Troubles nerveux

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection d'un virus et implantation d'une fibre optique, puis des enregistrements en champ ouvert après administration de cocaïne pendant cinq jours, avant leur mise à mort pour analyses post-mortem, pour étudier le rôle du transporteur PMAT dans les effets de la cocaïne. Le porteur indique que la chirurgie peut causer un œdème et une douleur post-opératoire, prises en charge sous anesthésie et analgésie. Il affirme que les effets des drogues d'abus se produisent à l'échelle de l'"organisme entier" et ne peuvent être évalués que sur l'animal entier.

Objectifs

Les transporteurs de recapture des neurotransmetteurs exercent un contrôle étroit de la transmission synaptique dans le cerveau en assurant l'élimination des transmetteurs libérés dans la fente synaptique et leur recyclage dans les terminaisons des neurones. A ce titre, ils interviennent dans des processus importants pour les comportements liés à l’humeur et certaines maladies psychiatriques, comme la dépression et l’addiction. PMAT (Plasma Membrane monoAmine Transporter) est un transporteur atypique, dont le rôle dans le cerveau est encore mal connu. In vitro, il transporte préférentiellement la dopamine et la sérotonine. Il est exprimé dans le cerveau des humains et des rongeurs dans diverses régions et divers catégories de neurones, tels que des neurones glutamatergiques, GABAergiques et cholinergiques. Il module des comportements reflétant le niveau d'anxiété, l'activité locomotrice et les effets des drogues d'abus. Des anomalies importantes des taux des neurotransmetteurs aminergiques dans le cerveau ont été mises en évidence dans plusieurs régions cérébrales chez les souris mutantes pour le gène correspondant. Le projet présenté ici vise à préciser le rôle de ce transporteur dans l'activité de certains circuits cérébraux à l'aide d'une technique de photométrie par fibre.

Bénéfices attendus

Les addictions sont des désordres psychiatriques caractérisés par la dépendance physique et/ou psychologique à une substance ou une activité, avec des répercussions délétères sur l’individu. Les informations récoltées par ces expériences précliniques devraient clarifier le rôle d’un transporteur peu connu, PMAT (Plasma membrane monoAmine Transporter), dans les effets d’une drogue d'abus, la cocaïne. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de cette drogue sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris invalidées pour certains gènes (tels que PMAT ici) permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Les approches utilisées dans le projet permettent d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés. Ces connaissances pourront permettront d’approfondir les mécanismes qui sous-tendent les processus addictifs, afin d’élaborer à terme des thérapies plus efficaces pour traiter ces troubles psychiatriques. Ces travaux sont originaux et les expériences ne sont pas réalisées par d'autres laboratoires.

Procédures

Toutes les souris subiront 3 étapes séquentielles: 1- Une chirurgie stéréotaxique (classe modérée; durée 30-40 min). 2- Des enregistrements par fibre optique dans un champ ouvert, à l'état basal ou après administration de cocaine (classe légère; durée 1h30 min par session sur 5 jours consécutifs). 3- Une euthanasie, afin de valider les expériences (classe sans réveil; durée 20 min). La chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. L'administration par injection intra-péritonéale de cocaïne ou de saline n'engendre pas d'effets secondaires et n'altère pas les poids des animaux. Les souris sont surveillées pendant toute la procédure. L’effet hyperlocomoteur de la cocaïne est très rapide et dure 20 min. La cocaïne n’est pas associée à des effets secondaires indésirables notables. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Nous n'envisageons pas d'autres nuisances possibles lors des expériences proposées.

Devenir

A la fin de la procédure tous les 80 animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements et analyses post-mortem nécessaires au projet (immunofluorescence et analyse anatomique).

Remplacement

De manière générale, les effets à court ou long terme des drogues d’abus se produisent à l’échelle de l’organisme entier et donc ne peuvent être évalués de manière définitive qu’in vivo, sur l’animal entier. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de ces drogues sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris mutées pour des transporteurs de neurotransmetteurs permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Cette approche permet d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces aspects intégrés ne sont pas reproduits dans des modèles de substitution, comme des cellules en culture, et il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés.

Réduction

Afin d’en limiter le nombre, tous les animaux (80 en tout) sont soumis aux enregistrements en photométrie par fibre, puis ces mêmes animaux en bonne santé sont euthanasiés en vue des études anatomiques ou immunohistochimiques. Des groupes de 10 minimum doivent être utilisés afin d’obtenir des résultats statistiquement concluants sur les effets biologiques. La taille de ces effectifs est déterminée sur la base des études antérieures et de calculs de sensibilité.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les procédures sont optimisées pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique et l’implantation de la fibre optique sont réalisées simultanément sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris (4 par cage) sont hébergées dans une animalerie de stabulation ventilée (température 19-21 degrés C, cycle jour-nuit 12h-12h) avec accès à l’eau et croquettes ad libitum, et la litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Les animaux d’origine extérieure sont acclimatés pendant au moins une semaine avant le début des procédures. Nous travaillons en étroit lien avec l’équipe vétérinaire pour s’assurer que l’animal ne souffre pas face à une gêne, une détresse, une douleur ou une blessure. Si un animal est en souffrance, il est rapidement euthanasié.

Choix des espèces

L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine, et son système nerveux présente de multiples analogies avec celui des humains. Ceci nous permet d’identifier des processus transposables en physiologie humaine et médecine, y compris en ce qui concerne les mécanismes qui sous-tendent l'addiction. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé, avec une histoire fournie d’études pharmacologiques et comportementales en rapport avec l’addiction, ce qui permet de construire des hypothèses valides et pertinentes. Enfin, l'utilisation de la souris comme modèle autorise l'application de techniques moléculaires sophistiquées très informatives, telles celles mises en oeuvre dans ce projet (recombinaison homologue, transfert de gènes au moyen de virus), permettant d’aborder la fonction des gènes de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (âge entre 10 et 20 semaines). Il s’agit du stade pertinent pour évaluer l'effet des drogues addictives, les études chez les juvéniles sortant du cadre de ce projet de recherche.

430 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte du kaolin ou du liquide cérébrospinal dans la grande citerne pour provoquer une hydrocéphalie, puis ils subissent des chirurgies intrathécales répétées, jusqu'à cinq IRM sous anesthésie et une perfusion intracardiaque terminale, pour évaluer la toxicité d'oligonucléotides antisens administrés dans le système nerveux central. Le porteur indique que le modèle kaolin peut entraîner des sécrétions nasales et orbitales de sang et une euthanasie dans les cinq jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité des mécanismes en jeu et qu'il est "indispensable" d'évaluer cette toxicité avant les études cliniques.

Objectifs

L'hydrocéphalie est une pathologie neurologique dans laquelle une quantité excessive de liquide cérébrospinal (LCS) s'accumule dans le cerveau (au niveau des ventricules, cavités naturelles de cet organe). Il se produit alors une dilatation et les tissus environnants sont compressés entravant le bon fonctionnement cérébral. Les causes d’hydrocéphalie sont multiples : elles peuvent être congénitales, infectieuses, hémorragiques tumorales ou médicamenteuses. L’hydrocéphalie est souvent diagnostiquée avec des tests d’imagerie tels que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est devenue l’examen de référence pour ce type de pathologie. En clinique, de nouvelles thérapies utilisant l’administration de molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO) sont actuellement proposées. Il s’agit de petites molécules d’acide nucléique qui vont venir réprimer l’expression protéique d’un gène d’intérêt. Ces composés ne franchissent pas aisément la barrière hématoencéphalique; d’où la nécessité, dans le cadre du traitement des atteintes du système nerveux central, d’administrer les candidats-médicaments par voie intrathécale (dans l’espace où circule le LCS). Or, quelques cas d’hydrocéphalie ont été rapportés suite à des injections réalisées par voie intrathécale de ce genre de composés. Dans ce contexte, il apparaît important d’évaluer le profil sécurité des candidats-médicaments en préclinique sur ce point de vigilance. Dans ce contexte, nous proposons d’évaluer en IRM, chez le rat, le risque d’hydrocéphalie associé à l’injection intrathécale d’ASO amenés à être proposés au développement clinique chez l’humain, pour le traitement d’atteintes cérébrales spécifiques. Ce projet se décompose en deux parties. Dans un premier temps, nous chercherons à reproduire, chez le rat, un modèle d’hydrocéphalie déjà bien caractérisé de façon à optimiser l’acquisition et le traitement des données imagerie IRM pour la détection d’anomalies cérébrales associées à cette pathologie. Puis, nous chercherons ensuite à évaluer l’effet de différents ASO administrés par voie intrathécale sur les paramètres volumétriques tels que le volume des ventricules cérébraux, la taille globale du cerveau, et/ou déformations des différentes structures cérébrales. Ce projet permettra de sécuriser l’approche en développement clinique de ces produits qui pourraient être proposés comme traitement de maladies invalidantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de valider les méthodologies pour la sélection des meilleurs candidats médicaments nécessitant une injection par voie intrathécale pour le passage en développement clinique.

Procédures

• Imagerie IRM sur animal anesthésié : jusqu’à 5 sessions d’imagerie/animal espacées au moins d’une semaine d’intervalle sur une durée maximale de 5 mois. Durée maximale d’une session IRM/animal : 1 heure • Injection unique (CSF ou kaolin) au niveau de la grande citerne. La durée de la procédure n’excèdera pas 20min • Chirurgie intrathécale pour administration des ASO : 3 administrations à une semaine d’intervalle. C’est ce qu’on appelle le « bolus de charge » et qui sera la méthodologie préconisée chez l’humain. La procédure chirurgicale n’excèdera pas 30min • Prélèvements sanguins et de LCS chez animal anesthésié juste au moment du sacrifice (stade terminal sans réveil) • Perfusion intra-cardiaque PFA 4% pour permettre l’analyse histologique post-mortem des tissus cérébraux. La durée de la procédure n’excèdera pas 15min

Impact sur les animaux

Ce projet permettra justement de définir quels peuvent être les effets indésirables associés à l’administration répétée par voie intrathécale (dans l’espace où circule le liquide cérébrospinal) d’un traitement par oligonucléotides antisens (ASO) destiné à traiter des atteintes du système nerveux central ; voie d’administration préconisée chez l’humain. Effets indésirables liés à l’apparition d’une hydrocéphalie chez le rat. Possibilité de sécrétions nasales et orbitales de sang et de liquide clair dans les quelques jours suivant l’induction. Selon la littérature, ces évènements n’ont pas été rapportés dans le modèle kaolin (euthanasie dans les 5 jours suivants l’injection) que nous souhaitons évaluer en imagerie IRM. Effets indésirables liés à l’administration intrathécale de composés. Paralysie des membres postérieurs, inflammation locale au niveau du site d’injection, paralysie motricité vésicale ou digestive. L’administration des composés est réalisée en conditions d’aseptie optimale de façon à limiter la survenue d’effets indésirables associés à cette voie d’administration. Effets indésirables liés aux anesthésies successives Anesthésie gazeuse (isoflurane) durant les examens IRM et procédure chirurgicale. Aucun effet indésirable n’est attendu. Surveillance des paramètres physiologiques (température, respiration) durant toute la session d’acquisition des données imagerie ou chirurgie. Surveillance des animaux (en chambre thermostatée) jusqu’à leur réveil avant réintroduction dans leur cage.

Devenir

Pour chaque procédure les animaux doivent être euthanasiés pour analyse post-mortem (analyse immuno-histochimiques et dosages biochimiques) et corrélation avec les données d’imagerie acquises in vivo.

Remplacement

Il est indispensable de pouvoir évaluer la toxicité de candidats médicaments et définir la marge sécurité pour les futures études cliniques. Actuellement les études in vitro permettent de sélectionner une grande partie des composés et de restreindre drastiquement le nombre de produits qui seront testés in vivo. Cependant, il n’existe aucun modèle in vitro ou synthétique qui récapitulerait la complexité des mécanismes déclenchés par l’administration d’un candidat médicament dans un organisme ; Le recours à l’animal reste donc obligatoire et nécessaire pour envisager les études réglementaires qui permettront de poursuivre le développement du produit jusqu’à l’autorisation de mise sur le marché.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour garder une puissance statistique raisonnable et s’assurer que les résultats puissent être exploitables en vue de la variabilité inter-individuelle. Généralement, un minimum de n=10 animaux/groupe est nécessaire quand nous cherchons à mesurer des paramètres en imagerie pour lesquels nous n’avons pas d’expérience au préalable. Le fait d’envisager un suivi continu en imagerie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études en limitant l'euthanasie à différents temps.

Raffinement

Les composantes physiologiques seront surveillées durant les examens d’imagerie : respiration, température corporelle. Le réveil de l’animal se fera en chambre thermostatée avant sa réintroduction dans sa cage L’alimentation et l’eau de boisson seront disponibles à volonté Les procédures de chirurgie intrathécale seront accompagnées par des injections d’analgésiques (avant et après la chirurgie) Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur qui pourraient survenir, et administrer le soin correspondant

Choix des espèces

La réglementation impose que les études de toxicologie soient effectuées sur une espèce de rongeur au minimum. Dans ce projet, le choix du rat est privilégié du fait que l’injection intrathécale des composés est possible chez cette espèce, à la différence de la souris. Les volumes des prélèvements (sang, LCS) pour l’identification de biomarqueurs sont potentiellement également plus importants chez le rat que chez la souris; ce qui facilite les dosages sans à priori. L’évaluation de la tolérance chez le rat de l’administration intrathécale de candidats médicaments préalablement sélectionnés (criblage in vitro/études chez la souris) aidera aux choix des doses à évaluer sur une espèce non rongeur avant le début des essais cliniques où la voie d’administration intrathécale est celle qui sera préconisé chez l’humain. Dans ce projet, nous utiliserons des rats Wistar pour lesquels nous disposons déjà de données historiques concernant les analyses biochimiques et de formulation sanguine. Dans ce ce projet, nous utiliserons des rats jeunes ou adultes, conformément aux requis réglementaires

18 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 12 tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau et 6 gardés en vie pour un usage ultérieur. Chaque animal est habitué à la contention, passe une IRM et un scanner sous anesthésie, un test de seuil moteur et de l'imagerie fonctionnelle en état vigile, puis reçoit une neurostimulation cérébrale par ultrasons. Le porteur veut évaluer cette technique chez le singe dans la perspective d'un essai chez l'humain contre des troubles neuropsychiatriques, les résultats obtenus chez les rongeurs étant jugés insuffisants. Il justifie le recours au macaque par sa proximité phylogénétique et l'analogie de ses zones cérébrales avec celles de l'humain.

Objectifs

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme. Ce projet permettra de progresser dans la possibilité de transposer cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Habituation à la manipulation et au positionnement à la neurostimulation : 30 min par jour, 2 à 5 fois /semaine. IRM sous anesthésie générale : 1 fois par animal, durée 1h. Scanner X sous anesthésie générale: 1 fois par animal, durée acquisition 10 min. Détermination du seuil moteur sur animal vigile: 1 fois par animal, durée 1h. Imagerie fonctionnelle sous anesthésie générale: 2 fois pour le groupe 1 et 4 fois pour le groupe 2 d'une durée de 80min par imagerie. Neurostimulation sur animal vigile: 1 fois par animal , durée 30 min.

Impact sur les animaux

Les sources de stress sont occasionnées par l’induction anesthésique, l’injection intraveineuse du radiotraceur et le réveil. Le singe est facilement stressé, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage et aux manipulations. D’après nos précèdentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable.

Devenir

A l'issue des procédures, 12 animaux seront euthanasiés pour des études histologiques et métabolomiques sur les prélèvements cérébraux, afin d'appréhender les effets cellulaires de la neurostimulation ultrasonore. Les 6 animaux restant seront gardés en vie pour un futur replacement.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

D’après les groupes expérimentaux que nous souhaitons faire, nous travaillerons sur 9 macaques mâles et 9 macaques femelles. Nous travaillerons sur 7 macaques mâles et 11 macaques femelles. Ces animaux seront répartis en 2 groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en volière avec les congénères pour garder les liens sociaux et en présence d’objets d’enrichissement. Les animaux disposent de plateformes surélevées . l'alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises deux fois par jour. Un programme d'enrichissement hébdomadaire est mis en place dans le cadre de leur hébergement ( recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Les animaux seront observés tous les jours. Les procédures expérimentales seront réalisées dans une salle correctement chauffée. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant, un monitoring cardio-pulmonaire sera effectué pendant toute la durée de la manipulation. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur, l’inconfort des animaux. Ces points limites seront principalement des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie habilité sur les singes. Nous considérons donc comme point limite toute manifestation de douleur : perte de poids et locomotion réduite, prostration du PNH, déshydradation, état des muqueuses et des selles et l'apparence générale du pelage. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence physique des animaux et aux interactions sociales. Les animaux seront pesés à réception puis avant chaque procédure. En présence de l'un de ces signes, des mesures préventives seront prises, médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs. Pour limiter le stress des animaux, nous ferons une habituation à la manipulation. Dans un premier temps, nous habituerons les animaux à recevoir des récompenses (friandises) après avoir effectué des tâches simples, toucher un objet sans bouger pour coopérer avec l'animal et instaurer une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Puis dans un deuxième temps, ils seront habitués à être installé en salle de manipulation pour éviter tout stress lié à l'environnement de la salle. Les macaques recevront des friandises à la suite.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie (1) par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et (2) par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques pubères seront utilisés pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubère ayant un âge supérieur à 3 ans et un poids inférieur à 5 kg.

325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'hippocampe pour déclencher une épilepsie, l'implantation d'une pompe sous anesthésie, jusqu'à quatre séances d'IRM et huit jours de médicaments, avant l'analyse de leur cerveau et de leur sang. Le porteur cherche à mieux localiser par imagerie la zone du cerveau à retirer chez les patients épileptiques opérés, les retombées cliniques étant renvoyées à une évaluation en préparation. Il indique qu'une recherche bibliographique n'a révélé aucune alternative in vitro et que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la communication entre cellules.

Objectifs

Un tiers des patients épileptiques ne répondent pas correctement aux médicaments antiépileptiques et, parmi eux, 1/4 peuvent bénéficier d'une chirurgie résective. L'identification des zones du cerveau à enlever par chirurgie (la zone épileptogène (ZE)) est un processus difficile. Il nécessite un ensemble d'outils complexes comprenant des examens cliniques, d'imagerie et neurophysiologiques, y compris des enregistrements électroencéphalographiques intracrâniens. Cependant, même en combinant toutes les informations actuellement disponibles, la chirurgie de l'épilepsie ne fonctionne pas correctement chez 20 à 60% des patients. Il est donc nécessaire développer de nouvelles méthodes pour délimiter la ZE. La neuro-imagerie, non invasive et largement disponible dans le contexte clinique, apparaît comme un candidat naturel pour aborder cette question. A terme, l'objectif est d'améliorer la chirurgie chez les patients.

Bénéfices attendus

Les données recueillies dans cette étude nous permettrons de caractériser l'impact de différents médicaments anti-épeliptique sur les mesures IRM (mqMRI et GABA-MRS). Ces informations seront utilisées pour modéliser l'impact attendus des médicaments chez l'homme lors de l'évaluaton clinique qui est en cours de préparation.

Procédures

- Procédures chirurgicales sous anesthésie : i) Injection intra-hipppocampique (induction de l'épilepsie) : durée maximum 1h30. ii) Implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée maximum 30min). Maximum deux procédures / animal. - IRM sous anesthésie : maximum 2h30/session IRM, maximum 4 sessions IRM / animal. - Administration de médicaments : durée de quelques minutes / jours pendant 8 jours.

Impact sur les animaux

i) Douleur modérée au moment de l'induction de l'épilepsie, procédure conduite sous anesthésie, ii) Crises épileptiques pendant la phase d'épileptogenèse iii) Douleur modérée au moment du traitement pharmarcologique iv) Douleur légère au moment de l'examen IRM, procédure conduite sous anesthésie

Devenir

Le tissu cérébral et le sang des animaux utilisés dans ce projet est analysé en fin de projet (sauf pour les animaux utilisés pour l'optimisation des protocoles IRM). Tous les animaux sont mis à mort au court du projet.

Remplacement

Nous avons effectué une recherche approfondie sur Pubmed et Google Scholar afin de nous assurer de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre malformations du développement corticale, crises épileptiques et fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des combinaisons de mots-clés tels que épilepsie, crise, électroencéphalographie, dysplasie, cerveau, neurone, modèles animaux, in vitro et tests animaux alternatifs. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 15 animaux par groupe sont prévus ainsi que deux groupes pour l'optimisation du modèle animal et de l'imagerie, pour un total de 325 souris sur 5 ans. De plus, nous commencerons ce projet par un groupe préliminaire qui permettra la mise au point du protocole : si cette étude préliminaire révèle que le nombre de rats par groupe est surévalué, nous le réduirons de façon à atteindre un nombre d'animaux nécessaire et suffisant.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. Leur nombre a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des données suffisantes pour évaluer l’efficacité de cette stratégie d’imagerie pour définir la zone épileptique en cas de prise de médicaments anti-épileptiques.

Choix des espèces

Notre projet propose l'utilisation de petits animaux in vivo (souris). Les souris ont été choisies à cause de leurs caractéristiques neuro-vasculaires et profils électroencéphalographiques bien étudiés. Ils expriment les mêmes marqueurs neuronaux, gliaux et péricytaires que l'Homme. Ils constituent donc un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'entité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des malformations corticales et des crises. La littérature fournit des preuves de la fiabilité du monitoring électroencéphalographique in vivo et IRM in vivo pour l'évaluation des modifications pathophysiologiques des tissus. De plus, un fort taux de survie est observé lorsque les rongeurs sont utilisés dans ce type d'étude par rapport à d'autres espèces.

218 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent soit une injection dans le cerveau après craniotomie sous anesthésie de 70 minutes, soit une injection rétro-orbitaire, pour comparer ces deux voies d'administration de vecteurs de thérapie génique. Le porteur nomme des atteintes possibles comme un saignement lors de la craniotomie, un risque d'exophtalmie et d'infection oculaire après l'injection rétro-orbitaire, et une perte de poids. Les souris sont tuées quatre semaines après pour des analyses, cette étude servant à valider les vecteurs chez des souris saines avant emploi sur des modèles de maladie.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) et la maladie d’Alzheimer sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Cet ADN peut être délivré de différentes manières. L’injection intracérébrale est l’approche de référence pour de nombreuses maladies neurodégénératives. Nous souhaiterions tester l’efficacité d’une approche moins invasive qu’est l’injection intraveineuse. Ceci dans le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettrait d’opter pour un mode d’administration de notre produit le moins invasif possible pour l’appliquer chez l’homme et plus précisément chez les patients atteins de la maladie neurodégénératives.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 semaine d’âge soit : -à une injection stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 70 min), -ou à une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (durée de 5 min), Dans les deux cas l’animal est endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux réaliseront des tests comportementaux (tests de performance motrice et activité locomotrice), les semaines 5, 6 et 7 et 1 jour de repos sera laissé entre ces deux tests. Un des tests de performance de la motricité est réalisé en 3 sessions pendant 3 jours consécutifs et dure 5 minutes maximum par session. Le test de l’activité locomotrice dure 10 minutes par animaux. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie avec animal endormi et immédiatement après les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux. Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal existe également. Un risque d’infection oculaire et d’hématome peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitales. Une perte de poids dû à l’injection de vecteur viraux pourrait être observée, (5 à 7%) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des vecteurs utilisées soient déjà été évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. Un risque d’hématome (exophtalmie), au niveau de l’IV peut survenir car l’injection est réalisée en rétro-orbitaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées 4 semaines après les injections (temps d'expression des vecteurs viraux étudiés) - pour les differentes études biocellulaires et biomoléculaires.

Remplacement

Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle murin de la maladie de Huntington est bien caractérisé. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (218) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.

Raffinement

Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring (fournie en annexe ) est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes de vecteur virauxs modifiés et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un vecteur viral exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Nous commencerons donc par valider dans la présente demande nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. En effet à ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH ou MA permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études de comparabilité et d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau.

760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection quotidienne d'halopéridol dans l'abdomen pendant 21 jours pour provoquer des dyskinésies, mouvements involontaires de la mâchoire et de la langue, puis un candidat médicament d'un "sponsor" à évaluer. Le porteur reconnaît que les injections répétées peuvent provoquer une péritonite ou toucher d'autres organes, et que le trouble moteur induit est source de stress. À l'issue, un prélèvement intracardiaque sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement du cerveau.

Objectifs

L’utilisation de substances antipsychotiques est une stratégie thérapeutique importante pour traiter les troubles liés aux pathologies psychiatriques telles que les psychoses. Cependant, l’efficacité de ces traitements est limitée à certains symptômes et leur utilisation prolongée est associée à de nombreux effets secondaires. En effet, les antipsychotiques agissent en bloquant les voies dopaminergiques induisant sur le long terme, l’augmentation du nombre et de la sensibilité des récepteurs D2 à la dopamine. En conséquence, il est observé, chez plus de 30% des patients, l’apparition de troubles moteurs involontaires et aberrants appelés dyskinésies tardives (TDs). Afin de lutter contre ces effets secondaires, plusieurs modèles précliniques chez le rongeur ont été développés dans le but de comprendre la physiopathologie liée à l’apparition de ces troubles moteurs pour ensuite tester différentes stratégies thérapeutiques visant à les diminuer. Actuellement, les traitements de référence pour soulager les TDs sont basés sur des molécules diminuant la recapture et la libération de dopamine au niveau synaptique telles que les tétrabénazines. Malgré cela, ces substances présentent des inconvénients importants car elles ont une demi vie très courte (10h) et nécessitent donc des doses quotidiennes multiples. De plus, elles n’ont pas un effet spécifique ce qui contribue à induire des effets secondaires obligeant à diminuer le dosage pouvant être administré et donc leur efficacité. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats médicaments à plusieurs dosages sur le développement des TDs chez le rat, induites par l’administration quotidienne et prolongée d’halopéridol, un antipsychotique. Pour cela, des rats Wistar subiront une injection quotidienne d’halopéridol par voie intrapéritonéale (i.p) sur une durée de 21 jours. Lors du 21ème jour, ces animaux seront traités à partir d’une administration i.p unique soit du véhicule, soit de tétrabénazines, le composé référence, soit de candidats médicaments à plusieurs dosages. Les effets de ces traitements seront évalués sur les mouvements involontaires de la région orofaciale (i.e. évaluation du nombre d’ouverture de la mâchoire non dirigée vers une cible) et/ou de protrusion de la langue, tous deux très caractéristiques de TDs chez le rat, tout comme chez l’Homme. Pour terminer, le plasma et le cerveau des animaux seront prélevés afin de quantifier la biodisponibilité des candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de candidats médicaments sur 1) les troubles moteurs involontaires de la région orofaciale associés aux dyskinésies tardives induites par la prise prolongée d’antipsychotiques, 2) sur la biodisponibilité plasmatique et cérébrale de ces mêmes composés et 3) sur leurs potentielles répercussions thérapeutiques au niveau histologique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des rats mâles (âge : 6 semaines) sont soumis à une administration quotidienne d’halopéridol, un antipsychotique, sur une durée de 21 jours afin d’induire une dyskinésie tardive (mouvement moteur involontaire et aberrant (durée de l’acte d’injection i.p : 1min/rat). Au cours de la seconde intervention, à J21, les 6 groupes d’animaux sont également traités par voie i.p avec soit le candidat médicament administré à 3 différentes doses (une dose par groupe sur 3 groupes), soit avec de l’halopéridol, soit avec un composé de référence, les tétrabénazines soit avec le véhicule (NaCl 0,9%). La 3ème intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des rats, mesurant les mouvements involontaires de la région orofaciale et les protrusions de langue (durée d’intervention : 10min x 3). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse avant la mise à mort des animaux afin de prélever le cerveau (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 20 min).

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’administration quotidienne par voie intrapéritonéale est une source de stress puisqu’il est nécessaire d’appliquer une contention chez le rat afin de pouvoir réaliser ce geste. De plus, il est possible que les piqures répétées au niveau du péritoine engendrent une inflammation du péritoine (péritonite) voir une injection au niveau d’autres organes (vessies, intestins.). L’injection i.p peut également engendrer un léger écoulement de sang dans le cas où l’aiguille perfore un vaisseau sanguin. L’induction de TDs représente également une nuisance car elles entrainent une altération de l’activité motrice de la région orofaciale (mouvement aberrants et involontaires) et sont sources de stress. De plus, au cours d’une session permettant d’évaluer les caractéristiques comportementales de la TD, les animaux sont isolés dans un open field durant 3 fois 10 min ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort à la fin du protocole afin de prélever les organes.

Remplacement

Les dyskinésies tardives sont les principales sources de troubles moteurs résultant de la prise quotidienne d’antipsychotiques. Ainsi, pour ce projet, les candidats médicaments ont comme principal objectif de diminuer ces mouvements moteurs involontaires et aberrants. Ainsi, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux antipsychotiques. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (maximun n=10) pour ce projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8) utilisant le même modèle de rat de TDs induites par l’administration quotidienne d’halopéridol sur 21 jours. Cependant, une certaine hétérogénéité entre les animaux a été observée quant à la réussite de l’induction de la TDs. Pour cette raison et le faible recul de ce modèle au sein de l’entreprise nous pousse donc à choisir un N = 10 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux par groupe pourrait être réduit une fois ce modèle maitrisé et validé au sein de l’entreprise.

Raffinement

Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques basées sur des critères d’observations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures ainsi qu'aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Par ailleurs, les animaux sont hébergés par 3 dans les cages. Pour l’induction de la dyskinésie tardive par administration quotidienne d’halopéridol en i.p: - les administrations sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement - les animaux sont pesés chaque début de semaine afin d’adapter le volume et le dosage administré et permettant d’éviter le surdosage - les administrations se font avec une seringue de 1ml et une aiguille de 26G - pour les administrations i.p, l'animal est maintenu en contention et l’aiguille est insérée dans le cadrant ventral inférieur gauche ou droit en évitant la ligne médiane. Les sites d’administration sont alternés chaque jour entre gauche et droite. Une légère aspiration est effectuée avant d’injecter pour confirmer que l’aiguille n’a pas perforé un vaisseau sanguin ou un autre organe. En cas de signe de déhydratation (test du plis de peau) ou de perte de poids, une injection de sérum physiologique est effectuée en s.c. Le prélèvement de sang en intracardiaque ainsi que la thoracotomie précédent la perfusion de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale avec un cocktail de Kétamine/médétomidine et sous analgésique systémique.

Choix des espèces

Le rat et particulièrement la souche Wistar, est l’espèce de référence dans l’étude des dyskinésies tardives induites par l’halopéridol. En effet, plus de 68% des études répertoriées dans la littérature utilisent des rats dont plus de 33% sont de la souche Wistar. Afin de pouvoir maximiser la standardisation et donc favoriser la comparaison des données avec la littérature, il est fortement conseillé d’utiliser des rats Wistar sur ce sujet. De plus, les symptômes principaux des TDs au niveau de la région orofaciale observés chez l’Homme, sont également retrouvés chez le rat et à la même fréquence. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes rats Wistar mâles adultes (6 semaines, poids 200-280g) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les dyskinésies tardives induites par l’halopéridol sont obtenus chez cette catégorie d’animaux.