Troubles gastrointestinaux

Tous tués en fin de protocole pour analyse des tissus, 30 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première chirurgie d'une heure leur coupe la continuité digestive et leur pose un anus artificiel, une seconde intervention rétablit le passage par voie endoscopique deux semaines plus tard, et une à trois anesthésies supplémentaires suivent pour retirer la prothèse et examiner le rectum. Chaque intervention est précédée d'une mise à jeun, le porteur reconnaissant que la faim et l'angoisse précèdent les deux opérations. La première phase chirurgicale sert aussi à former des internes en chirurgie, ce que le porteur inscrit à sa rubrique réduction puisqu'aucun animal supplémentaire n'y est consacré.

Objectifs

Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte (laparotomie), souvent dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon . Cette intervention consiste à reséquer la partie du côlon gauche lésée. Le rectum est ensuite refermé (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon en partie haute est extériorisée en extracorporel via une stomie permettant l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie ainsi réalisée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte le plus souvent. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, et des risques propres à une deuxième chirurgie pour le rétablissement de continuité, moins d’un patient sur deux sera à terme candidat à cette nouvelle chirurgie, avec des risques supplémentaires. L'objectif de notre étude est de développer une méthode non invasive de rétablissement de la continuité colorectale à l'aide d'une procédure endoscopique innovante.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité́ d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, et l’évaluation du devenir des anastomoses colorectales confectionnées endoscopiquement après retrait de la prothèse d’apposition luminale. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients contre-indiqués au rétablissement de continuité chirurgicale, une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de réintervention pour sténose ou fistule anastomotique. Une évaluation du devenir des anastomoses après retrait des prothèses d’apposition luminale paraît indispensable, l’objectif à terme étant de proposer un rétablissement mini-invasif à des patients opérés d’une intervention de Hartmann, y compris en dehors de toute situation carcinologique ou palliative. La participation d’internes dans la première phase, permettra également d’améliorer leur formation et leur préparation aux situations réelles.

Procédures

Les animaux auront tous 2 anesthésies générales avec mise à jeun des aliments solides dans les heures qui précédent : une première procédure chirurgicale destinée à interrompre la continuité digestive et à créer la stomie ("anus artificiel") (durée environ 1 heure). La seconde intervention, deux semaines après la première, est le traitement par voie endoscopique, d’une durée de 40 minutes environ. Les animaux auront ensuite de une à 3 interventions supplémentaires non invasives, sous courte anesthésie générale, d’une durée inférieure à 30 minutes, pour l’ablation de la prothèse et la rectoscopie (examen endoscopique du rectum). La mise à mort sera réalisée en fin de projet, sous anesthésie générale préalable.

Impact sur les animaux

Du stress et de l’angoisse peuvent être présents en amont des deux interventions chirurgicales (J0 et J14), faites sous anesthésie générale : ces deux interventions sont considérées comme des procédures à degré de sévérité modérée car de la douleur peut être ressentie par les animaux à l’issue des procédures. Les procédures de contrôle endoscopique sont considérées comme des procédures à degré de sévérité légère. Une mise à jeun des solides au matin de la procédure est nécessaire pour les deux interventions de J0 et J14. De la faim peut donc être ressentie avant les interventions chirurgicales (J0 et J14) mais la boisson est autorisée ad libidum. La reprise de l’alimentation est autorisée le jour-même en l’absence d’élément évocateur de complication. Aucune mise à jeun n’est nécessaire pour les contrôles endoscopiques sous sédation simple.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d'analyses des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.

Remplacement

Il s’agit d’une nouvelle procédure au stade de recherche pré-clinique, n’ayant pas été réalisée chez l’Homme et ne pouvant être envisagée en l’absence d’étude de faisabilité sur modèle animal. Les simulateurs virtuels et mécaniques (Phantômes) ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal dans l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieure et antérieure de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Néanmois, à l’heure actuelle, aucun modèle existant permet de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo ne permet de reproduire le péristaltisme digestif, ni les conditions post opératoires après intervention de Hartmann. S’agissant d’une étude de faisabilité d’anastomoses, du tissu vivant est indispensable pour permettre une cicatrisation et évaluer la survenue de sténoses anastomotiques. L’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux maximum étudié a été fixé à 30 pour notre étude, s’agissant du nombre d’animaux nécessaire pour explorer les différents délais avant retrait des prothèses d’apposition luminale, tout en évitant les biais liés à la variabilité individuelle. Cet effectif est suffisant pour apporter des conclusions et permettre de détecter d’éventuelles complications associées à la réalisation des procédures et au suivi à long terme des effets de la procédure. Ces 30 animaux sont répartis en plusieurs lots de 4 à 5 animaux stables, permettant un étalement des procédures et une adaptation progressive en cas de difficultés techniques ou de complications. Il n’existe à ce jour pas d’étude dans la littérature s’intéressant à notre sujet de recherche, ce qui ne permet pas de réaliser un calcul d’effectif ou de nombre de sujets nécessaires. La participation d’internes de chirurgie en fin de cursus sous la surveillance d’un chirurgien sénior, pendant la première phase chirurgicale, permettra la formation chirurgicale aux techniques précédemment évoquées sur un modèle vivant utilisé en formation, et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires. Le projet d’étude présenté prévoit également l’utilisation de dispositifs innovants visant à améliorer l’efficacité de l’intervention par le rapprochement du colon et du rectum. Apporter la preuve de l’efficacité de ces dispositifs lors de cette étude dispenserait également de la réalisation d’une nouvelle étude animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers) pour leur permettre d’exprimer un spectre plus large de comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

L’anatomie du tube digestif du porc est connue pour être particulièrement proche de celle de l’anatomie humaine et constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche en endoscopie digestive depuis de nombreuses années. La taille de l’animal permet d’utiliser les mêmes dispositifs (endoscopes, prothèses) que ceux disponibles en pratique clinique humaine. Nous projetons d’utiliser des mini-pigs pour limiter l’impact de la croissance post-opératoire, et faciliter le suivi au long cours ainsi que les diverses manipulations (retrait de la prothèse, scanner, contrôle endoscopique) Les animaux doivent être sevrés et peser plus de 15 kg permettant l’utilisation du même matériel que chez l’humain adulte (qui est utilisé chez l’enfant de plus de 15 kg).

10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 8 640 reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc, 2 160 une chirurgie abdominale de quinze à vingt minutes pour injecter ces cellules dans le foie, et 1 620 un traitement au plasma froid de dix minutes répété jusqu'à sept fois. Le porteur indique que ce gaz appliqué sur la peau peut l'assécher jusqu'à la nécrose dans les cas extrêmes, et que le développement tumoral entraîne un inconfort croissant. L'efficacité du plasma froid sur le cholangiocarcinome reste à démontrer, le porteur la disant "prometteuse" d'après des travaux sur d'autres cancers, là où les tumeurs greffées et les chirurgies du foie, elles, figurent au protocole.

Objectifs

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.

Soumises 6 à 12 mois à des régimes enrichis en graisses ou en sucres, puis toutes tuées pour des prélèvements post-mortem, 4 896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est échographiée au foie sous anesthésie tous les 15 jours, une autre subit une chirurgie terminale, et certaines sont transportées entre les deux établissements du projet. Le projet vise le rôle de régulateurs de l'intégrité du génome et du microenvironnement immunitaire du foie dans la progression de la stéatose vers le carcinome hépatocellulaire. Le porteur annonce une injection "intraveineuse unique sous anesthésie générale", puis décrit comme source d'inconfort une "injection sous-cutané" avec "passage de l'aiguille au travers de la peau et du péritoine".

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4896).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4896 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

4 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes passent 6 à 12 mois sous des régimes enrichis en graisses ou en sucres pour reproduire la stéatose et le cancer du foie, une partie reçoit une injection intraveineuse sous anesthésie pour exprimer un gène, une autre est échographiée sous anesthésie tous les 15 jours, soit 8 à 12 séances en moyenne, une autre encore subit une chirurgie terminale, et certaines sont transportées entre deux établissements. La prise de poids attendue peut modifier leur mobilité et les tumeurs du foie peuvent altérer leur état général, pour des résultats qui "devraient" mener, écrit le porteur, à de nouvelles pistes thérapeutiques "dans un futur proche". Il qualifie d'"indispensable" l'utilisation de souris vivantes, parce qu'elles constituent selon lui "le seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire un gène dans un tissu précis.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4896).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4896 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

Le canal biliaire ligaturé au cours d'une laparotomie de quinze minutes, 760 rats reçoivent ensuite jusqu'à cinquante-six administrations de composés, par gavage, sous la peau, en intraveineuse ou dans le nez, ou quatre séances de dialyse péritonéale suivies de drainages, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour l'examen du foie, des reins et du cerveau. Le porteur qualifie le modèle de modéré parce qu'il "ne va pas jusqu'au seuil critique" de l'encéphalopathie hépatique, tout en énumérant des vocalises spontanées, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire et une pâleur prononcée qui "conduiront à la mort des animaux". Il annonce aussi un volume de liquide de dialyse "beaucoup plus important que celui recommandé", et renonce aux tests comportementaux poussés au profit d'une simple observation de la léthargie et de l'ataxie.

Objectifs

L'encéphalopathie hépatique (EH) est un problème cérébral qui survient à cause d'une maladie du foie, qu'elle soit aiguë ou chronique. Elle peut se manifester par des changements de comportement ou des troubles de l’esprit, allant de symptômes légers à un coma. Cette maladie est sérieuse et peut entraîner des complications graves, nécessitant des soins médicaux importants. Bien que l’on ne comprenne pas encore complètement les causes de l'EH, on sait qu’elle est liée à des substances inflammatoires et toxiques dans le corps, comme l’ammoniaque. L’ammoniaque provient en grande partie du métabolisme des protéines par les bactéries dans l’intestin. Normalement, le foie transforme l’ammoniaque en une autre substance, l’urée, qui est ensuite éliminée par les urines. Mais lorsque le foie ne fonctionne pas bien, il ne peut plus effectuer cette transformation correctement. En plus de la transplantation du foie, il existe des traitements comme le lactulose ou la rifaximine, mais ils peuvent avoir des effets secondaires, et certains patients ne répondent pas bien aux traitements. Ce projet vise à reproduire cette maladie dans différents modèles expérimentaux, afin de tester de nouveaux traitements pour l’encéphalopathie hépatique, quel que soit le mode d’administration (par voie orale, intraveineuse, par injection dans l’abdomen, ou même par dialyse péritonéale).

Bénéfices attendus

La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH ou HE) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).

Procédures

La chirurgie passe par une laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale avec couverture analgésique pré et post opératoire (durée 15 minutes). Un prélèvement de sang (durée 1 minute) de randomisation sous anesthésie à l'isoflurane (durée 3 minutes).cas de la dialyse : 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes) et 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. Autres types de traitement : au maximum 56 administrations par gavage, en sous-cutanée, en intraveineuse, en intranasale (durée une minute) ou en administration intraveineuse lente (durée 30 minutes). 6 prélèvements de sang intermédiaires (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes) . Un prélèvement de sang final (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation « spontanée » peut inéluctablement conduire à la mort. Nous reproduirons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent spontanément. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, du larmoiement et une pâleur prononcée conduiront à la mort des animaux et à un réajustement du modèle. Il est cependant à noter que l'administration du liquide de dialyse devra être réalisée par des personnes maitrisant parfaitement le geste (dans les règles de l'art). IL est aussi à noter que dans ce cadre le volume d’administration est beaucoup plus important que celui recommandé. Ce volume a déjà été testé dans une précédente autorisation et n’a entrainé ni douleur ni inconfort.

Devenir

L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux

Remplacement

Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.).

Réduction

Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Cette estimation s’appuie sur nos expériences antérieures durant de nombreuses années du modèle BDL chez le rat et de l’hétérogénéité de variance de nos paramètres d’efficacité (biomarqueurs plasmatiques circulants qui sont assez labiles). A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Un test statistique est réalisé pour permettre de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote préalable par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité.

Raffinement

L’encéphalopathie hépatique à son stade terminale est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Notre modèle expérimental ne va pas jusqu’au seuil critique de la pathologie et est donc modéré. Un certain nombre de signes cliniques sans gravité associés à la mise en place de la pathologie seront observés. Sans mettre en place de tests comportementaux poussés, des changements notables seront observés chez les animaux : léthargie, apathie (perte progressive de l’exploration , de la curiosité à l’ouverture de la cage), une diminution de la prise alimentaire (sans risque pour l’état général de l’animal), des altération de la coordination (ataxie). D’autres signes nous conduiront à une plus grande vigilance dans l’observation tels que des crises de tremblements légers ou des spasmes musculaires, des réactions excessives aux stimuli extérieurs, de l’agitation. Ces signes individuellement ne seront pas des critères de mise à mort des animaux, mais nous permettront de juger de l’évolution de la pathologie. Certains signes cliniques comme l’absence de réaction ou des crises de convulsions seront par contre des points limites à nos études. La liste de ces points limites pourra être réajustée au fur et à mesure de nos observations, afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Une partie des observations étant de nature comportementale, les études requiert l’utilisation d’animaux et ne peuvent être remplacées par des expérience in vitro.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de développer une encéphalopathie associée à une atteinte hépatique et donc de valider l’efficacité d’un traitement dans cette pathologie. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les études seront réalisées sur des jeunes adultes Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental. Les études seront réalisées sur des animaux de 6 semaines (250-275 gr) à l'arrivage afin de permettre une phase d'habituation et d’avoir des animaux d'environs 400g au moment de la chirurgie. Pour les études dont la chirurgie sera faite en externe, nous utiliserons des animaux de 8 semaines (375-400 gr) au moment de la chirurgie.