Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chacun des 6 macaques à longue queue subit une chirurgie de huit heures pour implanter un dispositif de refroidissement localisé de l'hippocampe, deux ventriculographies de trois heures, deux IRM et un scanner, puis 36 séances d'enregistrement de six heures, assis dans une chaise de contention à laquelle il est entraîné pendant au moins un mois. Ces primates sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à la fin, au terme d'une procédure sans réveil, pour analyser les lésions produites dans leur cerveau par le dispositif et le refroidissement. Le but est de mettre au point des algorithmes qui prédisent les crises d'épilepsie et déclenchent le refroidissement, en vue d'un implant humain qui pourrait fonctionner sur batterie. Le résumé ne décrit pas comment les crises sont provoquées : seule la liste des effets mentionne des crises "persistantes légères" 1 à 2 heures "après séance pénicilline", et la liste des séances d'enregistrement parle d'"injection" sans dire laquelle.
Objectifs
L’épilepsie, qui touche 1% de la population, constitue un problème de santé majeur. En dépit de nombreuses avancées thérapeutiques, seules 30% des épilepsies pharmaco-résistantes (celles qui ne répondent pas aux médicaments) sont opérables et cette option n’est envisageable que si le foyer épileptique se situe dans une zone accessible du cerveau Dans les autres cas, une autre approche thérapeutique alternative est l’arrêt des crises d’épilepsie par refroidissement du foyer épileptique. Ce phénomène, connu depuis les années 1930, a été validé chez le rongeur et testé chez le primate à l’aide de dispositifs de refroidissement appliqués à la surface du cerveau. Le présent projet a pour objectif d’appliquer cette technique de refroidissement uniquement au moment qui précède l’arrivée d’une crise épileptique sur un modèle de primate. La technique de refroidissement a l’avantage d’être réversible et d’être une procédure peu invasive, mais elle doit encore être affinée en vue d’une application thérapeutique chez l’homme. A ce jour, aucune étude n'a mis en évidence la possibilité d’utiliser la prédiction des crises d’épilepsie comme déclencheur du traitement en boucle fermée de l’épilepsie pharmaco-résistante. L’objectif scientifique de cette étude est donc de développer les algorithmes de prévision des crises épileptiques pour une administration en boucle fermée du refroidissement localisée. Ces algorithmes seront capables de détecter le risque d’émergence d’une crise d’épilepsie et de l’inhiber en activant un refroidissement localisé de la zone épileptogène.
Bénéfices attendus
A ce jour aucune étude n’a présenté une évidence incontestable que la prédiction où les pronostics des crises épileptiques est possible au-delà de l’occurrence par chance. Les pronostics générés vont produire des périodes de haute ou base probabilité d’occurrence des crises. Nous souhaitons tester l’efficacité des algorithmes via le refroidissement pendant ces périodes de haute probabilité des crises et non pas pendant les périodes de crises réels. L’hypothèse est que les effets du traitement vont être supérieurs s’ils sont appliqués en dehors des crises épileptiques convulsives déjà établies. Les bénéfices directs seront la réduction de la puissance nécessaire pour refroidir et le dosage de la quantité du froid à livrer. Avec une réduction de la quantité d’énergie nécessaire pour produire le froid, le système pourrait finalement être compatible avec une batterie implantable type « pacemaker ». Les rendements actuelles en utilisant une approche continue, ne permettent pas avoir une batterie implante à long terme. L’utilisation du refroidissement représente aussi un avantage considérable sur les systèmes actuels parce que son effet est plus important et rapide que la stimulation électrique. Les algorithmes vont être adaptés pour mieux répondre aux taches des pronostics des crises épileptiques. Ils vont être comparés à l’état de l’art et seront peu gourmands en consommation électrique. Ces algorithmes vont être évalués en utilisant un modèle de primates non humains épileptiques avec la possibilité d’optimiser les algorithmes dans le temps. Le refroidissement du foyer épileptogène est une manière efficace d’arrêter les crises, comme nous sommes en train de le démontrer dans nos études en cours. Ces modèles précliniques permettront de tester facilement l’efficacité des algorithmes pour prédire l’occurrence des crises et l’effet thérapeutique du refroidissement pendant les périodes de haut risque de crises. Les bénéfices attendus sont le développement des algorithmes de prévision des crises utilisables sur des systèmes en boucle fermée et aussi de valider l’hypothèse du départ sur la nécessité de diminuer le refroidissement pour aboutir à l’arrêt des crises.
Procédures
Imagerie par IRM : 2 d’une heure chacune Imagerie par CT scan : 1 d’une heure Ventriculographie : 2 de 3 heures Chirurgie implantation : Implantation de dispositif, durée 8 heures Prélèvements sanguins : pré et post-opératoire soit 2 des prélèvements additionnels seront réalisés si complication infectieuse Séances d’enregistrement par condition :12 injection sans refroidissement, 12 injection refroidissement intermittent « aléatoire », 12 refroidissement en boucle ferme soit 36 au total chacun durant 6 heures.
Impact sur les animaux
• Perte de poids post-opératoire : 7 jours • Douleur transitoire post opératoire : 1 jour • Stress pendant séance d’habituation : jusqu’à l’habituation • Position anormale (dos voûté) : post opératoire immédiat post anesthésie générale • Vocalisation anormale pendant la séance d’enregistrement : jusqu’à l’habituation • Signes neurologiques: parésie post opératoire transitoire : 5-7 jour post opératoire • Crises épileptiques persistantes légères (mâchonnements, salivation, mouvements répétitives de tête) : 1-2 heures après séance pénicilline
Devenir
A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous allons euthanasier les animaux et prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par le dispositif refroidissant et le refroidissement en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’homme.
Remplacement
Le remplacement des modèles animaux en générale et des modèles primates en particulier n’est pas possible pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in vitro comme les tranches de tissus cérébrale ne permettent pas de tester un implant préclinique complet qui a pour vocation de préfigurer le futur implant humain. Dans le projet, une partie des éléments de l’implant et certaines expérimentations ont pu être menées in vitro, notamment les tests de biocompatibilité permettant d’éviter l’utilisation d’animaux. Les primates non humains (PNH) sont les modèles idéaux pour tester les dispositifs cliniques pour l’épilepsie pour la similitude existante entre la structure du cerveau humain et celle du PNH. De plus, la génération des états épileptiques et des crises sont similaires aux phénomènes observés chez le patient épileptique
Réduction
Un nombre maximal de 6 primates non humain est estimé dans ce projet pour obtenir des résultats statistiquement fiables et exploitables du fait notamment de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal sera son propre contrôle. L’analyse statistique sera effectuée par des tests non paramétriques appariés, afin de mesurer la différence des moyennes avant et après traitement sans présomption initiale d’une distribution normale de la population (précédés par des tests de normalité). Toutefois dans le respect de la règle de « réduction » des 3R, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’au 50% si les résultats obtenus sur les premiers animaux ne sont pas concluants ce qui provoquera l’arrêt des expérimentations ou bien si l’effet est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié des animaux. Tous les efforts seront faits par les expérimentateurs pour réduire le nombre d’animaux mis en expérimentation tout en permettant d’atteindre l’objective scientifique.
Raffinement
L’état clinique des animaux sera régulièrement observé. Dès que l’animal manifestera l’une de ces réactions négatives spécifiques leur surveillance sera renforcée : perte de poids, douleur post opératoire, position anormale, vocalisation anormale, signes neurologiques, crises épileptiques persistantes. La surveillance renforcée consistera à trois observations par jour et pourra s’étendre à un accompagnement continu. Pendant cette mise en observation, le protocole de recherche sera interrompu et un protocole de soins sera mis en place. Le vétérinaire de l’installation sera alerté sans délai afin de décider de la mise en œuvre des traitements médicaux appropriés : 1. Traitement antidouleur dès les premiers signes de douleur 2. Traitement Antiépileptique si nécessaire 3. Anesthésie général pour tout soin, procédure chirurgicale, prise du sang ou imagerie. 4. Soins de la plaie chirurgicale post opératoire et suivi : Si signes d’infection présentes, les soins locaux seront augmentés en fréquence at une thérapeutique antibiotique sera mise en place 5. Entrainement a la chaise de contention pédant au moins 1 mois. L’animal doit rester calmement assis sur la contention pour la durée de la séance. 6. Les primates qui ne reproduiront pas les crises attendues, seront sortis de l’étude par anticipation. Les animaux isolés gardent un contact tactile, visuel et olfactif avec leurs congénéres ; l'enrichissement environnemental est augmenté (plus de jouets, friandises, ....) et les contacts avec les expérimentateurs accrus.
Choix des espèces
L’utilisation de primates non humains (PNH) dans l’étape finale d’évaluation préclinique est nécessaire avant un usage clinique chez l’Homme pour valider la sécurité et l’efficacité du dispositif. En effet, les PNH ont un cerveau semblable à l’Homme aussi bien sur le plan anatomique que fonctionnel (structure cellulaire, communication et connectivité neuronales, capacités cognitives etc…). En effet, un modèle alternatif ex vivo permettant d’obtenir toutes les données biologiques n’existe pas. De plus les PNH peuvent reproduire des crises d’épilepsie pharmaco résistantes similaires aux crises hippocampiques chez le patient. Notre protocole expérimental vise à arrêter les crises en utilisant des moyens implantables, comme dans un futur système clinique. Règlementairement, Le modèle animal peut être à l’origine d’essais expérimentaux nécessaires avant une expérimentation humaine. Les PNH servent donc, bien souvent, de tremplin avant une application chez l’homme. Les dispositifs médicaux implantables font l’objet de procédures d’évaluation rigoureuse avant de recevoir une autorisation de mise sur le marché. Depuis les années 80, dans tous les pays du Monde, sous la pression des politiques et de la société, une procédure, la « nouvelle approche », s’est progressivement imposée, qui codifie très précisément les différentes étapes de l’évaluation, in vitro, chez l’animal et en clinique pour permettre la mise sur le marché. Chacune de ces étapes, chacun des tests requis connaît des limites, mais au final, le système apparaît efficace, le nombre d’accidents étant particulièrement réduit, eu égard au nombre d’utilisation des dispositifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un âge supérieur à 40 mois et un poids de +/- 7-10 kg, afin de pouvoir faciliter la manipulation et l’entrainement comportemental des sujets adultes.
REALISATION DE TESTS DE TOXICITE ANORMALE CHEZ LE RONGEUR
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
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- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
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- Troubles respiratoires
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- Troubles urogénitaux
Cochons d'Inde : 5000
16 250 rongeurs, 11 250 souris et 5 000 cobayes, vont être utilisés, tous tués par inhalation progressive de CO2 en fin de protocole, 10 625 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 625 à un niveau sévère. Chacun reçoit une administration unique d'un médicament par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale, jusqu'à 25 ml par la bouche pour un cobaye, et les souris passent 10 minutes dans une enceinte chauffée à 38 °C avant l'injection intraveineuse. Le porteur écrit qu'il s'attend, avec ce test de "toxicité anormale" imposé par les pharmacopées avant la libération de lots de médicaments, à "prouver l'innocuité du produit". Il affirme que la "mortalité d'un animal ou l'apparition d'un signe clinique sur celui-ci n'est donc pas attendue", tout en prévoyant que, dans l'une des deux procédures, un rongeur qui atteint un point limite ne soit pas mis à mort.
Objectifs
L’objectif de ce test est de détecter une éventuelle toxicité d’un produit pharmaceutique, après son administration aux animaux. Les produits administrés aux animaux sont des produits pharmaceutiques déjà sur le marché ou nouvellement produits. Nous recherchons par ce test une toxicité anormale, c’est-à-dire que nous nous attendons à prouver l’innocuité du produit. A noter que ce test est réalisé en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Le test de toxicité anormale sur rongeurs est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.
Procédures
-Administration par injection intraveineuse, sur souris uniquement : volume maximum 0,5 ml / souris -Administration par injection intrapéritonéale : volume maximum 1 ml / souris et 5 ml / cobaye. -Administration par voie orale : volume maximum 1 ml / souris et 25 ml / cobaye -Administration sous-cutanée pour les cobayes : volume maximal 10 ml Note : des injections uniques sont prévues dans les deux procédures de ce projet.
Impact sur les animaux
Les tests sont réalisés sur des produits pharmaceutiques fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Ce test est à visée libératoire – c’est un test requis pour la mise à disposition de certains médicaments aux patients. La mortalité d’un animal ou l’apparition d’un signe clinique sur celui-ci n’est donc pas attendue sur ce type de test libératoire. Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques (par injection IP, IV, SC ou gavage), -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites (sauf pour la procédure 1). La réutilisation des animaux pour un autre test de toxicité anormal n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.
Remplacement
Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Il n’existe pas aujourd’hui d’équivalent in vitro au test de toxicité anormale. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM du produit pharmaceutique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal requis par les pharmacopées et les demandes réglementaires (e.g. dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché – AMM). Si l’intervalle de poids requis pour réaliser le test est faible, un animal supplémentaire peut être commandé. Par exemple en cas de retest selon la pharmacopée Russe ; il est demandé l’utilisation de 5 souris pesant entre 19 et 21 grammes le jour de l’injection. La marge de poids étant faible, 1 animal supplémentaire sera commandé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée du protocole Les souris disposent d’un enrichissement de type enviro-dri, spécialement conçue pour améliorer l'activité de construction de nids afin de pouvoir se cacher. Les cobayes disposent d’un enrichissement de type tunnel afin de pouvoir se distraire et se cacher. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. Une observation quotidienne est réalisée : elle consiste à vérifier l’état clinique des animaux, leur alimentation et leur boisson. En cas de point limite observé, l’animal est euthanasié (sauf pour la procédure 1).
Choix des espèces
Le choix des expèces et de leur poids est imposé par les référentiels réglementaires Pharmacopées.
Avenant – Transport cérébral d’un transporteur synthétique de cuivre chez la souris moblo (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Souriceaux d'un modèle de la maladie de Menkès, elles subissent une biopsie de la queue sans anesthésie à sept jours, des injections sous-cutanées cinq jours par semaine, puis une imagerie TEP avec traceur radioactif, pour vérifier le passage d'un transporteur de cuivre vers le cerveau. Le porteur indique que les animaux malades non traités meurent entre trois et cinq semaines et que les injections répétées peuvent provoquer des lésions cutanées. Il affirme que ce modèle murin est le seul adapté et qu'aucune étude in vitro ne reproduit le passage du cuivre à travers la barrière sang-cerveau.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre au niveau des barrières intestinales, placentaires et sang-cerveau. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multisystémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et sang-cerveau est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion cellulaire augmentée grâce à leur faible taille donc pourraient traverser la barrière sang-cerveau. Dans ce cas, l’utilisation d’un transporteur synthétique du cuivre (TSC) serait une solution thérapeutique. Dans un projet précédent, nous avons démontré la tolérance du TSC, déterminé une dose de TSC et un rythme d’administration optimaux, et démontré l’amélioration des signes cliniques chez les animaux malades traités par TSC. Le but de ce nouveau protocole est de démontrer que le TSC est capable de franchir la Barrière sang-cerveau tandis que l’histidine-cuivre, traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes, ne le serait pas. Pour cela l’utilisation d’un radiotraceur tel le 64-Cu dans des techniques de tomographie à émission de positons permettra de répondre à cette question scientifique. L’objet de cet avenant porte sur l’allongement de la durée de la DAP expirant le 22/07/2022 et qui s’explique par plusieurs points. 1/ les 2 établissements dépendent de 2 CE différents, ce qui a créé un décalage de plusieurs mois entre les 2 autorisations. 2/ Une dérive génétique nous a contraint à une procédure de revitalisation qui a très largement retardé le projet (plus de 6 mois) alors que la saisine était déjà autorisée. 3/ Le taux de natalité des animaux mutants de ce nouveau lot est plus faible qu’habituellement, ce qui augmente le temps de production permettant d’obtenir le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Bénéfices attendus
Vérification de la biodistribution du médicament candidat et compréhension des mécanismes de clairance, recherche des effets toxiques potentiels et des zones d’accumulation du principe actif ou du cuivre résiduel. Nous observerons en parallèle l’amélioration de la motricité des animaux et restauration des fonctions altérées par la maladie.
Procédures
- Biopsie de queue réalisée chez la souris âgée de 7 jours. Le prélèvement est réalisé délicatement à l’extrémité de la queue, mesure moins de 1 mm sans toucher à la partie ossifiée. Par ailleurs, à ce stade de croissance il n'y a pas de poils et il suffit de peu de tissu pour réaliser un génotypage de qualité. Il n'y a pas d'anesthésie car cela induit un stress supplémentaire et inutile chez l’animal, le temps d'induction de l'anesthésie est au moins d'une minute tandis qu’une biopsie réalisée rapidement est peu douloureuse et sans aucun saignement, avec une cicatrisation très rapide de la zone lésée. Les injections sous-cutanées des traitements au niveau de la nuque seront réalisées 5 fois par semaine en prenant soin d'alterner les zones de piqure, chez les souris âgées de 5 jours et jusqu'au terme du protocole fixé à J35. A l’âge de 25 jours, transfert dans un nouvel EU (à moins de 2h de route) afin de procéder à la dernière étape du protocole qui est une imagerie médicale (TEP) nécessitant l'injection d'un traceur radioactif (animal anesthésié) quelques heures avant de réaliser le test (animal anesthésié). Au terme du protocole les animaux seront mis à mort afin de procéder aux dissections qui permettront une analyse biochimique et anatomopathologique complète.
Impact sur les animaux
Risque de mort prématurée des animaux malades non traités avec le TSC (espérance de vie estimée entre 21 et 35 jours). Injections sous cutanées répétées de médicament ou placebo 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J35, pouvant induire des lésions cutanées. Chez les animaux malades traités avec le TSC ou l’histidine cuivre, aucune toxicité liée au produit n'a encore jamais été observée. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires sont en cours. Injection de cuivre radioactif pour l’imagerie médicale réalisée sous anesthésie. Le radiotraceur sera présent durant 24h dans l’organisme avant la mise à mort de l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (36 animaux) seront mis à mort à l’issue de la dernière imagerie TEP afin de prélever les organes d’intérêt et procéder à des analyses physiques (mesure de la radioactivité ex vivo), biochimiques et histopathologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative pour étudier l’effet de la mutation du gène ATP7A sur le fonctionnement du cerveau car : 1 - Les défauts de transport du cuivre à travers la Barrière Sang-cerveau, et la biodistribution du cuivre à travers le cerveau ne peuvent pas être transposés dans un modèle d’étude in vitro 2 - Le modèle murin MoBlo est le plus proche de la maladie de Menkès chez l’homme et le mieux adapté pour évaluer le passage du produit radioactif à travers la barrière sang-cerveau et la restauration des paramètres physiologiques grâce au traitement avec le TSC administré par voie sous-cutanée.
Réduction
L’étude portera sur 36 souris mâles de laboratoire, réparties en 6 groupes de 6 mâles dont 3 groupes de 6 souris saines (sauvages) et 3 groupes de 6 souris mutantes (hémizygotes). Cette cohorte de 36 souris mâles sera étudiée et mise à mort une fois les analyses terminées afin de disséquer et analyser tous les organes d’intérêt. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les animaux ne seront jamais maintenus seuls en cage, ils sont hébergés dans des cages autonomes avec filtrage de l'air entrant, et ces cages sont enrichies avec un tunnel et un carré de coton déchiquetable. Les souriceaux seront en contact permanent avec leur mère à laquelle nous donnerons les éléments nécessaires pour préparer un nid. La surveillance des animaux sera assurée quotidiennement par des personnels techniques qualifiés. Les animaux malades sont surveillés avec plus d’attention, et une procédure d’estimation et suppression de la douleur est en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). La gestion de la lignée mutante, qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en piqure sous-cutanée répétée 5 fois par semaine, l’imagerie médicale in vivo sous anesthésie et la mise à mort auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce souris se justifie par l’existence d’animaux porteurs de la mutation du gène ATP7A conduisant à une carence systémique en cuivre, proche de la maladie de Menkès observée chez l’homme. La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J35, correspondant à la fin de l’imagerie médicale en TEP. En effet, durant cette dernière étape, nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur la biodistribution du cuivre sur une période de 24h.
Oligodendrogenèse, myélinisation et cellules souches
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une microinjection à la surface du cerveau ou une mini-pompe implantée sous la peau du dos, en 30 minutes au plus sous anesthésie générale : 696 souris vont être utilisées dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet étudie la production de myéline après sa destruction, dans la perspective de la sclérose en plaques, et des molécules sélectionnées en culture cellulaire que le porteur dit devoir "valider dans un organisme entier". Une partie des souris appartient à des lignées génétiquement modifiées privées de certaines protéines, dont il affirme qu'elles ne présentent "aucun signe de pathologie ou de mal-être", pas plus que les souris démyélinisées, selon lui remyélinisées spontanément. Le résumé ne répartit les 696 souris entre aucun groupe ni objectif, le porteur écrivant seulement que ces effectifs sont "issus de notre expertise dans le domaine".
Objectifs
Dans le système nerveux central, le prolongement majeur des neurones que l’on appelle l’axone est entouré d’une gaine de lipides ou myéline’ qui permet d’optimiser la réponse du neurone et participe au fonctionnement correct des différents tissus et organes du corps humain. Les maladies qui détruisent la myéline dans le système nerveux central sont dites démyélinisantes. La plus commune est la sclérose en plaques (SEP) qui atteint une majorité d'adultes jeunes entre 20 et 40 ans. Les troubles neurologiques associés touchent diverses fonctions comme la motricité, la sensibilité, la vision. Une régénération spontanée de la myéline détruite existe au cours des premières étapes de la maladie, mais le processus finit par s’épuiser conduisant à des handicaps irréversibles. Les traitements actuellement disponibles permettent de réduire l'inflammation déclenchée par le système de défense de l’organisme contre les agressions extérieures, mais aucun ne favorise la régénération de la myéline indispensable dans la phase évolutive de la maladie. Deux sources de cellules sont à l’origine de nouvelles cellules capables de produire la myéline, encore appelées oligodendrocytes. Ces deux sources de cellules portent le nom de progéniteurs neuraux et progéniteurs péri-lésionnels. Elles naissent dans des régions distinctes du tissu nerveux chez le rongeur et existent aussi chez l’humain. Les progéniteurs neuraux sont beaucoup moins caractérisés que les progéniteurs péri-lésionnels. Dès la naissance et jusqu’à l’âge adulte, ils naissent dans une région du cerveau que l’on appelle la zone sous-ventriculaire (ZSV). Il est donc indispensable de bien les caractériser dès leur apparition étant donné leur importance dans la réparation de la myéline détruite au cours de la SEP. Le projet comporte 3 objectifs principaux : Objectif 1 : Caractérisation des propriétés des progéniteurs neuraux dans des conditions physiologiques en comparaison de conditions de destruction de la myéline ; Objectif 2 : Etude de la production des progéniteurs neuraux chez des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas certaines protéines impliquées dans ce processus ; Objectif 3 : Activation de la production de ces progéniteurs par des molécules chimiques préalablement sélectionnées en utilisant des cultures de cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’identifier quel stade de maturation des progéniteurs neuraux il serait intéressant de cibler afin de pallier un défaut de production de myéline suite à une démyélinisation pathologique. Il permettra aussi de déterminer si des molécules préalablement identifiées en utilisant des cultures cellulaires ont une activité de régénération de la myéline dans le contexte inflammatoire qui accompagne classiquement la démyélinisation du système nerveux central que ce soit dans les modèles animaux ou chez l’humain.
Procédures
Une seule chirurgie peu invasive est pratiquée sur chacun des 2 modèles de démyélinisation utilisés. Elles sont réalisées sous anesthésie générale et durent au plus 30 minutes. La première consiste en une microinjection à la surface du cerveau. La seconde est l'implantation sous la peau du dos d'une mini-pompe capable de délivrer les molécules à tester, technique largement éprouvée depuis plusieurs dizaines d'années. Aucun prélèvement ne sera effectué chez l'animal vivant.
Impact sur les animaux
Les lignées transgéniques utilisées ne présentent aucun signe de pathologie ou de mal-être. Par ailleurs, les techniques de démyélinisation qui ne touchent que des aires cérébrales restreintes et sont suivies d’une remyélinisation spontanée n’entraînent aucun phénotype dommageable. Les molécules testées sont déjà utilisées dans d'autres domaines de la thérapeutique et n'induisent pas de toxicité. Les mini-pompes implantables (comme cela existe chez l'humain) sont utilisées couramment depuis des dizaines d'années. Elles sont conçues pour ne développer aucune gêne chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans chacune des deux procédures utilisées dans ce projet.
Remplacement
La genèse de nouvelles cellules dans l’organisme vivant ne peut être reflétée dans son ensemble par des cultures de cellules étant donné la complexité des processus impliquant non seulement les types cellulaires autres que les oligodendrocytes, mais aussi l’environnement des cellulaes. Néanmoins, les cultures cellulaires nous ont d’ores et déjà permis de sélectionner les molécules chimiques les plus prometteuses que nous devons maintenant valider dans un organisme entier. Ceci limite donc le nombre de molécules à évaluer chez l'animal.
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux utilisés en regroupant toutes les analyses histologiques que nous devons réaliser afin d'obtenir un maximum de résultats sur chaque animal et en partageant les tissus avec nos collaborateurs pour les analyses que nous ne maitrisons pas. Les nombres d'animaux utilisés sont issus de notre expertise dans le domaine donc de nos expériences précédentes.
Raffinement
Les modèles de démyélinisation que nous utiliserons dans ce projet sont ceux dont nous avons l’expertise depuis des années. Nos protocoles ont été optimisés et permettent d'induire des démyélinisations très reproductibles évitant d'avoir à augmenter le nombre d'animaux et ne produisant pas de trouble de la motricité. Lorsque nécessaire, nous utilisons des aiguilles extrêmement fines et spécifiquement mises à disposition de la communauté scientifique pour réaliser des injections chez la souris. Des tapis chauffants permettent d’accompagner le réveil des animaux anesthésiés.
Choix des espèces
La grande majorité des lignées transgéniques actuellement disponibles sont des lignées murines. De plus, les modèles de démyélinisation sont aussi pour la plupart développés chez la souris. Des animaux adultes âgés de 7 à 14 semaines sont utilisés afin de se placer dans des conditions d'animaux jeunes, puisque la sclérose en plaques atteint l'adulte jeune.
Morphologie neuronale dans un modèle murin d’autisme: évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris transgéniques modèles d'autisme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit dans la veine de la queue, sous anesthésie, un virus marquant les neurones, puis un traitement oral modulant le système endocannabinoïde, avant que le cerveau soit prélevé. Le porteur présente l'évaluation de cette stratégie comme une étape pouvant mener à terme à des essais cliniques chez les personnes autistes. Il affirme que l'étude de la morphologie des neurones exige un modèle animal plutôt que des sujets humains.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris transgéniques modèles d'autisme. Nous étudierons leur capacité d'améliorer ou corriger les anomalies de la morphologie des cellules nerveuses (neurones) observées chez les souris transgéniques. Le système endocannabinoïde régule la communication entre les neurones (neurotransmission) ainsi que la plasticité synaptique, c'est à dire la capacité du système nerveux de former et de défaire des connexions entre les neurones (synapses). L'autisme et d'autres troubles neurodéveloppementaux tels que la déficience intellectuelle sont caractérisés par des anomalies de la neurotransmission et la plasticité synaptique et pourraient donc être améliorés par des traitements ciblant le système endocannabinoïde.
Bénéfices attendus
L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies, afin de permettre de développer des approches thérapeutiques adaptés. Ces expériences devraient permettre d'évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris modèles d'autisme et pourraient mener à terme à des essais cliniques chez les personnes atteintes.
Procédures
Afin de marquer les neurones du cerveau, les souris seront injectées dans la veine de la queue avec un virus exprimant une protéine fluorescente ; cette injection sera effectuée sous anesthésie générale (durée de la procédure : 3-5 min). Après un délai de 6 semaines, pendant lequel le virus est exprimé, le cerveau est prélevé pour des analyses morphologiques. Deux semaines avant l'euthanasie les animaux recevront un traitement chronique avec un modulateur du système endocannabinoïde, administré par voie orale dans l'eau de boisson. Après 2 semaines de traitement, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde afin de prélever le cerveau pour des analyses de la morphologie neuronale.
Impact sur les animaux
La manipulation par l'expérimentateur peut engendrer un léger stress chez les souris. L'injection du virus dans la veine de la queue peut engendrer une douleur passagère. L'administration par voie orale des traitements n'engendre pas d'effets secondaires. L'injection intrapéritonéale d'un anesthésique avant l'euthanasie peut causer de la douleur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des expériences (6 semaines après l'injection du virus), afin de prélever le cerveau et effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits comportementaux, l'activité des circuits neuronaux intacts et la morphologie des neurones corticaux. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 80 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 8-10 par condition étudiée. Ce nombre tient compte de la variabilité interindividuelle observée lors de ce type d'analyses morphologiques et du fait que le marquage neuronal suite à l'injection du virus peut ne pas bien marcher chez certaines souris. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de gêne possible. L’injection du virus dans la veine de la queue est réalisée sous anesthésie générale. Le virus injecté n'affecte pas le bien être des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance est exclue du protocole. Les souris sont hébergées à raison de 2 à 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. A la fin des expériences nécessitant de prélever le cerveau pour des analyses histologiques, les souris sont anesthésiées avant d'être euthanasiées, leur évitant toute détresse.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-4 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Evaluation de l’effet des candidats médicaments sur l’expression de gènes dans différentes régions cérébrales.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau sous anesthésie, avec injection d'un candidat médicament dans un ventricule cérébral, puis est mise à mort une semaine plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur décrit une étude exploratoire sur l'expression de gènes, dont les retombées éventuelles contre Alzheimer ou Parkinson dépendent de résultats positifs restant à obtenir. Il affirme que la complexité des interactions entre neurones et cellules gliales ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal.
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l'effet de candidats médicaments sur l'expression de gènes cibles, sur le long terme. Dans une première procédure, les candidats médicaments seront administrés par injection intra-cérébroventriculaire par stéréotaxie et en injection unilatérale. Une semaine après la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront mis à mort, sous anesthésie profonde, et disséqués pour collecter leur cerveau (procédure 1). Ce projet expérimental correspond à une étude exploratoire conçue pour déterminer l'effet de candidats médicaments sur l'expression de gènes.
Bénéfices attendus
Ce projet expérimental correspond à une étude exploratoire conçue pour déterminer l'effet de candidats médicaments sur l'expression de gènes et protéines. En cas de résultats positifs, les composés seront testés sur des modèles animaux de maladies neurodégénératives (ex. maladie d'Alzheimer, maladie de Parkinson).
Procédures
Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale (isoflurane, 4 % induction puis 2%). Les souris récupèrent après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. expression de gènes, histologie).
Remplacement
Les processus pathophysiologiques des maladies neurodégénératives impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
La taille des groupes a été déterminée pour assurer un nombre de réplicats suffisants pour l'analyse des échantillons biologiques par analyses biomoléculaires. Le cerveau sera microdisséqué pour collecter plusieurs régions cérébrales, ce qui limitera la variabilité des résultats. Des études antérieurs à ce projet indiquent qu'un effectif de 5 souris par groupe est suffisant pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre deux groupes
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) des approches d'analgésies avant, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libidum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
L'objectif du projet est de déterminer si des candidats-médicaments peuvent diminuer l'expression de gènes et protéines dans différentes structures cérébrales. La souris possède un système cérébral complexe, qui présente de fortes similitudes avec le système nerveux humain. Nous disposons du matériel chirurgical et des équipements requis aux études impliquant des souris. Les candidats médicaments sont développés pour traiter des maladies humaines apparaissant à l'age adulte. Les souris seront agées de 10 mois, ce qui correspond à un stade de développement adulte avancé.
Système Nerveux Central – Tests sur cultures primaires et tranches de cerveaux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 360
720 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, majoritairement tués sous anesthésie sans réveil, le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont anesthésiés puis tués pour prélever des cellules ou des tranches de cerveau, y compris par césarienne sur des femelles gestantes dont les embryons sont ensuite tués, afin de cribler des candidats médicaments contre des maladies neurologiques. Le porteur présente ces cultures et tranches comme des méthodes alternatives limitant le nombre d'animaux utilisés dans des études in vivo ultérieures. Il indique que certaines expériences recourent à des cellules souches humaines, mais que ces modèles restent réservés à l'évaluation de "modèles simples".
Objectifs
Les tests réalisés sur des cultures primaires (modèle in-vitro) ou sur des tranches de cerveau de rongeur (modèles ex-vivo) permettent d'obtenir des données préliminaires quant à la sécurité et l'efficacité de candidats traitements, avant de devoir réaliser des études plus poussées dans des modèles de pathologies in vivo. Plus précisément, les modèles de cultures primaires permettent d’évaluer la réponse physiologique de cellules du système nerveux central (cellules provenant du cerveau ou de la moelle épinière) suite à l’ajout d’une substance toxique (exemple d’agents neurotoxiques ou chimiothérapies). Les modèles ex-vivo sont utilisés pour mimer la transmission synaptique ou la présence de décharges épileptiques induites par des substances chimiques. Ces différents tests permettent d'étudier les effets de substances pharmacologiques pour lutter contre des maladies neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer, l'épilepsie ou la sclérose en plaques ou tester leur innocuité. Ces modèles sont utilisés pour évaluer les nouveaux traitements à un stade très précoce et sélectionner les substances les plus efficaces pour les tester sur des modèles plus complexes (modèles in-vivo).
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de cancers ou de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, les traitements chimiothérapeutiques induisent des effets secondaires sur le Système Nerveux Central. Certains modèles in-vitro ont pour but d’évaluer de nouvelles substances permettant de limiter l’impact des traitements anti-cancéreux sur les cellules saines du Système Nerveux Central. D'autres modèles permettent d'évaluer l'efficacité de traitements anti-épileptiques, les actuels sur le marché n'étant pas efficaces chez tous les patients. Enfin, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la sclérose en plaque ou la maladie d'Alzheimer ; la recherche de nouvelles substances reste donc une priorité.
Procédures
Pour la procédure 1: les animaux sont anesthésiés avec de l'isoflurane. Dans le cas des femelles gestantes, une césarienne est opérée avant euthanasie (sans retour à l’état conscient). Les embryons sont euthanasiés directement dès la césarienne. Pour la procédure 2: les animaux peuvent être administrés avec une substance par voie orale ou par voie systémique (dans la majorité des cas, 1 fois dans les 24 h précédant le test) puis sont anesthésiés avec de l'isoflurane. Les animaux sont euthanasiés sans retour à l'état conscient.
Impact sur les animaux
Pour ces modèles, les animaux sont anesthésiés puis euthanasiés avant le prélèvement des structures/organes nécessaires. Le seul risque concerne les cas où l'animal est traité avec un candidat médicament avant anesthésie (procédure 2) ; mais à ce stade, en général les effets des traitements ont déjà été étudiés et ne sont pas supposés entrainer d'effets secondaires sévères.
Devenir
Ces procédures sont des procédures terminales (prélèvement de structures cérébrales) ; les animaux sont donc tous euthanasiés dans le cadre des procédures.
Remplacement
Ces modèles constituent des méthodes alternatives permettant de tester un grand nombre de molécules sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Dans certains cas, des cellules souches différenciées humaines peuvent être utilisées. Ces modèles in-vitro ont l'avantage d'être translationnels mais ne peuvent être utilisés que pour évaluer des molécules sur des modèles simples (cellules).
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires ou sur tranches sont utilisés pour pouvoir sélectionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter le nombre d'animaux à tester. L'utilisation de cellules issues de quelques animaux permet d'obtenir des données d'efficacité et de sécurité d'un nombre très important de composés et/ou de doses, permettant une réduction importante du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général). Les animaliers et les techniciens sont formés au suivi des animaux et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas des femelles gestantes, pour éviter les agressions). Les animaux sont anesthésiés avant d'être sacrifiés.
Choix des espèces
Les études sont effectuées sur des cellules ou organes de rongeur car ces modèles sont translationnels. Le choix de l'espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études à venir (modèles pathologiques reproduits chez la souris ou chez le rat). Pour mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques, ces modèles peuvent être également utilisés a posteriori. Le choix de l'espèce est dans ce cas lié aux études précédentes. Pour les cultures primaires réalisées à partir d'embryons, des mères gestantes seront utilisés (mères ayant 15 à 20 jours de gestation en fonction de la structure à prélever, pour des cultures de neurones embryonnaires). Pour les cultures primaires réalisées sur des animaux nés, des rongeurs âgés entre 1 et 10 jours seront utilisés. Le stade de développement choisi dépend du stade de maturation souhaité (les neurones post-nataux étant plus différenciés, et permettant d'étudier un réseau neuronal plus mature). Pour les modèles sur tranches, les rongeurs (souris, rats) sont testés une fois sevrés, l'âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Les procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période de post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Identification de nouvelles molécules antiépileptiques dans un modèle d’embrasement amygdalien chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante des électrodes dans le cerveau, puis des stimulations électriques répétées de l'amygdale provoquent des crises d'épilepsie, pour tester des molécules antiépileptiques développées par des industriels du médicament. Le porteur indique que ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids, et que l'hébergement en cage individuelle peut aggraver ce stress. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les circuits neuronaux impliqués et que les tests sur l'animal vivant sont "indispensables" avant toute mise sur le marché.
Objectifs
Les désordres épileptiques représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes avec une incidence de 0.6 % de la population mondiale. Malgré le développement de plusieurs antiépileptiques ces 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par ces traitements qui provoquent de plus de nombreux effets secondaires. Il est donc critique de développer de nouvelles molécules antiépileptiques afin de traiter les patients résistants aux traitements déjà existants et d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de tester, sélectionner et valider de nouvelles molécules développées par les professionnels du médicament dans un modèle de rat mimant une épilepsie chronique focale secondairement généralisée. Cette approche repose sur la stimulation électrique répétée afin de reproduire les principales caractéristiques électrophysiologiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Des études pharmacologiques ont montré l’utilité de ce modèle reposant sur la méthode de l’embrasement, pour le criblage de molécules grâce à la bonne stabilité du modèle une fois établi . Il apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouvelles molécules antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de nouvelles molécules antiépileptiques plus efficaces et ayant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouvelles molécules antiépileptiques afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. L’utilisation du modèle de rat embrasé pourrait également permettre d’identifier des cibles potentiellement impliquées dans la génération et/ou la propagation des crises d’épilepsie. Ce projet ajoute une analyse électrophysiologique (en sus de l’évaluation comportementale classiquement décrite) de l’effet sur ce modèle d’épilepsie des molécules testées en caractérisant notamment : les durées, latences d’apparition et amplitudes des crises, et les variations potentielles de seuil d’excitabilité des réseaux observés. Une attention particulière sera portée sur l’effet sur la généralisation ou non des crises induites par la stimulation. L’utilisation de ce modèle dans ce projet pourrait donc permettre d’identifier le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements antiépileptiques ou bien leur capacité à ralentir voire arrêter la phase d’épileptogénèse.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une chirurgie d’implantation d’électrodes corticales et sous-corticales, procédure réalisée sous anesthésie générale. Puis des stimulations électriques amygdaliennes de faible intensité et de courte durée (1s) seront réalisées sur l’animal vigile. Une stimulation quotidienne (5 jours sur 7) sera appliquée pendant la phase d’établissement du modèle (2 à 4 semaines). Lors des tests pharmacologiques en aïgu, une administration sur animal vigile maintenu en contention précèdera la stimulation. Ces administrations seront espacées de 72h minimum et ne pourront pas excéder le nombre de 20. Lors des tests pharmacologiques en administration chronique, les injections peuvent être réalisées jusqu’à trois fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Quatre lots de 25 animaux pourront être implantés avec une pompe osmotique sous anesthésie générale, permettant une administration continue des molécules testées. Lors des protocoles de tests pharmacologiques, 4 stimulations électriques maximum auront lieu dans la même journée, deux fois par semaine maximum. En fin d’étude, selon la demande des clients, les animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Ce modèle animal implique l’utilisation de stimulations électriques répétées permettant d’abaisser progressivement le seuil d’excitabilité cérébrale. L’intensité de stimulation est progressivement augmentée jusqu’à générer les premières crises épileptiques détectées sur le signal électroencéphalographique. Une fois cette intensité fixée par animal, elle est maintenue pour l’ensemble des stimulations appliquées par la suite. L’animal va présenter à chaque stimulation un ou plusieurs des signes décrits par l’échelle d’évaluation comportementale (échelle de Racine) : ces effets sont observés sur un cours laps de temps uniquement dans les minutes post-stimulation (maximum 2 minutes). En dehors de cette courte période, les animaux ne présentent pas de crises ni de comportements anormaux observables. L’amygdale basolatérale est impliquée dans les mécanismes de défense et les comportements de fuite chez les rongeurs, il est donc envisageable que la stimulation de cette zone aie un impact émotionnel sur l’animal, même si ce potentiel effet n’est pas décrit dans la littérature sur ce modèle. Au cours de la phase de génération du modèle (~15 jours), ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids. De plus, la nécessité d’hébergement en cage individuelle des animaux (afin de préserver l’intégrité des systèmes d’enregistrement) peut potentiellement exacerber ce stress. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une myorelaxation, une sommnolence ou à l’inverse des myoclonies du fait des mécanismes d’action des molécules testées.
Devenir
Ce projet implique l’implantation de dispositifs de stimulation et d’enregistrement de signaux électroenécephalographiques et la mise en place d’un modèle pathologique. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de molécules à la fois sur l’épileptogénèse et sur la génération de crises épileptiques. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro ou modèle computationnel reproduisant les circuits neuronaux impliqués dans leur globalité et pouvant se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité de la molécule testée, les tests in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées. Les protocoles d’études sont basés sur des procédures d’études cliniques en utilisant un plan d’étude croisé permettant de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique puisque chaque animal est son propre contrôle. Un nombre minimum final de 16 animaux pour les protocoles pharmacologiques est nécessaire pour obtenir des résultats fiables.
Raffinement
Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec une stimulation électrique répétée de classe modérée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et l’état général de l’animal. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins sont optimisées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Le poids des animaux est également contrôlé de manière continue et hebdomadaire. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles contenant un enrichissement composé de briquettes en bois, de nichoirs en papier kraft et de bâtonets en nylon dédiés spécifiquement aux rongeurs. Afin de minimiser la détresse sociale liée à l’isolement, les animaux sont régulièrement regroupés dans une grande enceinte avec différents éléments (tunnels, briquettes en bois, objets divers). Cette étape d’enrichissement social est réalisée au moins une fois par semaine sous la supervision d’un membre du laboratoire afin d’éviter tout endomagement des dispositifs d’enregistrement.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont indispensables pour avancer la compréhension des épilepsies. De précédentes études ont montré la très bonne sensibilité des rats vis-à-vis des protocoles d’embrasement afin de modéliser l’épilepsie humaine. Les activités neurologiques visibles sur les signaux électroencéphalographiques ont des profils similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie- : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues : suppression ou réduction des crises avec le valproate, le diazepam et l’éthosuximide. Des rats adultes de 5 à 7 semaines seront utilisés dans ce projet. Les procédures seront réalisées au minimum une semaine après l’arrivée des animaux dans notre établissement. L’implantation des électrodes corticales et profondes impose l’utilisation d’un cerveau mature afin que le positionnement des électrodes soit correct, que les connections neuronales soient bien établies et que les animaux puissent récupérer facilement de la chirurgie.
Caractérisation de la pathogénicité d’une fibre d’alpha-synucléine furtive chez la souris M83
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une forme agrégée d'alpha-synucléine qui déclenche une maladie proche de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que cette inoculation conduirait de toute façon à la mort par paralysie progressive, et que les souris sont tuées dès l'apparition d'une démarche saccadée et de troubles de l'équilibre, avant la paralysie du train arrière. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale pour décrire l'extension de ces lésions.
Objectifs
Le projet vise à caractériser la maladie chez la souris génétiquement modifiée M83 après injection dans le cerveau d’une forme particulière d’alpha-synucléine agrégée, non détéctable par les méthodes de laboratoire jusqu'à présent utilisées. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines assocciées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy , atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées chez les souris.
Procédures
Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 40 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.
Impact sur les animaux
L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.
Remplacement
Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
Réduction
Les lots expérimentaux conduits jusqu’au stade clinique sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, homozygotes et hémizygotes. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions dans les différentes régions du cerveau et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle transgénique.
Raffinement
Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation stéréotaxique des fibrilles dans le striatum, qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.
Etude pilote d’injections intracérébrales à P2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
80 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux jours, ils reçoivent une injection dans le cerveau de bleu de méthylène ou de solution saline sous anesthésie par hypothermie sur la glace, 60 étant tués juste après l'injection et 20 gardés jusqu'au sevrage. Le porteur indique que des pertes sont attendues du fait du jeune âge et du rejet des petits par la mère après l'injection. Cette étude ne teste aucun traitement, elle sert à caler le geste avant une future recherche de thérapie génique contre la sclérose latérale amyotrophique, et le porteur affirme que la souris reste un modèle "indispensable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre cette maladie, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent des troubles moteurs associés à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de la stabilité à long terme de l’expression des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mettre en place des injections dans le cerveau chez la souris à l'âge de deux jours, pour permettre la libération de matériaux génétiques dans l'ensemble du système nerveux central. Dans cette étude pilote nous utiliserons du bleu de méthylène pour confirmer nos sites d'injections. Après la mise au point de ces injections, des injections avec des AAV seront réalisées dans un modèle de souris SLA, afin de valider l'effet thérapeutique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).
Bénéfices attendus
Ce projet méthodologique permettra de mettre en place un protocole pour des injections intracérébrales chez la souris à un stade de développement précoce. Cette étude pilote précède une étude de thérapie génique reposant sur l'injection de virus AAV dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique. A long terme, ce projet permettra de mettre en place de nouveaux traitements contra cette maladie incurable.
Procédures
Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec du bleu de méthylène ou une solution saline chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec
Impact sur les animaux
Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux.
Remplacement
Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l'aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable.
Réduction
Cette étude pilote vise à acquérir le geste technique ainsi, pour la reproductibilité du geste technique et la justesse des coordonnées d'injections ainsi que l'étude de la survie des animaux, nous utiliserons 80 souriceaux : 60 sacrifiés immédiatement après les injections et 20 maintenus en vie jusqu'au sevrage. Il n'y aura pas d'analyse statistique.
Raffinement
Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites suivants : -Si une souris présente des difficultés respiratoires, se réveille et/ou présente des signes de douleur durant l'injection ou au réveil, elle sera mise à mort. Les animaux maintenus en vie jusqu'au sevrage seront surveillés quotidiennement. -Si 24h après les injections une souris ne présente pas de "poche de lait" dans l'abdomen, c’est-à-dire qu'elle n'a pas pu s'alimenter avec le lait de sa mère, elle sera mise à mort -Si une souris ne retrouve pas une température corporelle normale c’est-à-dire présente une couleur bleue/violacée après les injections ou lors du retour à la mère, elle sera mise à mort. Durant le développement des souris nous contrôlerons la présence de signes cliniques d’affaiblissement (poil hirsute, prostration, difficultés à se déplacer, difficultés à s’alimenter...) Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.
Choix des espèces
Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, pour valider notre protocole et confirmer les sites d'injection.
Evaluation de l’hyperexcitabilité corticale dans des modèles murins de Sclérose Latérale Amyotrophique par électrocorticographie et électroencéphalographie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles développent une paralysie progressive des pattes et peuvent perdre jusqu'à 40 % de leur poids, subissent des chirurgies, des injections quotidiennes pendant deux mois et des isolements de 24 heures pour enregistrer leur activité cérébrale. Le projet cherche à valider une méthode de diagnostic précoce et à tester des molécules censées restaurer le fonctionnement du cerveau. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro un cerveau entier", ce qui écarterait selon lui le remplacement.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. La SLA découle de la mort de neurones présents dans le cerveau et la moelle épinière. Il est suspecté que la maladie pourrait commencer dans le cerveau. En effet, il a été montré que les personnes porteuses de mutations induisant la SLA présentent une altération du fonctionnement du cerveau bien avant l’apparition de la paralysie. L’enregistrement de l’activité du cerveau pourrait donc servir de marqueur précoce de la SLA. Cependant, les techniques actuelles sont chères, difficiles à appliquer et peu utilisées. Pour pallier à ce problème nous proposons une méthode alternative que nous souhaitons tester sur des souris génétiquement modifiées et qui reproduisent les symptômes de la SLA. Notre hypothèse est que l’utilisation d’une nouvelle méthode d’analyse du fonctionnement du cerveau permettrait de diagnostiquer les patients SLA plus tôt, pour leur permettre d’avoir accès plus rapidement aux traitements disponibles et permettre à un plus grand nombre de patients de participer aux essais cliniques visant à développer de nouveaux traitements. Tester cette hypothèse constitue le premier objectif de notre projet. Le second objectif consiste à tester l’effet de diverses molécules, sélectionnées sur les bases de nos résultats d’analyses moléculaires, pour leur capacité à restaurer des dysfonctionnements du cerveau propres à la SLA.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, deux conditions sont nécessaires pour établir un diagnostic de SLA: 1) un signe de mort des neurones du cerveau, et 2) un signe de mort des neurones de la moelle épinière. Malheureusement, les premiers sont souvent masqués par les seconds, ce qui ralentit grandement le diagnostic de la maladie : il faut en moyenne 17 mois pour diagnostiquer la maladie. Or la maladie progresse très vite, 24 à 60 mois en moyenne, et le retard de diagnostic ralentit l’accès des patients aux traitements et limite leur participation aux études cliniques. Pour contourner la difficulté de mettre en évidence les signes de mort des neurones du cerveau et accélérer le diagnostic de la maladie, nous proposons de révéler les dérèglements du fonctionnement du cerveau par des approches d’investigation déjà présentes en clinique, afin d’accélérer le diagnostic de la SLA. Plusieurs études scientifiques suggèrent que le dysfonctionnement du cerveau pourrait être à l’origine de la SLA. Nous proposons donc également de tester l’effet de médicaments choisis pour améliorer le fonctionnement du cerveau, afin de déterminer s’ils pourraient constituer de nouveaux traitements de la SLA.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d’interventions : - Une partie des animaux subira une chirurgie d'une durée de 30 minutes, puis une injection d'une durée de 30 secondes. - Une partie des animaux subira également une chirurgie d'une durée de 45 minutes puis sera isolé 24h tous les 15 jours ou tous les mois pour des enregistrements sur animal vigile. - En parallèle, les animaux recevront une injection/jour d'une durée de 30 secondes pendant 2 mois.
Impact sur les animaux
Trois types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- une partie des animaux aura des altérations motrices évoluant des pattes arrière vers les pattes avant et une perte de poids pouvant aller jusqu'à 40%. Pour d'autres animaux, une altération de l'extension des pattes arrière ou une diminution de la capacité à s'agripper seront observés. 2- L’isolement des animaux durant les 24 heures nécessaires à l’enregistrement de leur activité cérébrale, avant retour dans la cage avec leurs congénères. 3- Suite aux chirurgies, une inflammation, un saignement ou une réouverte de la plaie peuvent être observés. Suite aux injections répétées, une inflammation au point d'injection peut également être observée.
Devenir
Tous les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
Ce projet consiste à déterminer si l’altération du fonctionnement du cerveau qui caractérise les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique pourrait aider au de diagnostic de la maladie et constituer une nouvelle cible thérapeutique. A l’heure actuelle, il n’est pas possible de recréer in vitro un cerveau entier. En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal ne saurait être remplacé par un modèle cellulaire.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. De plus, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les mâles pour les suivis longitudinaux de l’activité du cerveau, et les femelles pour les analyses histologiques et moléculaires.
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établis. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré et post opératoire.
Choix des espèces
Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) il existe plusieurs lignées de souris qui, dans leur ensemble couvrent plusieurs mutations retrouvées chez les patients contrairement aux modèles de primates (très rares) ou de rats (peu fréquents) et que la multiplication des modèles est désormais requise pour convaincre la communauté scientifique, et 3) elles permettent davantage de manipulations génétiques, par croisement, qui permettent en outre de répondre également à des questions mécanistiques. Les animaux seront utilisés à partir de 12 jours ou 40 jours et jusqu'à 12 mois maximum.
Programme d’immunisation de rats en vue de la production d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.
Choix des espèces
Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.