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Caractérisation du rôle de régulateurs de l’intégrité génomique et du microenvironnement hépatique dans des modèles murins de stéatose-stéatohépatite et de cancer du foie. EU 1/2 – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant six à douze mois à des régimes enrichis en gras et en sucre destinés à provoquer une stéatose puis un cancer du foie, avec une injection intraveineuse sous anesthésie, huit à douze échographies hépatiques, trois prélèvements de sang et un transport entre deux établissements. Le porteur attend une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité et leur comportement, ainsi qu'une altération de l'état général liée au développement des tumeurs. Les retombées annoncées, de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles pistes thérapeutiques, sont renvoyées à un "futur proche", tandis que le recours à la souris est déclaré "indispensable" au motif qu'aucune lignée cellulaire ne restituerait les interactions du foie avec les autres organes.
Objectifs
Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnostic et pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée). Enfin, le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.
Devenir
Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.
Réduction
4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.
Production du parasite Echinococcus multilocularis chez la souris pour la recherche de molécules à visée thérapeutique pour traiter l’échinococcose alvéolaire
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Maintenir en vie un parasite pour pouvoir le cultiver au laboratoire : 150 souris reçoivent une injection intrapéritonéale d'Echinococcus multilocularis, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure cinq à dix secondes et constitue l'unique intervention, la masse parasitaire se développant ensuite dans leur abdomen pendant deux à trois mois. Le porteur indique que l'échinococcose alvéolaire ne donne de symptômes qu'à un stade très avancé et prévoit une seule visite par semaine, avec une grille de score et une surveillance resserrée au-delà d'un certain seuil. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour récupérer le matériel parasitaire, qui sert à réinfecter un nouveau lot de souris et à relancer les cultures in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de maintenir en vie le parasite Echinococcus multilocularis chez des animaux, afin de pouvoir le multiplier en culture in vitro et tester de nouveaux traitements sur ces cultures.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet de pouvoir tester des nouveaux traitements contre ce parasite sur des cultures in vitro. Ceci permettra d’éliminer les traitements candidats se montrant inefficaces, et de sélectionner ceux se montrant efficaces pour une étude plus approfondie. Le projet permet également de maintenir en vie le parasite, sans quoi il serait perdu.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection de 100 μL de parasite dans le péritoine (durée 5-10 sec).
Impact sur les animaux
L’échinococcose alvéolaire ne génère des symptômes qu’à un stade très avancé de la maladie. Les nuisances générées dépendent de la taille du parasite et de sa localisation. Dans ce projet, le parasite est dans le péritoine, ce qui limite l’impact sur les autres organes. Toutefois, nous réaliserons une visite hebdomadaire avec des observations selon une feuille de score adaptée. Cette feuille permet un suivi individuel des souris une fois par semaine puis avec une fréquence plus importante dès lors qu’un certain score est atteint En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal sera mis à mort et la charge parasitaire sera prélevée comme prévu
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort par dislocation cervicale 2 à 3 mois (en fonction de l’évolution de la masse parasitaire et des points limites atteints) après l’infection péritonéale afin de récupérer le matériel parasitaire pour ré-infecter un nouveau lot de souris et démarrer des cultures in vitro.
Remplacement
Un système de culture in vitro du parasite a été développé et permet sa culture à grande échelle. Cependant, cette méthode de culture ne peut pas se maintenir dans un temps infini, justifiant que le matériel parasitaire doit être acquis régulièrement auprès d’animaux infectés, telles que les souris, afin de permettre une amplification du parasite in vitro. Les petits rongeurs sont des hôtes naturels du parasite E. multilocularis. L'utilisation de souris, et leur infection péritonéale est une méthode standard pour le maintien du parasite E. multilocularis et la génération ultérieure de cultures in vitro. Le matériel parasitaire ainsi produit nous permettra de tester et de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette pathologie souvent mortelle.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour réaliser nos cultures in vitro pour tester de nouvelles thérapeutiques. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre de 150 souris sera utilisé.
Raffinement
Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en oeuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire selon une grille de score adaptée. Nous réaliserons une visite hebdomadaire avec des observations selon une feuille de score. La feuille sera remplie individuellement pour chaque souris au moins chaque semaine une fois que la croissance parasitaire ou une anomalie dans le comportement ou le bien-être de l'animal est observée. En cas d’atteinte sévère l'animal sera euthanasié. A partir d’un certain score sur la grille, la fréquence de contrôle des animaux sera augmentée.
Choix des espèces
es petits rongeurs sont des hôtes naturels du parasite Echinococcus multilocularis. L’utilisation de souris et leur infection péritonéale est une méthode standard pour le maintien du parasite E. multilocularis et la génération ultérieure de cultures in vitro. Adulte, âgées de 6 à 8 semaines, d’environ 20g
Etudes de Pharmacocinétiques de composés administrés en IV, IP ou PO sur rongeurs prélevés de façon longitudinale par la méthode du microsampling
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 560
Tués en fin de procédure parce qu'ils "ne sont plus naïfs" et ont pu stocker des composés, 740 souris et 560 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une administration unique par voie orogastrique, intrapéritonéale ou intraveineuse, puis jusqu'à sept micro-prélèvements sanguins à l'état éveillé, qui peuvent laisser des ecchymoses. Une partie d'entre eux est rendue malade au préalable, par une hépatite induite ou un choc septique, avec fourrure ébouriffée, yeux mi-clos et fatigue générale. Le porteur présente le projet comme une réduction, quatre animaux par étude au lieu de vingt-quatre, tout en précisant qu'aucune étude statistique n'a servi à fixer ce nombre. Son texte annonce 660 souris et 480 rats, alors que les effectifs déclarés par niveau de souffrance totalisent 1 300 animaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'étudier la distribution plasmatique de composés d'intérêt dans le cadre de notre recherche de conception de médicaments. Les propriétés physico-chimiques des composés étudiés leur confèrent des propriétés pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo. Pour étudier l’efficacité pharmacologique des molécules dans un modèle donné ou dans une pathologie précise, il est nécessaire de savoir comment la molécule se comporte une fois administrée à un organisme vivant. C'est-à-dire quel sera son impact et son devenir dans un organisme dans lequel elle est administrée. L'objectif de ce projet est d'étudier la distribution plasmatique de composés d'intérêt dans le cadre de notre programme de recherche de drug discovery. Notre laboratoire effectue déjà ce type de manipulation depuis de nombreuses années. Cela nécessite pour chaque molécule testée, un nombre d'animaux non négligeable. Les évolutions technologiques permettent de nos jours à nos chimistes d'effectuer des analyses de spectrométrie précises nécessitant de très faibles volumes de plasmas. C'est dans ce contexte que s'inscrit l'intérêt de notre projet qui est de réduire le nombre d'animaux grâce à des prélèvements répétés mais de faible volume, ne nécessitant pas d'anesthésie, ce qui est un confort supplémentaire pour les animaux. Cette technique permet de suivre l'évolution plasmatique du composé dans le sang d'un même animal, donnant des données plus robustes et supprimant ainsi la nécessité de recours à des animaux satellites. L'ensemble des procédures décrites dans ce projet appliquées à des souris et des rats nécessitera l'emploi de 660 souris et 480 rats sur les 5 années qui couvrent ce projet.
Bénéfices attendus
Ces études de bio distribution préalables aux études d’évaluation de l’efficacité des composés dans des modèles pathologiques, permettent de déterminer les conditions optimales d’administration des principes actifs étudiés. Cela peut donc contribuer à obtenir des modèles plus qualitatifs (conditions optimales) et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés (moins de répétitions d’étude). La méthode de microsampling développée et décrite dans ce projet permettra de diminuer significativement le nombre d'animaux utilisé pour ces études de pharmacocinétique grâce aux prélèvements de faibles volumes répétés sur un même animal. Les prélèvements se font vigiles, les animaux n'ont pas à subbir de multiples anesthésies, les aiguilles utilisées sont plus petites et donc moins invasives pour les animaux. A terme, une procédure telle que décrite dans ce projet utilisera seulement 4 animaux contre 24 habituellement.
Procédures
Les animaux sains recevront tout d'abord une administration unique d'un composé à étudier. Il pourra être administré soit par voie oro-gastrique, soit par voie intra-péritonéale, soit par voie intraveineuse, ces administrations quelle que soit la voie seront d'une durée de 5 à 10 secondes pour les 2 premières et 15 secondes pour l'intraveineuse. . Les animaux subiront des micro-prélèvements répétés à l'état éveillé qui seront de faible volume et dont le nombre sera de 7 au maximum dont la durée sera de 10 secondes. Les animaux pathologiques seront d'abord induit avec la pathologie. Cette induction se fera par injection intra-péritonéale d'une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements répétés se font certes sans anesthésie, mais ils sont répartis sur différentes parties et sont de faibles volumes. Ils pourront engendrer le cas échéant des ecchymoses. Dans le cas de pharmacocinétiques (PK) réalisées sur animaux pathologiques, les effets néfastes proviendront plus des effets de la pathologie installée, mais ayant connaissance de nos modèles sur lesquels nous travaillons (hépatites sévères et choc septique ), une grille d'observation des points limites sera appliquées, dans ces cas où nous connaissons l'heure finale, les prélèvements se feront durant cette période d'installation de la pathologie mais pas au delà. Par exemple concernant le choc septique, qui dans nos protocoles ne dépassent pas 6h, nous ne prévoyons pas de prélèvements au delà de ces 6h. De même, dans le cas d'une étude pharmocinétique sur souris présentant une hépatite induite par intoxication médicamenteuse, les animaux devront être mis à jeûn la veille au soir, mais seront de nouveau nourris, sitôt l'intoxication effectuée. Les effets observés suite à l'installation de la pathologie sont une fourrure ebourriffée, des yeux mi-clos et une fatigue générale de l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure expérimentale. Bien que nous n'étudions que l'exposition plasmatique, nous mettrons les animaux à mort car ils ne peuvent en aucune mesure être employés dans d'autres études (ils ne sont plus naïfs et ont pu stocker des quantités de composés ou de ses métabolites).
Remplacement
Les études du devenir d'un médicament dans un organisme sont menées dans un organisme vivant disposant de toutes les facultés physiques et biochimiques nécessaire à son adsorption, sa métabolisation, et son élimination. Ces caractéristiques ne peuvent être obtenues qu'après avoir administré le médicament à un animal . Des études de métabolisation peuvent être conduites in vitro pour identifier des métabolites ou des voies métaboliques, mais ces études de pharmaco cinétiques ne peuvent être conduites qu'in vivo, et chaque espèce présente ces caractéristiques, elles sont aussi menées chez l'homme.
Réduction
Ce projet vise à réduire le nombre d'animaux utilisés pour ce type d'études. Alors qu'une étude pharmacocinétique classique requiert 24 animaux, c'est-à-dire 3 animaux par temps de prélèvement sur un total de 7 temps ainsi que 3 animaux contrôle véhicule prélevés à un seul temps, nous utiliserons dans notre cas seulement 4 animaux dans le cas de procédure sur animaux sains (3 pour la molécule et 1 pour le véhicule), prélevés à chaque timepoint, de façon à avoir une étude longitudinale au sein du même individu. Les résultats obtenus seront ainsi plus robustes car cela permet d'éviter la variabilité inter-individu. Cela est rendu possible de par le fait que les méthodes de quantification et d'analyse chimique actuelles ne requierent que quelques microlitres de plasma. Il n'a pas été fait d'étude statistique pour déterminer ce nombre d'animaux.
Raffinement
Ce projet permet également un raffinement en comparaison d'études pharmacocinétiques classiques, car il permet de prélever des quantités de sang très faibles, en évitant de multiples anesthésies gazeuses, en évitant également les prélèvements à l'oeil, qui peuvent entrainer un inconfort. Pour ce faire, les animaux auront une période d'habituation à la manipulation, visant à éliminer tout stress ressenti par l'animal au cours de l'expérience. Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de respecter leur instinct de groupe. Ils bénéficieront d'enrichissements de milieu adaptés tels que briques en bois pour ronger, coton et kraft pour nidifier, igloos pour se cacher. Lors des différentes procédures, les animaux seront observés selon une grille de critères afin d'évaluer leur mal-être, basée sur l'apparence (fourrure ebourriffée, yeux mi-clos), la posture ainsi que la réactivité aux stimuli. Dans le cas de la procédure nécessitant une mise à jeûn, celle-ci se fera la veille au soir, les animaux seront ré-alimentés peu après l'injection de l'agent entrainant la pathologie.
Choix des espèces
Les travaux de recherche publiés dans la littérature scientifique font appel à ces espèces dans des modèles translationnels qui apportent les informations pharmacocinétiques de molécules utiles au développement précliniques et non-cliniques. Les rats et les souris sont utilisés pour explorer les propriétés pharmacocinétiques des composés étudiés. Les deux espèces ont des capacités et des vitesses de métabolisation différentes. Les espèces souris et rats sont utilisées dans les études d’efficacité dans les modèles pathologiques, les informations de PK dans les deux espèces sont nécessaires. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes adultes à adultes ( rats de 250-300gr minimum et souris de 25gr), il ne sera pratiqué aucune expérience sur des animaux nouveaux-nés. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer nos modèles expérimentaux.
Évaluation des effets de Süvy sur la santé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
Pendant 24 semaines, une partie des souris subit chaque semaine une prise de sang et un jeûne de cinq heures pour mesurer la glycémie, ainsi qu'un test à l'insuline de 3 h 30 à jeun et, pour un second lot, un test de tolérance au glucose de six heures à jeun la semaine de la mise à mort. D'autres sont isolées pendant 18 h 30 à 22 heures et privées de nourriture pendant 15 h 30 à 19 heures, une fois par semaine sur cinq semaines au plus, ou gavées chaque jour pendant huit jours, et un régime hypercalorique doit en rendre certaines obèses, et une privation de nourriture doit imiter chez d'autres une anorexie. 6 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré, pour comparer aux sucres et édulcorants du marché un substitut breveté issu de fruits fermentés et de fibres, avec trois tests de l'attention et un test de comportement dont la nature n'est pas précisée. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, pour prélever leur appareil digestif, leur foie, leur rate, leurs reins, leur pancréas, leurs muscles, leur tissu adipeux, leurs dents et leur cerveau.
Objectifs
Le sucre, et plus particulièrement le saccharose, occupe une place centrale dans notre alimentation en raison de ses propriétés organoleptiques (goût sucré, texture…) et fonctionnelles (conservation, structure...). Toutefois, sa consommation excessive est associée à de nombreuses pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, l’obésité, les troubles du comportement alimentaire ou encore l’inflammation. Au-delà des impacts physiopathologiques, plusieurs études mettent en évidence un lien entre consommation excessive de sucre et troubles du comportement, en particulier chez les enfants. En effet, la consommation de sucre serait associée à des troubles de l’attention, de l’impulsivité, voire à une augmentation de l’agressivité. Face à ces enjeux de santé publique, la recherche de substituts sucrants plus sains devient essentielle. L’objectif est double : maintenir les caractéristiques sensorielles et fonctionnelles du sucre tout en réduisant son impact sur la santé. Dans ce contexte, un nouveau substitut de sucre, un complexe sucrant breveté issu de fruits fermentés et de fibres, apparait comme prometteur dans cet enjeu. Ce substitut présente une particularité majeure : il possède des propriétés physiques similaires à celles du sucre, ce qui lui permet de s’intégrer aisément dans les préparations culinaires classiques, tout en limitant l’impact sur la santé. Au-delà de ces propriétés, ce substitut de sucre suscite un intérêt croissant pour son potentiel à limiter les pics glycémiques postprandiaux. Il permettrait aussi de palier aux dysrégulations émotionnelles et cognitives induites par le sucre. Par ailleurs, sa faible valeur énergétique pourrait jouer un rôle dans le contrôle du poids corporel et des apports caloriques, éléments clés dans la lutte contre l’obésité. Ce projet, à l’interface entre nutrition, physiologie et comportement, a pour objectif de déterminer si le substitut de sucre représente une alternative crédible au sucre classique du point de vue de la santé à court et long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des connaissances sur les effets d’un substitut sucrant innovant. Les bénéfices attendus sont : scientifiques, sanitaires et sociétaux. 1-Avancées scientifiques : Ce projet permettra d’approfondir la compréhension des effets des substituts du sucre sur la régulation de la glycémie, la sécrétion d’insuline et les marqueurs d’inflammation de bas grade. Il explorera également les effets neurocomportementaux d’une consommation chronique ou aiguë de sucre et de ses substituts, notamment en ce qui concerne la concentration, l’impulsivité et les comportements agressifs. Par ailleurs, les mécanismes de régulation de la satiété feront l’objet d’une attention particulière, en lien avec la fermentation colique et la production d’acides gras à chaîne courte. Enfin, le rôle de ce substitut de sucre sera évalué dans des contextes de surconsommation alimentaire (modèle d’obésité) et de réalimentation après une phase de dénutrition (modèle post-anorexique). 2-Bénéfices sur la santé humaine : Les retombées potentielles pour la santé sont significatives. Le bénéfice principal réside dans la réduction des risques associés à une consommation excessive de sucre, tels que le diabète de type 2, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et certaines dysrégulations neurocognitives. Une attention particulière sera portée à l’amélioration de la régulation des fonctions cognitives et émotionnelles, en lien avec les variations de neurotransmetteurs observées lors de la consommation de sucre chez certains individus sensibles. 3- Impact sur la santé publique : Ce projet répond à une demande croissante de la population et des acteurs de l’agroalimentaire pour des produits alimentaires à la fois plus sains et sensoriellement satisfaisants. Il pourrait ainsi contribuer à la formulation de nouvelles recommandations nutritionnelles et à la reformulation de produits à moindre impact métabolique. En apportant des données robustes sur les effets d’un substitut sucrant à faible index glycémique, ce projet ambitionne de participer à la transition vers une alimentation plus favorable à la santé métabolique et mentale, tout en préservant le plaisir alimentaire.
Procédures
Procédure 1 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 24 fois) et durera 1 min. - Le test de l’attention sera réalisé 3 fois par souris et durera 30 à 40 min - Le test de comportement sera réalisé 1 fois par souris et durera 23min divisé en 3 sessions sur 2 jours. - le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par groupe et durera 3h30 (à jeun) - le test de tolérance au glucose sera réalisé 1 fois par souris (sur un second lot) la semaine de la mise à mort et durera 6h (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 2 : -La période de jeun durera entre 15h30 et 19h selon la phase. -La période d’isolement durera entre 18h30 et 22h selon la phase -Le prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par phase (1 par semaine) soit 5 fois maximum durera 1 min. -Le gavage sera réalisé 1 fois par phase (1 par semaine) soit 5 fois maximum, et durera 2 min. Procédure 3 : -Le gavage sera réalisé 1 fois par jour pendant 8 jours soit 8 fois et durera 2 min. -L’injection sera réalisé 1 fois par souris et durera 2 min. -Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 4 fois), et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) Procédure 4 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. -Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 4 fois) et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 5 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 24 fois) et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 6 : - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 24 fois) et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun)
Impact sur les animaux
Les techniques de contention et l'administration de substances peuvent induire un stress significatif chez la souris. En particulier, l'administration sous-cutanée ou par gavage, ainsi que les prélèvements sanguins, peuvent être traumatisants si effectués par du personnel insuffisamment expérimenté, entraînant des complications telles que des hématomes ou une administration incorrecte, comme dans la trachée au lieu de l'estomac. Les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger. Les souris devront être isolées, or l’isolement social peut causer du stress et de l’anxiété chez les souris, qui sont des animaux sociaux par nature. Un régime hyper calorique sera administré aux souris afin de mimer une obésité, leur prise de poids va entraîner une réduction de leur mobilité, ce qui pourrait provoquer un inconfort. Une privation de nourriture sera mise en place afin de mimer une anorexie chez les animaux, une perte de poids trop élevée entraînera une sortie des animaux de l’étude. Les périodes de jeûne pourraient provoquer un stress et un inconfort modérés. Les pesées réalisées plusieurs fois par semaine pourraient générer un stress léger.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet de la consommation de ce substitut de sucre. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins, le pancréas, les muscles, le tissu adipeux, les dents et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.
Remplacement
À ce jour, il n’existe pas d’alternative aux tests sur les animaux qui permette de comprendre de manière fiable et complète comment ce substitut de sucre agit sur l’ensemble du corps. Les méthodes en laboratoire (sur cellules ou par modélisation informatique) ne suffisent pas à reproduire la complexité des réactions de notre organisme, notamment en ce qui concerne le métabolisme, la satiété, l’inflammation ou encore le comportement alimentaire. C’est pourquoi les études sur l’animal, en particulier la souris, restent nécessaires. Elles permettent d’observer comment ce substitut de sucre influence la sensation de satiété, la régulation du sucre dans le sang, les réponses inflammatoires et ses effets dans des situations comme l’obésité ou l’anorexie. L’utilisation de la souris offre une vision globale et sur la durée, ce qui est essentiel pour mener à bien ce projet de recherche dans un cadre scientifiquement pertinent.
Réduction
Cette étude, qui s’étalera sur cinq ans, vise à mieux comprendre les effets du substitut de sucre en le comparant aux sucres et édulcorants déjà disponibles sur le marché. Elle prendra en compte les différences entre les sexes en étudiant ses effets à la fois chez les mâles et les femelles, car le métabolisme peut varier selon le genre. Pour évaluer les effets d’une consommation prolongée, un grand nombre de souris est nécessaire. Certaines seront analysées à différentes étapes de l’étude afin de détecter, le cas échéant, des effets sur des organes comme le foie, les reins ou les intestins. Toutefois, si aucun impact n’est observé après 24 semaines chez un premier groupe de souris, les autres groupes ne seront pas utilisés. Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables : 20 souris par groupe permettront notamment de tester la réponse du corps au sucre (tolérance au glucose et à l’insuline).
Raffinement
Les souris seront logées en groupes de quatre ou cinq dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles animaux largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de leur similitude biologique avec l'homme. Elles ont des systèmes digestifs, hormonaux et métaboliques assez proches de ceux de l’homme, ce qui permet d'étudier les effets physiopathologiques des aliments, tels que les substituts de sucre. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces. Nous allons utiliser des souris de 8 semaines afin de regarder l’impact de la prise du substitut de sucre au cours de la vie adulte.
Pré-etude dans le cadre d’une mise au point d’un capteur embarqué pour mesurer le transit instestinal chez le porc
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
Trois porcs femelles vont être anesthésiés dix heures d'affilée, puis tués sans reprise de conscience. Douze heures de mise à jeun précèdent l'intervention. Chaque animal reçoit un cathéter veineux à l'oreille, un cathéter vésical transpubien, une capsule électronique poussée jusqu'au bulbe duodénal par endoscope souple et une sonde de manométrie, avant quatre passages au scanner X dont un post-mortem suivi d'une autopsie. Le dispositif testé, une capsule de 1,2 sur 0,8 cm, vise à mesurer la vitesse du transit digestif chez des patients humains, et le porteur avance qu'il permettrait à terme de s'affranchir d'animaux non-humains opérés, tout en affirmant que le recours à l'animal est ici rendu "nécessaire" parce que rien ne peut être reproduit in vitro ou in silico.
Objectifs
Ce projet constitue une étape dans le développement d’un dispositif autonome visant à mesurer en temps réel la vitesse du transit digestif chez le patient humain, en utilisant le porc comme modèle translationnel. À terme, ce dispositif, basé sur l’ingestion d'un capteur miniature (capsule de 1,2 × 0,8 cm), a pour vocation de détecter de manière non invasive des anomalies du transit susceptibles d’indiquer des pathologies digestives. Ce système est complémentaire d'une solution commerciale déjà existante, qui permet une visualisation digestive mais nécessite une interaction humaine pour définir des points de référence. Une fois validée, cette nouvelle technologie pourrait également être utilisée chez le porc dans un contexte expérimental (études de nutrition) ou clinique. L’objectif spécifique de l’étude proposée est d’évaluer la capacité de cette technologie in vivo. La première étape expérimentale consistera à valider le franchissement du torus pyloricus, barrière anatomique spécifique du porc, avant de suivre le déplacement de la capsule dans les segments intestinaux situés en aval du pylore par scanner X, pendant une durée maximale de 10 heures.
Bénéfices attendus
Évaluer in vivo la capacité du dispositif à être localisé en temps réel dans le tube digestif d’un modèle translationnel de taille adaptée à un scanner X. Au-delà des applications en santé humaine, ces nouveaux dispositifs pourraient, à terme, permettre de s’affranchir de l’utilisation d’animaux opérés et/ou de marqueurs indigestibles pour la mesure du transit digestif.
Procédures
Le projet prévoit l’utilisation de trois porcs femelles. Chaque animal sera soumis à une procédure unique, non répétée, d’une durée maximale de 22 heures, incluant 12 heures de mise à jeun (solides uniquement) suivies de 10 heures d’anesthésie générale continue sans réveil. L’anesthésie est induite par isoflurane au masque. Elle est ensuite maintenue par perfusion de propofol en contrôle de concentration cible. Les dispositifs suivants sont mis en place : - Cathéter veineux auriculaire (pour propofol, solutés, érythromycine si besoin) - Cathéter vésical transpubien sous échoguidage (pour assurer une diurèse appropriée) - Insertion d’une capsule électronique dans le bulbe duodénal par les voies naturelles, à l’aide d’un endoscope souple - Insertion d’une sonde de manométrie pour enregistrer les contractions gastriques et duodénales Quatre examens d’imagerie (scanner X) sont réalisés : un examen initial (franchissement pylorique), deux examens intermédiaires (suivi du transit) et un post-mortem (localisation finale), suivi d’une autopsie. Aucune reprise de conscience n’est prévue. L’euthanasie est pratiquée sous anesthésie profonde par injection intraveineuse de T61.
Impact sur les animaux
Le projet sera réalisé en veillant à ce qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. L’ensemble du protocole se déroulera sous anesthésie générale, avec un monitoring complet garantissant l’absence de douleur et l’absence de retour à l’état de conscience. Jeûne préalable (solide uniquement) : ce jeûne peut induire une sensation de faim susceptible de générer un inconfort temporaire. Ce risque est toutefois atténué par l’absence de jeûne hydrique. Induction et maintien de l’anesthésie générale : des effets indésirables potentiels liés à l’isoflurane et au propofol sont possibles (hypotension, hypothermie, bradycardie, dépression respiratoire). De plus, l’intubation trachéale comporte des risques d’irritation locale et de microtraumatismes des voies respiratoires. Position en décubitus ventral prolongé : malgré l’anesthésie et la surveillance, il existe un risque d’hypoventilation, d’hypoxie ou de compression des organes. Insertion des dispositifs (endoscope, sonde manométrique) : peut provoquer une irritation muqueuse ou une stimulation mécanique locale. Ces effets indésirables sont identifiables et surtout quantifiables avec les méthodes de monitoring proposées. Les solutions pour les combattre sont précisées dans le paragraphe "déroulé du projet".
Devenir
Le projet implique des procédures expérimentales lourdes, nécessitant une anesthésie générale continue de longue durée (jusqu’à 10 heures), sans interruption, ni reprise de conscience. Le sort prévu est donc l’euthanasie en fin de procédure, sans réveil.
Remplacement
Le recours à l'animal est rendu nécessaire car il s'agit de suivre le déplacement d'une capsule à visée médicale dans le tube digestif. Le déplacement de la capsule est assurée par la mobilité du tube digestif. A ce stade des travaux, cette étude ne peut pas être reproduite in vitro ou in cilico
Réduction
Le nombre d’animaux est limité à trois porcs, défini comme strictement nécessaire pour valider la faisabilité technique du protocole (franchissement pylorique, maintien du transit, imagerie). Le protocole est conçu comme une étude exploratoire, préalable à d’éventuelles études fonctionnelles. Les données issues de cette phase permettront d’optimiser les paramètres techniques et d’éviter l’utilisation ultérieure d’animaux inutiles. Chaque animal fera l’objet d’un suivi complet multiparamétrique (capsule, manométrie, imagerie), maximisant les données récoltées par individu.
Raffinement
Dans une situation où l’un des deux points limites suivants serait atteint - échec du positionnement de la capsule en raison de l’impossibilité de la placer dans le bulbe duodénal par voie naturelle, ou déséquilibre anesthésique incontrôlable entraînant des réponses incompatibles avec la stabilité physiologique nécessaire à la poursuite de la procédure-, l’essai serait immédiatement interrompu pour les animaux concernés.
Choix des espèces
Le porc est connu pour être une espèce modèle pour l'homme. Il reste un animal proche de l’Homme, avec de grandes similitudes anatomiques et physiologiques notamment pour le tube digestif Nous utiliserons des porcs conventionnels de 60 - 70 kg, car ce sont les animaux les plus couramment utilisés comme modèle de l’homme pour l’étude de la physiologie digestive.
Etude de l’efficacité de composés pharmaceutiques dans un modèle de lésion rénale aigüe (AKI) induite par injection de Lipopolysaccharide de Escherichia Coli chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide d'Escherichia coli déclenche chez elles une réaction inflammatoire simulant une infection généralisée et une atteinte rénale aiguë, puis elles reçoivent une ou deux administrations du composé à tester avant un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. L'étude s'arrête à vingt-quatre heures, une limite que le porteur présente comme une mesure de raffinement, et les souris sont ensuite tuées pour prélever sang et organes. Une société privée cherche par là à trier rapidement ses molécules avant des modèles chroniques puis d'éventuels essais chez l'humain, et affirme que les interactions entre cellules inflammatoires et rein ne peuvent pas encore être reproduites in vitro.
Objectifs
Notre société développe des inhibiteurs des molécules spécifiques afin de limiter le stress oxydatif impliqué dans des processus de douleur et d’inflammation. Nous souhaitons utiliser un modèle in vivo aigu pour avoir une évaluation rapide de l’efficacité de nos molécules dans un modèle de pathologie rénale aigüe. Ce modèle pathologique induit avec une molécule bactérienne, est déjà utilisé par de nombreux laboratoires dont le nôtre, et se rapproche fortement, de par les cytokines sécrétées, du phénomène inflammatoire observé chez l’Homme lors d’insuffisance rénale aigüe. Des groupes travaillant sur ce modèle ont fait un lien avec une production excessive d’espèces réactives de l’oxygène, provoquée et maintenue par une réponse inflammatoire aigüe due à nos molécules cibles. De plus, en interne, ce modèle nous donne des résultats intéressants pour l’évaluation de nos composés et nous souhaitons continuer à l’utiliser pour valider rapidement l’efficacité de nos molécules au niveau rénal.
Bénéfices attendus
L’incidence des maladies rénales au sein de la population augmente. Cela s’explique par le vieillissement de la population mais aussi par le développement de thérapeutiques et/ou méthodes de diagnostic avec un risque d’atteinte rénale. Malheureusement, la mortalité associée à ces pathologies reste très haute. En effet, le traitement des maladies rénales reste limité (dialyse, greffe..) et très contraignant pour les patients. Les résultats attendus dans ce modèle nous permettraient d’identifier rapidement les molécules avec le meilleur potentiel thérapeutique. Ces molécules pourront alors être testées dans des modèles de maladies rénales chroniques et pourraient par la suite être incluses dans le processus de développement pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Après l'induction de la pathologie par une injection intrapéritonéale (20 secondes), les animaux seront traités (20 secondes à 1 minute maximum) avec nos composés ou le véhicule, 1 à 2 fois maximum dans l'étude. Les volumes administrés seront adaptés en fonction du poids de l’animal. Les études durant 24h, une seule pesée sera faite avant traitement et les animaux seront observés à la recherche de potentiels effets cliniques. A la fin de l’étude, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (2 minutes). Il est possible, mais pas systématique, qu'un premier prélèvement sanguin soit réalisé dans les mêmes conditions avant la fin de l'étude. Les animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil après le prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
L’injection de la molécule bactérienne a pour effet la simulation d’une infection. Afin de s’assurer qu’ils ne présentent pas de modification du comportement lié à une infection généralisée, ces derniers seront surveillés à chaque manipulation, et plus étroitement dans les premières heures après l’induction. La douce contention des animaux nécessaire pour la pesée et le traitement, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress et un inconfort. Malgré la très bonne formation du personnel technique, les administrations et prélèvements entrainent une douleur légère mais de courte durée. Ils pourraient dans de rares cas entrainer d’autres conséquences (par exemples : hématome, douleur modérée). Les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements de sang et d'organes afin de contrôler l’évolution de paramètres biochimiques et histologiques.
Remplacement
L’intérêt de ce projet est d’étudier l’effet d'un composé pharmaceutique sur le rein dans un contexte de maladie qui le détruit, l’insuffisance rénale aigüe. Les différentes cellules du système inflammatoire vont interagir avec plusieurs organes, notamment le rein. Malheureusement, l'ensemble de ces interactions ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo est nécessaire. Le ou les mécanismes systémiques qui sont impliqués dans le devenir de la molécule in vivo ne sont pas reproductibles in vitro mais nécessaires à l’évaluation des composés. Nous ne pouvons alors pas utiliser à ce stade de modèle in vitro pertinent.
Réduction
Ce modèle a déjà été utilisé au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leurs mécanismes d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Seules les molécules présentant une activité sur les tests cellulaires sans toxicité apparente et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Les données in vitro des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Les effectifs choisis nous permettront une optimisation de l’interprétation de tests statistiques.
Raffinement
Le modèle sera plafonné à 24h, pour limiter l’impact de l'inducteur et de ses conséquences inflammatoires sur les animaux et les organes cibles. Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge ou tunnel en carton pour se cacher, bois à ronger… La formation du personnel, le matériel utilisé et l’adaptation des volumes administrés permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Comme décrit dans la littérature, la souris est le modèle animal le plus utilisé pour étudier l’insuffisance rénale aigüe. Comme la mise en place de ce modèle nous a donné des résultats satisfaisant ces dernières années, nous continuerons a utiliser le modèle avec les souris, le plus approprié dans nos projets car elles peuvent développer plusieurs signes physiopathologiques caractéristiques de l’insuffisance rénale aigüe tels que la dysfonction endothéliale, la mort des cellules épithéliales ou encore l’infiltration des cellules immunitaires. De plus, les souris sont les espèces dont les manifestations inflammatoires sont les plus connues et se rapprochent le plus de celles de l’Homme. Il n’y a pas d’indication spécifique sur le choix de l’âge autre qu’une maturité immunitaire. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines.
Etude dose-réponse d’une nouvelle thérapeutique pour le traitement des carences en fer nutritionnelles
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
Pour montrer que des particules de fer permettraient de baisser les doses des traitements contre la carence martiale, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord privées de fer pendant six semaines jusqu'à l'installation d'une anémie, puis traitées pendant quatre semaines par voie orale ou sous-cutanée. Une goutte de sang est prélevée à l'aiguille dans leur queue deux fois par semaine pendant dix semaines. Les souris témoins restent anémiées sans traitement, avec la faiblesse musculaire et la baisse d'activité que le porteur décrit, et l'effectif de 144 animaux n'est appuyé par aucun calcul statistique, le porteur qualifiant l'étude d'exploratoire.
Objectifs
La carence en fer est le résultat de toute condition dans laquelle l’apport alimentaire en fer ne répond pas aux besoins de l’organisme. C’est un problème de santé publique touchant environ 1,5 milliards d’individus dans le monde, principalement les enfants ou les femmes enceintes, bien que les hommes soient également touchés. Le déficit en fer est responsable de multiples conséquences comme la fatigue chronique, les essoufflements, les palpitations, une tachycardie, un retard de développement psychomoteur, des défauts cognitifs, et une anémie. Les traitements actuels de la carence en fer sont essentiellement à base de fer ferreux par voir orale et nécessitent l’utilisation de doses importantes en fer car les sels ferreux sont faiblement absorbés (entre 10 à 15% de la dose ingérée). Ces fortes doses entrainent d’importants effets secondaires gastro-intestinaux. Dans ce projet, des petites particules contenant du fer seront utilisés pour réduire les doses de fer et engendrer moins d’effets secondaires dans un modèle de souris soumis à un régime carencé en fer pendant 6 semaines. Une fois l’anémie établie, les souris recevront, dans un premier temps, un traitement oral à base de petite particules contenant du fer ou de fer ferreux durant 4 semaines maximum. Dans un second temps, et seulement dans le cas d’une absence de résultats pour le traitement oral, d’autres souris recevront un traitement par voie sous-cutanée de petite particules contenant du fer ou de fer ferreux durant 4 semaines maximum.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait démontrer que le traitement à base de petites particules contenant du fer, mieux absorbé par l’organisme, permettra de réduire les doses en fer administrées. Ainsi, en clinique humaine, cela conduirait à réduire les effets secondaires, principalement intestinaux, en comparaison du traitement classique.
Procédures
Une ponction d’une goutte de sang (qq sec) à la queue est réalisée 2 fois par semaine par aiguille chez l'ensemble des souris pendant 10 semaines pour permettre de contrôler le paramètre sanguin hémoglobine et suivre l'évolution du bilan en fer.
Impact sur les animaux
Les souris carencées en fer ne recevant aucun traitement montreront une anémie modérée pouvant être responsable d’une faiblesse musculaire et d’une baisse de l’activité générale. Dans le cas des souris traitées par fer ferreux (médicament de référence à fortes doses), des effets secondaires principalement intestinaux (diarrhée, ou constipationavec possibilité d'apparition d'un bouchon anal dues respectivement à une inflammation des intestins ou au ralentissement du transit, variables en fonctions des individus) peuvent apparaître au cours du traitement (une grille de scoring a été déterminée pour évaluer de façon précises ces effets secondaires intestinaux). L'apparition d'un inconfort ou d'un stress lié au gavage, à l'injection quotidienne ou le prélèvement sanguin pourrait être observé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, toutes les souris de l'étude seront anesthésiées et mises à mort dans le but de récupérer le sang et les organes pour des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
En parallèle de ce projet, des analyses encore en cours sont réalisées sur des cellules hépatiques et intestinales humaines. Cependant, le projet porte sur la restauration physiologique du métabolisme du fer et l’amélioration des paramètres sanguins en fonction de la réponse au traitement. L’anémie est un syndrome global qui ne peut être étudié de façon complète que sur des animaux avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes (principalement le lien sang, foie et moelle osseuse). C’est pourquoi, il est essentiel d'observer l'effet d'un traitement pharmacologique (dose et impact sur les effets secondaires intestinaux) sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre de souris utilisées par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour une étude exploratoire. L’étude prévoit 6 souris par groupe avec 3 mâles et 3 femelles réparties, dans un premier temps, en 12 groupes d'études, soit un total de 72 souris destinées à l'étude dose-réponse par administration orale. Dans un second temps, et dans le cas où aucun effet par voie orale ne serait observé, 12 autres groupes, soit un total de 72 autres souris seront destinées à l’étude dose-réponse par administration sous-cutanée. Un maximum de 144 souris au total sera utilisé dans ce projet. Ce projet mettant en oeuvre une étude à viser exploratoire, aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Dès la réception des souris, une période d’acclimatation de 7 jours sur le site d’accueil sera respectée. Tout au long du déroulement des expérimentations, l’état clinique global des souris sera observée quotidiennement pour anticiper et éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable par la SBEA et permettant la mise en place de mesures pour diminuer ou supprimer la douleur des souris de l’étude. Une arbre décisionnel est mis en place de la cas d'observations de points limites liés (1) à l'anémie, (2) au traitement et/ou (3) à la perte de poids et ceci en allant de l'arrêt partiel du traitement, la diminution des doses administrées, à la programmation de la mise à mort de l'animal. Dans le cas des prélèvements sanguins, la queue sera préalablement désinfectée à la chlorhexidine 0,05 % pour limiter tout risque d’infection. Une anesthésie locale à lidocaïne liquide avec action rapide sera effectuée pour limiter la douleur liée à la piqure d’aiguille. Une attention particulière sera portée au site de prélèvement en veillant à changer de site de prélèvement (en allant de l’extrémité de la queue à la base). Un point de compression sera effectué ensuite pour stopper un éventuel écoulement sanguin. Une surveillance accrue de site de prélèvement sera effectuée les jours suivants.
Choix des espèces
La souris a été choisi pour cette étude pour sa disponibilité, sa facilité d’utilisation. Elles sont généralement utilisées dans le cas des carences nutritionnelles en fer permettant d’avoir des paramètres connus du métabolisme du fer de ces souris. Les souris de l’étude seront âgés de 6 semaines. La carence en fer nutritionnelle est un déficit observé à généralement à l’âge adulte. C’est pourquoi, la mise en place de la carence nutritionnelle et le traitement seront effectués chez des souris adultes.
Gestion de la production d’une lignée de rats modèles de la myopathie myotubulaire à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Produire et génotyper des rats porteurs d'une myopathie myotubulaire, pour alimenter d'autres projets du laboratoire : 3000 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2250 d'entre eux et modéré pour 750. L'acte infligé se limite à un prélèvement de tissu de la queue sur animal vigile, en même temps que l'identification, une seule fois dans leur vie et en moins de deux minutes. La part modérée vient de la maladie elle-même, une faiblesse musculaire et une atteinte locomotrice que la lignée reproduit, et le porteur indique tuer les animaux avant l'apparition des symptômes quand aucun projet ne les attend. Les autres sont gardés en vie pour la reproduction ou une utilisation continue. Les 600 rats par an annoncés reposent sur l'historique de production de l'établissement, et le porteur ajoute que ce chiffre pourra évoluer selon de nouvelles orientations scientifiques.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux afin de maintenir une souche de rats génétiquement altérée nécessaire à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie de la myopathie myotubulaire dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour une maladie génétique humaine grave, rare et orpheline de médicaments à partir d'un modèle murin mimant cette maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de myopathie myotubulaire.
Procédures
Les prélèvements de tissus de queue se font sur animaux vigiles. Cet acte se fait en même temps que l'identification individuelle des animaux et n’est pratiqué qu’une seule fois au cours de la vie des animaux. Au total, moins de 2 minutes sont nécessaires pour réaliser ce double geste. A considérer comme étant de gravité légère.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu (queue) sur jeunes animaux vigiles. La contention d’animaux jeunes peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs de la pathologie étudiée dans notre laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux ou gardé en vie pour la reproduction ou une utilisation continue.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont et en parallèle de ce projet. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions scientifiques dans des modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études scientifiques ne se fait que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions. Par exemple lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des maladies neuromusculaires, ou la distribution d’un traitement dans l’ensemble d’un organisme.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 3000 rats pour satisfaire les besoins de l'ensemble des études pour les 5 années à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 600 rats par année pour la lignée de rat objet de ce dossier, soit un total de 3000 rats sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.
Raffinement
Dans ce projet, les rats mimant la myopathie myotubulaire seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (igloo en cellulose, bâtonnets de bois pour ronger, éléments pour la confection des nids, copeaux, tunnel, etc. et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe (sexage). De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice, aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et apétant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour transférer les animaux d'une cage à l'autre lors du change des litières, les zootechniciens soulèvent délicatement les animaux par le corps et utilisent leurs des tubes-maisons pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l’identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie post-natale par prélèvement d’un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore différenciés.
Choix des espèces
Le rat a été choisi comme animal modèle car cet animal a pu être modifié génétiquement afin de présenter une altération génétique responsable de l’apparition de la myopathie myotubulaire qui est l'un des axes de recherche de notre Equipe de recherche. Ce modèle reproduit les signes cliniques et pathologiques de la maladie connue chez les patients, ce qui inclus une faiblesse musculaire et une insuffisance respiratoire. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce afin de réaliser l’identification et le prélèvement pour génotypage (biopsie), et aux stades sexuellement matures pour la reproduction.
Evaluation de l’efficacité de substances pharmaceutiques administrées par voie orale à 2 doses sur la prévention et le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumis à une ulcération du côlon provoquée par l'introduction d'un agent chimique sous anesthésie, 64 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tandis que 16 rats témoins reçoivent une substance neutre dans les mêmes conditions. Les 80 rats sont mis à jeun douze heures avant l'induction, puis gavés quotidiennement pendant six ou vingt et un jours, et tous sont tués pour prélever leur côlon. Le porteur écrit qu'aucun traitement antidouleur ne pourra leur être administré, puisqu'il interférerait avec l'évaluation des deux substances anti-inflammatoires testées. Il annonce un test comportemental de cinq minutes en fin de protocole pour mesurer la douleur ressentie, sans préciser lequel ni quels paramètres y sont relevés.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de 2 substances pharmaceutiques ayant des propriétés anti-inflammatoires et antalgiques, administrées par voie orale à 2 doses en traitement préventif pour l’une, et en traitement curatif pour l’autre, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 substances pharmaceutiques à 2 doses différentes, l’une en traitement préventif et l’autre en traitement curatif, chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements préventifs et curatifs avec ces 2 substances pharmaceutiques sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une et ou l’autre de ces 2 substances pharmaceutiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 80 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance chimique permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 64 des 80 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 16 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Avant ou après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les 2 substances pharmaceutiques à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 21 ou 6 jours sur les animaux éveillés, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps.
Devenir
A l’issue de chacune des 2 procédures expérimentales, les 80 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner ces 2 substances pharmaceutiques ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances pharmaceutiques sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental spécifique à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental pour chacune des 2 études en traitement préventif et curatif. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles avec un enrichissement adapté, et ils auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi régulier et/ou quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur de chaque substance pharmaceutique testée sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires des 2 substances pharmaceutiques qui seront testées, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique induit par l'agent chimique utilisé qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 à 9 semaines et d’un poids de 175-250 g à l’arrivée au laboratoire pour les 2 études à réaliser, correspondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative. Lors de l’induction de l’ulcération colique pour les 2 études à réaliser, tous les animaux auront ainsi le même âge, 9-10 semaines, et environ le même poids, 250-275 g, conditions expérimentales que nous avons validées sur ce modèle de colite ulcérative avec des rats de cet âge et de ce poids.
Traitement des cancers hépatobiliaires par le plasma froid atmosphérique dans des modèles murins immunocompétents et immunodéficients 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 8 640 reçoivent des cellules tumorales sous la peau du flanc et 2 160 se les font injecter dans le foie au cours d'une chirurgie abdominale, avant des séances de plasma froid appliqué directement sur la peau, jusqu'à sept fois dix minutes, qui peuvent l'assécher jusqu'à la nécrose. S'y ajoutent quatre à cinq imageries par animal et deux à trois prises de sang. Le porteur écrit qu'on peut "raisonnablement espérer" une régression des tumeurs, affirme qu'il est impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier", et indique développer en parallèle des modèles en trois dimensions pour réduire le nombre de souris.
Objectifs
Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.
Procédures
- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.
Choix des espèces
Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.
Role du récepteur MRGPRE dans la physiologie et la physiopathologie de la douleur inflammatoire somatique et intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Incision chirurgicale de la patte, injection d'une solution inflammatoire sous la voûte plantaire, implantation d'électrodes puis distension du côlon par un ballon gonflable, l'animal maintenu une heure dans un tube de contention : 4 032 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dont 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit d'établir le rôle d'un récepteur dont la fonction reste inconnue dans la douleur et l'inflammation intestinales. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou saignent abondamment dans leurs selles sont retirées et tuées. Le porteur qualifie de "peu invasifs" les protocoles de mesure du transit, qui comprennent l'introduction dans le côlon d'une bille de la taille d'une fèces.
Objectifs
Nous avons récemment identifié le récepteur MrgprE comme un récepteur orphelin exprimé à la fois par les neurones sensoriels, les neurones du système nerveux entérique, certaines cellules immunitaire et épithéliales intestinales chez la souris. La fonction de ce récepteur dans l'intestin et l’hypersensibilité somatique et viscérale reste inconnue que ce soit dans un contexte physiologique ou pathologique. L'objectif général de ce projet est donc d'étudier le rôle de MrgprE dans la physiologie, l'inflammation et la douleur somatique et intestinale (du fait de son expression dans le tractus digestif et les neurones sensitifs).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de découvrir la biologie d'un nouveau récepteur : MrgprE, et de décrypter son implication dans le processus de la douleur et de l'inflammation intestinale. La prise en charge de la douleur repose actuellement sur des médicaments qui ont des effets secondaires, notamment les dérivés des opioïdes qui induisent une habituation et une dépendance. Par conséquent, MrgprE pourrait constituer une cible pharmacologique intéressante pour remplacer les traitements actuels dela douleur mais aussi de l'inflammation intestinale.
Procédures
Les animaux seront smousi à: 1) Chrirurgie d'incision plantaire (5minutes par chirurgie) puis test d'hypersenibilité à 24h, 48 et 96h après opération 2) Injection intra plantaire sous cutanée de solution induisant l'inflammation sous anesthésie gazeuse (10 secondes par injection) puis test d'évaluation de l'hypersensibilité tous le jours pendant 4 jours. 3) Chirurgie d'implantation des électrodes (sous anesthésie et analgésie, délivré par voie intrapéritonéale, durée 2 secondes), durée de la chrirurgie d'envrion 20 minutes par souris. Hébergement en cage individuelle pendant trois jours après la chirurgie. Pour le test de comportement, les souris seront mises en contention dans des tubes et l'expérimentation durera 1 heure. 4) les souris seront gavées avec les différentes solutions de suivi du transit (temps de gavage de 5 secondes par souris), et l'insertion de la bille dans le colon se fera sous anethésie gazeuse et l'opération prendra 5 secondes. 5) L'injection des agonistes/antgonistes se fera en par voie intrapéritonéale et durera 2 secondes par injection.
Impact sur les animaux
- Les souris mutantes utilisées ne présentent à notre connaissance pas de défauts de comportement, ni de déficiences immunitaires ni de létalité à l’état basal. -Les protocoles utilisés pour évaluer les temps de transit sont peu invasifs (gavage ou introduction d'une bille de la taille d’une fèces dans le colon) et seront conduits par des personnes expérimentées. La manipulation pouvant cependant générer un stress pour les souris, elles seront dès que possible anesthésiées à l'isoflurane pour minimiser leur stress pendant les procédures. -Les modèles d’inflammation somatique (incision plantaire et solution d’activation de l’inflammation) causeront un stress et une douleur de la patte chez l’animal et peuvent occasionner une boiterie. De ce fait, pour chacun des modèles, l’état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage) et le poids seront suivit quotidiennement. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, absence de toilettage, absence d'interactions), il sera écarté de l'expérience et euthanasié pour minimiser ses souffrances. -L'induction de l'inflammation colique par la solution d’activation de l’inflammation et la chirurgie causeront un stress chez l'animal. Celui-ci sera cependant suivit quotidiennement pour évaluer son état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage), son poids, ainsi que la consistance de ses féces et la présence de sang dans les selles. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, absence de toilettage, absence d'interactions), ou qu'il présente des saignements abondant dans les selles (nettement visible à l'œil nu), il sera écarté de l'expérience et euthanasié pour minimiser ses souffrances. - Lors de la chirurgie nécessaire à l'implantation des électrodes pour la mesure de la sensibilité viscérale, les animaux pourront décéder suite à l'anesthésie ou à la chirurgie. Suite à la chirurgie, les animaux pourront avoir une perte de poids et de la douleur. Lors de la distension colorectale, les animaux pourront être sujet à un stress dû à la contention de l'animal dans un tube, à la mise en place de la sonde et au gonflement du ballon. L'animal pourra aussi ressentir de la douleur viscérale lors de l'expérimentation.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l'effet du récepteur MrgprE sur l’inflammation et la douleur somatique et intestinale chez la souris. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de la diversité des interactions étudiées dans le contexte de ce projet. Devant la complexité de ces phénomènes, due notamment à l’implication de différents organes et types cellulaires, le recours aux modèles animaux est indispensable. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier le rôle du récepteur MrgprE sur les phénomènes étudiés.
Réduction
Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. Les croisements des souris, notamment les croisements incluant des souris Cre, seront réalisés de telle façon que toute la descendance soit utilisée lors des manipulations (contrôle et animaux d’intérêt issu de la même portée). Le nombre d'animaux (12 souris par groupe) a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Nous avons déterminé le nombre d'animaux par lot en utilisant une analyse de puissance statistique.. Cela nous a permis de déterminer qu'un minimum de 12 animaux par lot est nécessaire pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux, en raison de la variabilité inter-individuelle présente dans les différents modèles utilisés.
Raffinement
Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cages en portoir ventilé dans un environnement contrôlé . L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lors de la procédure chirurgicale nécessaire pour mesurer la sensibilité viscérale des souris, un mélange de produits analgésiants et anesthésiants sera utilisé comme anesthésie et le souris seront mise sur tapis chauffant pendant la procédure chirurgicale. Un anti-inflammatoire sera utilisée comme analgésique en phase post-opératoire. Tout au long de la vie des animaux, si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes (due aux altercations courantes chez les mâles) ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’inflammation et de la douleur ne sont pas développées à l’heure actuelle, du fait que la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à ce jour à reproduire in vitro dans leur intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’inflammation et la douleur qui représentent des problèmes de santé publique. Enfin, tous les animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont disponibles chez la souris et sont déjà dans le laboratoire. Les animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.
Importance de l’activité mitochondriale des hépatocytes dans la progression des pathologies du foie liées à un dysfonctionnnement métabolique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des souris de ce projet est opérée sous anesthésie générale et tuée avant tout réveil, pour que les cellules de leur foie soient isolées et mises en culture. 408 souris, mâles et femelles, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie. Les autres, réparties en trois lots, reçoivent pendant 16 semaines un régime riche en graisses, l'un d'eux conçu pour provoquer une inflammation et une légère fibrose du foie, avec selon les lots des tests métaboliques après six heures de jeûne, cinq à six prises de sang en deux heures et 72 heures en cage individuelle, pour vérifier chez les femelles la protection contre la stéatose observée chez des mâles privés d'une protéine des mitochondries du foie. Sur le remplacement, le porteur invoque "la règle des 3R" et cite ses cultures d'"hépatocytes primaires de souris", pour lesquelles il prévoit 4 groupes de 50 souris.
Objectifs
Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) débutent par la stéatose (une accumulation de graisse dans le foie) et peuvent progresser vers la stéato-hépatite (MASH) qui présente un état inflammatoire et un début de fibrose au niveau du tissu hépatique, et ce jusqu’à la fibrose/cirhhose. Au-delà des dysfonctionnements métaboliques du foie, ces pathologies sont également associées à la mortalité d’origine cardiovasculaire et à la survenue de carcinomes hépato-cellulaires. Il est donc important de comprendre les mécanismes qui amènent à leur progression. De nombreuses études soulignent un rôle de l’activité des mitochondries (organites intra-cellulaires entre autres responsables de la production d’énergie) dans le métabolisme du foie et dans la progression des MASLD. Mais la manière dont l’activité mitochondriale est potentiellement responsable de la progression des MASLD n’est pas clairement élucidée. Nous disposons d’un modèle dans lequel l’absence d’une protéine située au niveau de la membrane des mitochondries dans les hépatocytes de souris mâles a la capacité d’intensifier le processus de respiration mitochondriale couplée à la production d’énergie dans ces cellules et est corrélée avec une protection de ces animaux vis-à-vis de l’apparition d’une stéatose induite par un régime riche en graisse. Notre objectif est à présent de vérifier si ces résultats, initialement obtenus chez des mâles, peuvent également être confirmés chez des souris femelles, ce qui nous parait particulièrement important dans un contexte clinique où la survenue des MASLD a une fréquence différente en fonction du sexe des patients. Nous cherchons également à déterminer si une modulation de l’activité respiratoire mitochondriale, une fois la stéatose hépatique installée, a des vertus curatives, ce qui permettra d’envisager des voies thérapeutiques dans l’avenir. Enfin nous souhaitons déterminer si cette modulation de l’activité respiratoire mitochondriale a des vertus préventives également vis-à-vis de la progression de la stéatose en MASH. Enfin nous utiliserons des hépatocytes primaires en culture, afin d’élucider les mécanismes à l’origine des observations effectuées in vivo.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de notre protéine d'intérêt pour la fonction du foie. Ils permettront également de mettre en évidence des différences de réponses cellulaires entre mâles et femelles vis-à-vis de la progression des MASLD (maladies du foie liées à un dysfonctionnement métabolique), en particulier comment survient l’apparition d’un foie dit gras et comment cela peut évoluer en un foie inflammé et fibrosé . Nous résultats pourraient également permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant les mitochondries, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des maladies métaboliques et hépatiques chez les patients.
Procédures
Un premier lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle une moitié d’entre eux sera soumise à deux tests métaboliques pendant que l’autre moitié sera soumise à un test métabolique et à une mesure de la dépense énergétique. Les tests métaboliques sont tous précédés d’une mise à jeun de 6h et sont constitués d’une administration d’une solution (animal vigile, 5 sec, 1 fois), suivie de 5 à 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h. La mesure de la dépense énergétique implique un hébergement individuel temporaire (animal vigile, 72h). En fin de procédure, tous les animaux de ce premier lot seront soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois) pour la mesure de leurs paramètres biochimiques. Un second lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin (animal vigile, 30 sec, 1 fois), à une injection intra-veineuse (animal anesthésié, 30 sec, 1 fois), et à un hébergement individuel (animal vigile, 72h). En fin de procédure, chacun des animaux du lot sera soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Un troisième lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse capable d’induire une inflammation et une légère fibrose du foie (animal vigile, 16 semaines). Il sera également soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Enfin un quatrième lot d’animaux sera soumis à une procédure chirurgicale sans réveil (animaux sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois 20 min).
Impact sur les animaux
Les régimes spéciaux peuvent faire varier le poids des animaux ce qui peut induire une modification de leurs déplacements et de leur mobilité. Les challenges métaboliques impliquent une mise à jeun de 6h en période diurne (période où les animaux ne se nourrissent normalement pas) qui ne provoque en général pas d’hypoglycémie mais les administrations de solutions en lien avec les challenges métaboliques peuvent en elles-même être source d’hyper- et d’hypoglycémies transitoires. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections peuvent engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. L’hébergement individuel de courte durée pour la mesure de la dépense énergétique peut induire un stress chez les animaux. Les anesthésies comportent un risque de détresse respiratoire et d’arrêt cardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour des analyses post-mortem. Concernant les 3 premiers lots d’animaux, les foies entiers seront collectés et leur analyse nous permettra d’évaluer la santé du foie en réponse aux différents régimes alimentaires et aux traitements à visée curative. Concernant le quatrième lot, une procédure chirurgicale sans réveil, réalisée sous anesthésie et analgésie, nous permettra d’isoler les cellules du foie pour effectuer des analyses plus poussées sur le fonctionnement de ces cellules, en présence ou absence de notre protéine d’intérêt. Ces résultats complémentaires devraient nous permettre d’expliquer les différents états de santé du foie observés chez les animaux.
Remplacement
Selon la règle des 3R, la caractérisation de notre protéine d'intérêt a d’abord été réalisée in vitro et dans un modèle invertébré. Ces modèles n’étant pas basés sur des pathologies des grands systèmes chez l’humain, ils ne permettent pas d’étudier son importance in vivo. Certaines questions d'intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que nous réalisions des expériences sur les hépatocytes primaires de souris maintenus en culture, ainsi que l’exploration de certains mécanismes par simulation informatique, nous ne pouvons pas étudier la physiopathologie des maladies mitochondriales ex vivo car les phénomènes sont multifactoriels. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer in vivo au cours de plusieurs mois le développement des altérations pathologiques propres aux organes en question.
Réduction
408 animaux seront utilisés pour ce projet. L’utilisation de souris génétiquement modifiées permettra de démontrer l’importance hépatique de notre protéine d'intérêt et son rôle potentiel dans la progression des maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD pour metabolic-associated steatotic liver disease) à la fois chez les mâles et femelles. Pour chaque condition de régimes, des groupes de 8 à 10 souris seront créés afin d’obtenir une puissance satisfaisante à la fin de l’étude pour des résultats significatifs. Pour l’isolement d’hépatocytes et leur mise en culture, 4 groupes de 50 animaux seront nécessaires afin de reproduire de manière fiable une variété d’expériences en culture cellulaire.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventiles avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et sont habitués à être manipulés avec un suivi de poids hebdomadaire qui permet de s’assurer du bon état de santé des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Nous n’attendons l’apparition d’aucun signe clinique. En particulier, les régimes alimentaires, déjà testés par notre équipe, ont été développés en vue de circonvenir aux effets délétères des précédents régimes qui engendraient d’importantes pertes de poids chez les animaux. Néanmoins, nous veillerons à détecter les premiers signes de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité qui pourraient être induits : respiratoire, abattement, perte de poids, dysfonctionnement hépatique. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les prélèvements sanguins et les injections seront réalisés sous anesthésie locale ou générale. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie/analgésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à deux considérations : 1) tous les gènes de la dynamique mitochondriale sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations. Les modèles murins proposés présentent plusieurs avantages notamment la possibilité d’étudier le fonctionnement du foie dans un contexte physiologique où il communique avec tous les organes ainsi que d’étudier la réponse du foie et de l’organisme aux stress hépatiques comme la fibrose hépatique dans le cadre des MASLD (maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique) et le diabète. Les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l’âge adulte de 8-10 semaines pour ne pas interférer avec leur développement.