 45 minutes dans un cylindre, exposées à des sons allant jusqu'à 110 dB. 60 souris issues de trois lignées mutantes et de deux groupes témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort en fin de projet pour des analyses histologiques et moléculaires. Elles subissent aussi l'implantation d'une puce sous la peau, puis, sous anesthésie, une tomographie par cohérence optique et une électromyographie par aiguilles avec stimulation électrique de 8 mA, ainsi qu'un suivi dans l'arène du Live Mouse Tracker. Les mutations étudiées sont celles du syndrome BBSOA, une maladie génétique rare de l'enfant, et le porteur renvoie les pistes thérapeutiques "à long terme". Il écrit avoir défini "des points limites éthiques", sans dire lesquels.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce sera faite sur les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = 5 secondes) (deux fois)*. -Tomographie par Cohérence Optique (durée = 10 minutes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = 5 secondes). -Consommation d'eau acidifiée lors du test TouchScreen (4 semaines). - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation d'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Lors de la Tomographie par Cohérence Optique et de l'électromyographie ils auront une anesthésie chimique avec une injection intrapéritonéale. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test. . Il y une acidification progressive de l’eau (acide citrique 1,5%) de pH 7 à pH 2,3. Lors de la période précédant le test l’animal subit une habituation au lait fraise (12% de sucre) dans biberon pendant 15 min par jour ainsi qu’une variation du pH de 7 à 3 (semaine 1). Puis lors du test le pH varie de 2,8 à 2,3 (semaines 2 à 4). Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.