Troubles gastrointestinaux

40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à la fin sous une anesthésie sans réveil pour analyse histologique du trajet fistuleux. Chacun subit une chirurgie d'une heure et quart combinant une opération anti-obésité et la création d'une fistule entre l'estomac et la peau, puis une seconde intervention où un patch d'un centimètre carré est suturé sur l'ouverture, puis une IRM. Le porteur annonce des douleurs temporaires, une perte de poids et un risque d'infection au point de suture, tout en écrivant que les animaux ne souffrent généralement pas de douleurs persistantes après la chirurgie. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle alternatif satisfaisant et que ces tests sur des animaux non-humains sont "indispensables" à une éventuelle application chez l'humain, l'étape suivante annoncée restant une étude pilote conditionnée aux résultats.

Objectifs

Les fistules digestives sont des complications graves qui surviennent lorsqu’un passage anormal se forme entre deux organes internes ou entre un organe et la peau. Ces problèmes peuvent être causés par des maladies comme la maladie de Crohn ou des interventions chirurgicales, notamment les opérations pour traiter l’obésité. Par exemple, en France, 35 000 sleeves (chirurgie de l’obésité) sont réalisées chaque année, et dans 1 à 3 % des cas, des fistules peuvent se développer. Dans 20 % de ces cas, les fistules deviennent chroniques et difficiles à soigner. Le traitement des fistules est complexe : il peut inclure des soins locaux, un drainage, et parfois une nouvelle opération, souvent risquée et associée à un taux de mortalité élevé. Des recherches récentes explorent une solution prometteuse : la gelée de Wharton. Ce matériau, issu de cordons ombilicaux humains, possède des propriétés uniques qui favorisent la régénération des tissus et réduisent l’inflammation. Notre équipe travaille à développer un nouveau traitement combinant la gelée de Wharton et une matrice spéciale dérivée d’œsophage de porc, afin de favoriser la cicatrisation des fistules. La matrice, un support biologique préparé à partir de tissus animaux, est enrichie avec la gelée de Wharton pour être appliquée directement sur la fistule. Ce processus est soigneusement testé dans des conditions de laboratoire avant de pouvoir être utilisé chez l’humain. Les tests actuels utilisent un modèle animal (chez le rat), car il est essentiel d’observer l’évolution de la cicatrisation sur une période prolongée, ce que les études sur des cellules isolées ne permettent pas. Objectifs : 1. Évaluer l’efficacité du traitement pour refermer les fistules chroniques. 2. Étudier comment la gelée de Wharton agit sur l’inflammation, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et la réparation des tissus. 3. Optimiser l’adhésion et la rétention de la gelée de Wharton sur la matrice utilisée. Nous espérons que ce traitement novateur permettra de soigner plus efficacement les fistules digestives post-opératoires. Si les résultats des tests sont concluants, une étude pilote chez l’humain pourra être envisagée. Grâce à ces avancées, notre objectif est d’offrir une alternative moins invasive et plus efficace pour traiter une complication souvent dramatique.

Bénéfices attendus

Nous voulons démontrer qu’il est possible d’utiliser un nouveau matériau, composé d’une matrice biologique enrichie en gelée de Wharton, pour traiter des fistules digestives chez le rat. Ce matériau devra être à la fois sûr (sans causer d’infections ou d’inflammations) et efficace pour favoriser la cicatrisation. Pour cela, nous vérifierons l’absence de complications grâce à des observations cliniques et radiologiques. L’efficacité sera mesurée en comparant le nombre de fistules guéries entre différents groupes de traitement. Ces tests chez l’animal sont indispensables pour une éventuelle application chez l’humain. Afin de rendre cette transition possible, toutes les étapes de fabrication respectent déjà les normes médicales en vigueur. Les fistules digestives sont des complications fréquentes, graves, et difficiles à soigner. Elles ont un impact majeur sur la qualité de vie, surtout lorsqu’elles deviennent chroniques. Les traitements actuels sont invasifs, nécessitent de longues hospitalisations et ne réussissent pas toujours à guérir les patients. Grâce à ce projet, nous espérons offrir une solution innovante, plus efficace et moins lourde, pour améliorer la prise en charge des personnes touchées par cette maladie.

Procédures

1. Une première opération d’une heure et quart sera réalisée sous anesthésie générale. Elle consistera à effectuer une chirurgie anti-obésité et à créer une fistule entre l’estomac et la peau. 2. Une deuxième intervention durant 15-30 minutes sera réalisée sous anesthésie générale. Un patch de 1 cm², issu du traitement innovant, sera suturé sur l’ouverture de la fistule au niveau de la peau. 3. Une phase concernant 3 rats comprendra une IRM supplémentaire visant à optimiser et valider le protocole d’IRM prévu en phase 4. 4. Enfin, une dernière phase sous anesthésie sans réveil permettra d’évaluer visuellement et avec une IRM si la fistule s’est refermée.

Impact sur les animaux

Les principales gênes attendues incluent des douleurs temporaires après l’opération pour créer la fistule, ainsi qu’une possible perte de poids liée à la chirurgie et à la fistule. Le traitement appliqué au jour 15 pourrait entraîner des infections locales ou des démangeaisons dues aux points de suture, mais les expériences précédentes montrent qu’après la chirurgie, les animaux ne souffrent généralement pas de douleurs persistantes.

Devenir

A la fin de la procédure, les rats seront euthanasiés dans une procédure d’anesthésie sans réveil pour analyse histologique du tractus fistuleux et des tissus environnants afin d’étudier les phénomènes de cicatrisation à l’échelle microscopique.

Remplacement

Les fistules mettent plusieurs semaines à se former, et leur cicatrisation ne peut être observée qu’après un mois de traitement. Cela ne peut pas être étudié en dehors d’un organisme vivant. Actuellement, il n’existe pas de modèle alternatif satisfaisant pour remplacer les expériences sur les animaux. Cette recherche vise à développer un traitement qui pourra, à terme, être utilisé chez l’humain, car les options actuelles sont insuffisantes. Le rat est un modèle pertinent pour ce type d’étude : sa biologie tissulaire et ses réactions immunitaires et inflammatoires sont proches de celles de l’homme, comme le confirment des études scientifiques. Cela permet de prédire les résultats humains de manière fiable et d’étudier la biocompatibilité des matériaux utilisés.

Réduction

Pour analyser les résultats : Nous utiliserons un test statistique pour comparer les groupes d’animaux selon la fermeture ou non des fistules et un autre pour mesurer les différences sur les données continues. L’étude inclura 4 groupes de 9 rats chacun, avec un rat supplémentaire par groupe pour compenser d’éventuels décès ou problèmes techniques. Ce nombre est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Nos calculs sont basés sur une étude précédente, qui a utilisé un modèle similaire. Le taux de fermeture des fistules y était de 82,5 % avec traitement, contre 12,5 % sans traitement. Les calculs statistiques ont été réalisés avec un logiciel dédié (G*POWER), en fixant une puissance de 80 % et un risque d’erreur de 5 %. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés (principe des 3R), la procédure sera réalisée par des experts en microchirurgie. Un membre de notre équipe, spécialiste des chirurgies digestives chez le rat, supervisera ces opérations.

Raffinement

- Du personnel qualifié, dont un chirurgien expérimenté, sera mobilisé avant, pendant et après les interventions. - Les rats s’habitueront à leur environnement pendant 7 jours avant l’opération. - Les animaux seront logés en cages ventilées et stérilisées, avec un accès normal à l’eau, à la nourriture et à des enrichissements (nidification, maison en cas d’isolement). - L’environnement est conçu pour préserver leur bien-être : aucun stress visuel, sonore ou olfactif entre les rats opérés et ceux à opérer. - Les animaux recevront des analgésiques avant et après la chirurgie (tramadol, carprofène). - Des protocoles précis encadrent l’anesthésie, les soins post-opératoires et, si nécessaire, l’euthanasie pour minimiser toute souffrance. - Des limites éthiques strictes seront suivies tout au long du projet pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat Wistar car : -Son anatomie digestive est proche de celle de l’Homme, ce qui permet de reproduire la pathologie humaine. -Les modèles de rats avec fistules post-chirurgie gastro-œsophagienne sont validés et reconnus comme fiables pour les études précliniques. -L’équipe impliquée est experte dans la gestion et les soins des rats. -Ces rats sont facilement disponibles auprès d’éleveurs agréés. Caractéristiques des rats Wistar pour l’étude -Les rats seront tous âgés de 12 semaines, pour garantir des résultats comparables et des plaies proportionnelles à leur taille. Le choix de rats adultes réduit les risques liés à l’anesthésie et facilite les opérations chirurgicales. -À cet âge, la qualité des tissus permet une cicatrisation optimale.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trente-cinq gavages quotidiens sur cinq semaines et une prise de sang à la queue, avant d'être anesthésiée puis tuée par dislocation cervicale, son tube digestif étant prélevé pour un dosage d'ocytocine. Les composés testés appartiennent à un client du laboratoire, et le porteur reconnaît une "phase très précoce" de développement dont l'aboutissement commercial reste au conditionnel. Il indique avoir mené une première série d'essais sur cultures cellulaires, mais conclut qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier".

Objectifs

Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (10 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par voie orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) à un prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (1 prélèvement; durée: 5 minute/prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des pesées régulières ainsi qu'à des administrations de traitements par gavage pendant 5 semaines (1 semaines d'habituation et 4 semaines de traitement). Deux prélèvements sanguins seront pratiqués : l'un via la veine de la queue a D0 et l'autre par ponction cardiaque après euthanasie à D28. Enfin, au dernier jour de l'étude, les animaux seront anesthésiés par un mélange kétamine/xylazine avant dislocation cervicale immédiatement suivie d'une ponction cardiaque et du prélèvement du tube digestif. En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des administrations de substances (traitements et anesthésie). Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleur légère et transitoire qui ne nécessite pas de médication lors des administrations par gavage, et des prélèvements sanguins à D0.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le tyube digestif et de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.

Remplacement

Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3-4 animaux par cage) afin de satisfaire leurs besoins sociaux et auront accés à de l'eau et de la nourriture ad libitum. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique du composé, puis jusqu'à six prélèvements sanguins en une semaine, sous anesthésie gazeuse. L'objectif est de mesurer comment un candidat médicament se répartit dans l'organisme, pour choisir la molécule et la dose qui passeront ensuite en clinique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour ce type d'étude et que les modélisations in silico ne sont "pas encore abouties".

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés afin de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la pharmaceutique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme pharmaceitique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les administrations sront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la voie utilisée. Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique si besoin et sous anesthésie. 6 prélèvements maximum sont réalisés par animal sur une semaine (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Dans tous les cas l'inconfort ou le stress, si observé, sera de très courte durée, inférieur à 1 min. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets indésirables suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration. Si ces signes devaient néanmoins survenir ils seront de courte durée, inférieur à 1h.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de calculer un minimum de statistiques descriptives (moyenne, écart-type et coefficient de variation) sur les données obtenues, un minimum de 3 animaux par conditions (molécule, voie d’administration, dose, formulation, temps de prélèvement) est nécessaire. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des souris est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les souris à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix de la souris dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiques de cette tranche d'âge permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches en limitant le biais expérimental lié à l’âge.

Vingt-quatre gavages, deux séances de contention forcée de deux heures, un puçage, une prise de sang : chaque souris passe par cette série avant d'être tuée pour l'étude de ses tissus. 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole teste par voie orale des métabolites bactériens dans un modèle murin de syndrome de l'intestin irritable, en mesurant la perméabilité intestinale, l'inflammation et la sensibilité viscérale, avec une priorité donnée aux femelles. Le porteur annonce deux séries de tests anxiodépressifs de deux heures sans préciser lesquels, et écrit attendre de l'administration du métabolite qu'elle "exacerbe" les altérations intestinales du modèle.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester in vivo (par administration orale) la capacité de ces métabolites bactériens à moduler les fonctions de l’intestin dans un modèle murin de SII. Plus particulièrement, nous évaluerons leurs effets sur (i) la perméabilité intestinale, (ii) l’inflammation, (iii) le stress oxydant, (iv) la viscéro-sensibilité et (v) la motricité intestinale. L’impact de ces métabolites sur la composition du microbiote sera également étudié dans les deux sexes. Le SII étant à prédominance féminine, la priorisation de nos études se portera sur les souris femelles. Les souris mâles seront également utilisées pour nous permettre de comparer l’effet sexe dans ce modèle murin de SII.

Bénéfices attendus

Nous anticipons que l’administration de ce métabolite exacerbera les altérations de l’homéostasie intestinale rencontré dans ce modèle murin. Ces travaux pourront conduire à la mise en place d’études ultérieures utilisant des probiotiques spécifiques capables de métaboliser/utiliser ces métabolites délétère et in fine réduire l’abondance de ces métabolites

Procédures

Les souris seront sujets aux interventions suivantes : 1- Puçage, 1 fois, 5 min/souris. 2- Gavages oraux, 24 fois, 5 secondes/souris 3- Stress de contention, 2 fois, 2h/souris 4- Tests anxiodépressifs, 2 fois, 2h/souris 5- Prise de sang, 1 fois, 1min/souris 6- Mise à mort, 1 fois, 2 secondes/souris

Impact sur les animaux

Les procédures impliquent l’administration orale récurrente de plusieurs substances afin de déclencher des effets cliniques modérés (troubles fonctionnels intestinaux). Pour cette raison, ces procédures sont classées dans la catégorie modérée. Le stress étant une composante indéniable dans la physiopathologie du SII, 2 séries de stress seront réalisés avec un délai suffisant pour une récupération maximale. Les animaux seront acclimatés aux pièces d’hébergement et manipulés fréquemment. Les études utilisant ce modèle murin de SII ne mentionnent pas de mortalité particulière mais la souffrance animale sera évaluée quotidiennement.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée par la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet.

Remplacement

Le syndrome de l’intestin irritable implique de nombreux acteurs cellulaires dont le fonctionnement ou le métabolisme est altéré. En exemple, les cellules épithéliales intestinales (colonocytes, cellules muqueuses caliciformes, cellules L enteroendocrines), les cellules immunitaires intestinales (mastocytes et lymphocytes), les cellules nerveuses intestinales (cholinergiques) et les bactéries du microbiote intestinal. Le recours à l'expérimentation animale est de fait nécessaire pour mieux comprendre la physiopathologie du SII et intégrer la dérégulation globale de tous ces acteurs. Au regard de la règle des 3R, pour limiter le nombre d'animaux, certaines approches très mécanistiques sont menées actuellement sur des modèles cellulaires comme par exemple l'étude des voies régulant la fonction de barrière intestinale, l’inflammation, le stress oxydant et les fonctions neuroendocrines. Nous possédons au laboratoire diverses lignées cellulaires intestinales pouvant modéliser ces nombreux acteurs. Ces lignées ont été spécifiquement achetées grâce à des financements antérieurs. Nous possédons aussi l’expertise de la technique de co-culture sur inserts transwell qui permet d’évaluer le passage des molécules à travers la monocouche cellulaire. Ces outils in vitro sont indispensables car ils nous permettent de sélectionner les métabolites bactériens les plus intéressants à tester chez l’animal parmi la quinzaine que nous avons pu identifier dans la littérature.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, l'effectif a été évalué par l'utilisation de tests statistiques. Lors de la réalisation de l’expérimentation nous prévoyons une perte en animaux de 0.00%. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Le protocole est optimisé de manière à réduire de manière significative l’utilisation importante d’animaux dans ce projet.

Raffinement

D'une façon générale, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et hébergées au nombre maximum de 4 animaux par cage avec de l’enrichissement (coton pour le nid, maisons en carton, balles, tunnels, différents types de litière, papier kraft). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une évaluation du bien-être de l’animal sera réalisée quotidiennement à l’aide du score de la « Mouse Grimace Scale » et les animaux recevront une injection d'analgésique adaptée pour prendre en charge la douleur si besoin. L’animal sera surveillé et remis dans sa cage d’origine. En situation de douleur persistante, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée permettant d’étudier le dialogue altéré entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau dans le contexte du SII. Le recours à des modèles animaux est de fait indispensable pour (i) mieux comprendre l’influence bénéfique ou délétère de métabolites fécaux sur les animaux, et (ii) Identifier les effets sexe-dépendants en présence de ces métabolites. Le modèle murin est communément utilisé dans notre unité pour étudier les troubles fonctionnels intestinaux associés à d’autres pathologies comme l’obésité (alimentation riche en lipide) ou encore l’anorexie mentale (anorexie basée sur l’activité). La souche choisie de nos souris a un taux de réponse élevé à ces troubles par rapport à d'autres espèces animales voire d'autres souches. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie également par les quantités et le coût des métabolites administrés. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront livrées à l’animalerie centrale à leur septième semaine de vie pour un début de protocole à 9 semaines. À ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux aux différents protocoles qui induisent des troubles fonctionnels intestinaux sans mortalité particulière

Vingt-trois heures seules en cage métabolique pour récolter séparément leur urine et leurs excréments : 672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant quatre semaines, elles mangent une nourriture contaminée par une mycotoxine et reçoivent chaque semaine de l'alcool par gavage, avec des prélèvements de sang à la queue, à la joue et à la veine saphène. Le porteur indique que la mycotoxine peut réduire leur prise de poids, que le gavage peut irriter leur œsophage et que l'isolement en cage peut les stresser. Il retient une lignée de souris connue pour développer des maladies du foie, alors que l'étude porte précisément sur les atteintes hépatiques.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l'Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines, produites par certaines moisissures, sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50% des céréales, les concentrations augmentent avec le changement climatique et aujourd'hui environ 80% des individus y sont exposés. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Elle ne provoque pas de dommages sur l'ADN mais exacerbe ceux qui sont provoqués par des contaminants alimentaires connus pour endommager l’ADN dits génotoxiques. L'alcool est l'une des substances qui affecte le système nerveux (psychoactive) les plus fréquemment consommées en France et est responsable d'environ 3 millions de décès par an. La consommation d'alcool affecte principalement l’intestin et le foie et est associée à diverses maladies inflammatoires. L'alcool provoque des dommages à l'ADN qui, s'ils sont mal réparés peuvent devenir le point de départ des cancers. L’effet de l’alcool et de la mycotoxine étudiée en mélange pourrait ainsi être à l'origine d'effets encore plus importants. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l'intestin. Comme par ailleurs il est connu que les capacités de détoxification sont différentes entre les hommes et les femmes, nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes de multi-exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc.. Ils consomment aussi de l’alcool de manière occasionnelle. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à cette mycotoxine augmente les effets néfastes dus à une exposition aiguë à l’alcool, mimant une consommation occasionnelle. Les données expérimentales permettront d’évaluer comment une exposition combinée impacte notamment la santé digestive et hépatique. Nous mesurerons des marqueurs de génotoxicité et d’inflammation et des lésions de l’intestin et du foie. Les résultats attendus de ce projet sont importants en termes de santé publique, car les consommateurs sont chroniquement exposés à ces contaminants en mélange. Si l’hypothèse d’une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu’elles sont combinées est confirmée, les données produites seront valorisées dans des publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’homme.

Procédures

Les souris hébergées en groupe seront exposées à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines. Une fois par semaine elles recevront le traitement à l’alcool par gavage, durée du geste 30 secondes et un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux vigiles dont la durée est inférieure à 1 minute. Lors de la dernière semaine du protocole, les animaux seront soumis également à un jeûne de 4 heures, à un gavage avec un marqueur fluorescent (durée du geste 30 secondes) ainsi qu'au prélèvement de deux gouttes de sang à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale, ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour 23h au maximum pour récolter séparément les urines et les fèces pour analyses. A la fin de chaque procédure, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la joue puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’administration de l’alcool par gavage peut entrainer une modification transitoire du comportement. Le gavage oral peut induire une irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins à la veine maxillaire, à la veine caudale et à la veine saphène peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une douleur liée à la piqure de l’aiguille. L’isolement de l’hébergement individuel en cage à métabolisme peut être stressant pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée en mélange avec l’alcool exacerbe la réponse inflammatoire de cellules d’intestin ou de foie en culture. Cependant lorsqu’ils sont ingérés par un organisme vivant, leur devenir puis leurs effets vont dépendre notamment de leur absorption dans l’intestin et de la façon dont ils sont détoxifiés dans le foie. Ce projet nécessite donc l'utilisation d'animaux de laboratoire car nous souhaitons étudier les conséquences d’une co-exposition alimentaire à la mycotoxine et à l’alcool sur un organisme entier, ce qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives comme la culture de cellules.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Le gavage sera réalisé par une personne expérimentée, l’observation des animaux sera renforcée après l’administration afin de s’assurer du bien-être des animaux. Une crème anesthésiante sera appliquée avant les prélèvements de sang. Les cages individuelles utilisées durant 23h maximum sont transparentes, incluent l’abri en inox et les animaux sont à proximité de leurs congénères afin de permettre le contact visuel. Durant ce séjour, le suivi du bien-être est renforcé avec plusieurs visites par jour.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. C’est d’autre part le modèle le plus utilisé pour étudier et reproduire les effets de la consommation d’alcool ou de l’exposition à des mycotoxines comme en atteste la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

50 souris âgées de 12 à 18 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde après un prélèvement de sang ou d'organes. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection d'antibiotique puis un gavage de Clostridioides difficile, ou des solutions témoins, et pendant 21 jours un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution, avec neuf prises de sang et neuf prélèvements de selles. Le projet vise à réduire, grâce à la seconde bactérie, la mortalité d'une colite provoquée chez la souris par la première, première cause mondiale de diarrhée contractée à l'hôpital. Parmi les effets attendus, le porteur ne cite pourtant que des réactions au point d'injection, des changements temporaires d'appétit ou de comportement et des effets de l'infection "potentiellement réversibles avec des soins appropriés".

Objectifs

La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisiterait en l’évaluation de l’efficacité et de la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.

Bénéfices attendus

- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.

Procédures

Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.

Réduction

L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 50 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 10 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.

Raffinement

Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.

Après la greffe qui humanise leur foie, une partie des souris peut passer dans d'autres projets de l'établissement, dont une formation interne aux gestes techniques, et les autres sont tuées, faute de pouvoir retrouver leur état de santé. 8 800 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques. Elles reçoivent des injections de composés qui tuent leurs cellules du foie et leurs cellules souches, puis une greffe de cellules humaines, dont l'injection par la veine porte comporte un risque hémorragique accru, et, en parallèle, les produits testés par voie respiratoire, orale ou injectable. L'humanisation ne réussit que chez environ une souris sur deux, ce qui porte à 7 800 l'effectif de 78 études de 50 souris. Le porteur écrit : "Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'effectif étant estimé d'après les études des années antérieures, avec une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

1 ou plusieurs injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.