Troubles gastrointestinaux

548 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 264 opérées une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur les muscles abdominaux, puis hébergées seules dès le réveil. Sur ces souris maintenues éveillées, une pression est appliquée dans le côlon pendant dix secondes et répétée par paliers croissants pendant qu'on compte leurs contractions abdominales, stimulus que le porteur qualifie lui-même de douloureux. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 284 animaux et modéré pour 264, d'autres souris passant 23 heures en cage à métabolisme, d'autres étant mises à reproduire pour étudier l'effet du régime maternel sur la descendance. L'objet est de savoir si le fer héminique de la viande rouge, de la charcuterie ou d'un substitut végétal à base de léghémoglobine de soja aggrave la sensibilité du côlon, les retombées annoncées pour les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable se limitant à des recommandations nutritionnelles à préciser.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique répandue (5-10% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est également une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Le diagnostic pour ces patients repose en partie sur l’évaluation de leur sensibilité viscérale, qui se trouve exacerbée en réponse à l’application d’une pression appliquée sur la paroi du côlon par rapport à la sensibilité perçue par une personne saine. Bien que les causes de ce syndrome restent peu comprises, il est établi que la composition du régime alimentaire influence fortement l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de sensibilité viscérale chez ces patients, mais une étude chez la souris montre que la consommation d’un régime riche en fer héminique engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de répondre à 3 questions : 1- La sensibilité accrue induite est-elle équivalente quelle que soit la forme du fer héminique consommé ? La sensibilité viscérale induite sera mesurée chez des souris chez lesquelles le fer héminique du régime sera apporté sous forme (i) purifiée, (ii) d’hémoglobine ou (iii) de viande. 2- La mise sur le marché d’une préparation à base de léghémoglobine de soja, à savoir une molécule de la même famille que l'hémoglobine de la viande, mais d'origine strictement végétale, est envisagée en Europe pour produire des substituts de viande. Au regard de la proximité de ces deux molécules, ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est-il susceptible d’engendrer des effets sur la physiologie et la sensibilité du côlon ? 3- Sur le plan nutritionnel pendant la gestation et la lactation, un apport suffisant en fer, même héminique, est crucial. Une consommation maternelle excessive en produits carnés riches en fer héminique (environ 20% des femmes) est-elle susceptible de prédisposer sa descendance à des troubles digestifs tels qu’une sensibilité viscérale augmentée ?

Bénéfices attendus

En termes de santé publique, ces études permettront de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries, ou encore la consommation de substituts de viandes préparés à base de léghémoglobine. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale, et chez la femme enceinte et allaitante, pour qui durant ces périodes, l’apport en fer est essentiel.

Procédures

Sur les 548 souris nécessaires à la réalisation de ce projet, 152 d’entre elles seront dédiées à la reproduction pour une exposition nutritionnelle périnatale. 228 souris nourries avec un régime dont la source de fer consommée (ou celle consommée par leur mère) sera contrôlée, seront placées chacune 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. 264 souris nourries en parallèle avec ces mêmes régimes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h maximum par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Pour la mesure de sensibilité viscérale, le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intra-colique pendant 10 secondes et répétée 4 fois par palier croissant.

Impact sur les animaux

Des groupes de souris, dont la source du fer consommé (ou consommé par leur mère selon la fenêtre d’exposition concernée) sera contrôlée, seront placés 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. Le stress modéré induit par la stabulation sur grille et l’isolement transitoire, pourrait modifier la mesure de la sensibilité viscérale, c’est pourquoi ces groupes de souris seront uniquement destinés à la collecte des échantillons fécaux et urinaires. En parallèle, pour la mesure de la sensibilité viscérale, les souris exposées à ces différentes sources de fer seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h par intervention pour implanter le dispositif de mesure sur les muscles abdominaux, ce qui suppose un inconfort lors de la phase de réveil, de récupération et lors des contentions effectuées pour l'administration des traitements post-opératoires (injections sous cutanées) et la vérification des points de suture. La préservation de ce dispositif implique un hébergement en cage individuelle à partir du réveil, et donc un stress lié à un isolement transitoire. La mesure de sensibilité viscérale requière que la souris reste vigile. Le stimulus douloureux ressenti résultera d’une augmentation de la pression intra-colique appliquée pendant 10 secondes à 5 reprises par palier espacés chacun de 10 minutes. Cette mesure est donc associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Remplacement

Les modèles cellulaires ont montré que des molécules formées dans le côlon lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différente selon que la cellule exposée soit saine ou pré-tumorale. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale, que ce soit chez la souris adulte ou chez sa descendance. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de cette exposition directe ou indirecte à ces contaminants d’origine alimentaire néoformés dans le contenu du côlon. La mesure de la sensibilité viscérale en réponse à l’application d’une pression intra-colique reste par ailleurs la méthode employée chez les patients pour fiabiliser le diagnostic du syndrome de l’intestin irritable.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure de sensibilité viscérale sur le plan technique (expérience de l’expérimentateur) et du bien-être de l’animal. Ces améliorations ont permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaire. Ce nombre sera réduit à 6 pour les lots parallèles destinés aux prélèvements fécaux et urinaires. Par ailleurs, le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact des régimes maternels sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept du DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne parfois des individus surnuméraires : les femelles restées non gestantes, les mâles après la phase de reproduction ainsi que les nouveaux nés surnuméraires. Ils serviront de témoin d’exposition pour la collecte d’échantillons, préservant ainsi les femelles gestantes et leur descendance d’un cumul d’interventions. Une saisine a déjà été anticipée en parallèle pour réaffecter ces souris surnuméraires à d’autres mesures complémentaires comme la mesure de la motricité intestinale. La reproductibilité et fiabilité des résultats sera assurée par une répétition indépendante des expérimentations. Une analyse statistique univariée par facteur sera réalisée et des approches multivariées couplées à des analyses de corrélations permettront d'exploiter au maximum l'ensemble des données qui seront générées.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être des souris et de leurs conditions d’hébergement : des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires seront effectuées, et pour minimiser le stress lié aux périodes d’hébergement en cage individuelle, les cages transparentes seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Des planches de fibre de coton déchiquetables (nestlets) leur seront distribuées pour satisfaire leur besoin de nidification et d’exercice, facilitant leur thermorégulation au sein du nid et celle de leur portée dans le cas de l’étude périnatale. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière (ou sur la grille en cage à métabolisme) leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Une observation des souris à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra de détecter à temps toute anomalie éventuelle et de minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation).

Choix des espèces

La souris est un modèle courant pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons retenu une souche pour laquelle nous avons une grande expérience et une bonne base de connaissance à propos de sa physiologie digestive (barrière intestinale, système immunitaire, microbiote et sensibilité viscérale), comme de son comportement face aux produits d’anesthésie. En outre, le modèle choisi présente l’avantage d’être particulièrement sociable, la souche de souris choisie ne nécéssite pas en effet de contention pour la manipuler, et les femelles portent une grande attention envers leur descendance, ce qui limite le cannibalisme. Quelle que soit l’étude considérée, la mesure de la sensibilité viscérale requiert un tractus digestif mature. Des animaux adultes âgés de 9-11 semaines seront donc utilisés. En amont et pour permettre d’avoir des phases d’exposition aux différents régimes, nous réceptionnerons donc des souris âgées de 6 semaines pour les études chez l’adulte et des souris en âge de procréer (7-8 semaines) pour l’étude dédiée à une exposition maternelle pendant la gestation et la lactation.

Toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, 9 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier les liens entre microbiote intestinal et maladies inflammatoires chroniques. Les actes décrits se limitent à des prises de sang sans anesthésie, uniques ou répétées sur deux heures, et à quatre gavages au plus. Le porteur annonce pourtant que certaines approches provoqueront une inflammation intestinale chronique ou un cancer colorectal, et une prise de masse grasse chez certaines souris, puis écrit : "Aucun stress ni comportement anormal n'est anticipé." Il affirme que le recours à la souris est "indispensable", sans préciser comment ces maladies sont déclenchées, quels facteurs alimentaires sont testés, ni combien de souris subissent chaque approche.

Objectifs

Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer les facteurs environnementaux régulant le microbiote intestinal, ainsi que de caractériser les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal peut conduire au développement de maladies inflammatoires chroniques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal est régulé, et l’importance de ce dernier dans les maladies inflammatoires

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement de sangs de 5 à 10µL par prélèvement sur animaux vigiles. Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements multiples seront séparés d’au moins une semaine Les animaux subiront un maximum de 4 gavage oral d’un volume maximal de 200microL ? Ces gavages seront séparés d’au moins une semaine entre eux. Les animaux subiront un prélèvement unique de sang en fin de protocole

Impact sur les animaux

Certaines approches induiront une inflammation intestinale chronique et/ou un cancer colorectal chez les animaux. De plus, certains animaux développeront des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse. Les facteurs alimentaires étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. Aucun stress ni comportement anormal n’est anticipé. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée. Un stress et une potentielle douleur peuvent être liés aux prélèvements sanguins.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures proposées, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en lien avec le développement de pathologies inflammatoires chroniques.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 15 souris par condition et par sexe était nécessaire être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès des biostatisticiens.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 3-8 semaines d’âge lors du démarrage des différentes procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser de jeunes animaux afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote.

2 095 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 600 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie leur est imposée par trois voies, une lignée génétiquement modifiée, une chirurgie abdominale de quinze à vingt minutes, ou des injections répétées dans l'abdomen sur animal vigile, avant jusqu'à six expositions au plasma froid espacées de trois à cinq jours. Le porteur indique qu'à un stade tardif ces modèles conduisent tous à une défaillance hépatique pouvant provoquer un ictère et, dans les cas les plus graves, la mort, et que le plasma appliqué sur la peau peut causer des brûlures superficielles allant jusqu'à la nécrose. L'effet antifibrosant recherché reste une hypothèse à tester, quand l'atteinte du foie, elle, est provoquée d'emblée, et le porteur conclut qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

La fibrose hépatique est un processus de cicatrisation anormal du foie, où le tissu sain est remplacé par une matrice extracellulaire rigide et dysfonctionnelle. Cela survient après une lésion chronique du foie, entraînant la transformation des fibroblastes en myofibroblastes qui sont les principales cellules à l’origine de la fibrose. La fibrose hépatique est la cause directe d'environ un demi-million de décès par an dans le monde. En outre, elle alimente la gravité d'autres maladies chroniques du foie, y compris le cancer primitif du foie. À ce jour, les options thérapeutiques visant à restaurer l'homéostasie du foie fibreux ne sont pas satisfaisantes, et restent un enjeu médical majeur. Le plasma froid atmosphérique (PFA), également connu sous le nom de gaz faiblement ionisé, représente une stratégie thérapeutique innovante pour traiter la fibrose. En effet la production de composés chimiques par le PFA entraine un stress de la cellule. Ainsi, nous émettons l'hypothèse selon laquelle le PFA pourrait restaurer un fonctionnement tissulaire normal par différents mécanismes i) en modulant la fonction des cellules impliquées dans la progression de la fibrose et ii) en modifiant la structure des protéines du tissu fibrotique. Les objectifs sont de tester l’efficacité anti-fibrosante du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules pro-fibrosantes et sur les composants de la MEC, dans des modèles précliniques de fibrose hépatique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique est la cause directe d'environ un demi-million de décès par an dans le monde. En outre, elle alimente la gravité d'autres maladies chroniques du foie, y compris le cancer primitif du foie. À ce jour, les options thérapeutiques visant à restaurer l'homéostasie du foie fibreux ne sont pas satisfaisantes, et restent un enjeu médical majeur. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans différents modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le foie fibreux. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet anti-fibrosant du plasma froid atmosphérique dans 3 modèles bien décrits de fibrose hépatique représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-fibrosant s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-fibrosant applicable en santé humaine dans le cadre des maladies hépatiques fibrosantes. Au-delà de la fibrose, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour la cicatrisation des plaies, le traitement du cancer et l'ingénierie tissulaire.

Procédures

Le modèle génétiquement modifié utilisé développe spontanément une fibrose qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Le modèle chirurgical implique une chirurgie abdominale effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post opératoire. La chirurgie est d’une durée 15 à 20 minutes pas animal. Enfin, le modèle chimique implique des injections régulières au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale). Ces injections sont effectuées sur animal vigile par simple contention et ne dure que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Pour les traitements au plasma froid, les souris seront anesthésiées et seront exposés soit par application locale au niveau cutanée, soit par injection au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale). Ces traitements ne devraient pas excéder quelques minutes et pourront être appliqués jusqu’à 6 fois maximum avec un intervalle de 3 à 5 jours entre chaque traitement. A l’issue des traitements, les animaux seront anesthésies et analgésiés puis seront soumis à un prélèvement sanguin précédant l’euthanasie. Ce prélèvement est strictement nécessaire pour les analyses à effectuer et ne durera pas plus de 5 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement, chirurgicalement, ou chimiquement. A un stade tardif, ces modèles conduisent tous à une pathologie/défaillance hépatique pouvant induire un ictère (jaunissement) et dans les cas les plus graves peuvent conduire au décès. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et tester la thérapie par plasma froid. Le modèle génétiquement modifié développe spontanément une fibrose qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Le modèle chirurgical implique une chirurgie abdominale qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie, etc.). Enfin, le modèle chimique implique des injections régulières au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Le traitement par plasma froid devrait quant à lui réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées. Cependant, l’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer des brûlures superficielles et un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrême (peu probable). Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal, inflammation, etc.). Les traitements seront effectués sous anesthésie et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.). Enfin, le prélèvement sanguin effectué avant l’euthanasie sous anesthésie et analgésique pourra induire un stress au moment de l’induction de l’anesthésie. Ce prélèvement sera effectué́ juste avant l’euthanasie de l’animal (pas de réveil).

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-fibrosantes. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans les pathologies hépatiques, telle que la fibrose qui peut évoluer vers la cirrhose, puis le cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le projet impliquera un total de 2095 animaux. Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire nécessaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée transgénique utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de fibrogenèse hépatique dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer la fibrose hépatique avec des caractéristiques de la maladies proches de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de fibrose hépatiques existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Nous utiliserons un modèle génétiquement modifie qui développent de manière spontanée des lésions hépatiques. Nous utiliserons également des souris commerciales et induirons chirurgicalement ou chimiquement des modèles de fibrose validé par la communauté scientifique. Justification des stades : Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : - 4-8 semaines pour les animaux transgéniques - 6-8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1-2 semaines d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge et qui pourraient interférer avec nos résultats.

Les souris utilisées portent la glycogénose de type III, une maladie qui leur vaut à l'âge adulte une faiblesse musculaire et une fibrose du foie évoluant, dans un tiers des cas, vers des tumeurs. 522 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une biopsie de la queue pour le génotypage, une injection intraveineuse du vecteur viral sous contention ou sous anesthésie selon l'âge, puis un prélèvement sanguin mensuel par voie mandibulaire. Le foie devant être analysé pour mesurer la correction apportée par la thérapie génique, aucune souris n'est gardée vivante.

Objectifs

La glycogénose de type III (GSDIII), également connue sous le nom de maladie de Forbes-Cori, est un trouble génétique rare qui affecte la façon dont notre corps stocke et utilise le glucose, qui est le principal carburant de notre corps. Normalement, le corps stocke du glucose sous forme de glycogène, une sorte de réservoir d'énergie, pour pouvoir l'utiliser lorsqu'il en a besoin, comme lorsqu'on fait de l'exercice ou on saute un repas. Dans la GSDIII, il y a un problème avec une enzyme spéciale, appelée GDE, qui aide à décomposer ce glycogène en glucose pour que le corps puisse l'utiliser. Sans cette capacité à bien décomposer le glycogène, le corps manque d'énergie au moment où il en a besoin. Le glycogène s'accumule alors de façon anormale dans les muscles et le foie, conduisant à une faiblesse musculaire et des problèmes hépatiques. Il n’existe pas de traitement permettant de guérir cette maladie. Notre projet est de corriger l’atteinte hépatique de cette maladie, grâce à l’utilisation d’un virus modifié, pour transporter le gène de la GDE jusqu’aux cellules du foie, afin qu’elles soient de nouveau capable de fabriquer cette GDE et d’utiliser le glycogène comme énergie. Avant qu’une telle stratégie ne puisse être utilisée pour traiter des malades, il est indispensable de tester son pouvoir thérapeutique sur le modèle animal de la GSDIII, ici la souris. Ce projet décrit les procédures expérimentales qui seront réalisées chez ces souris afin de déterminer l’efficacité du virus médicament. Dans un plus long-terme, une optimisation devra lui être apporter, afin de traiter en même temps le foie et les muscles.

Bénéfices attendus

Une des limites majeures pour le traitement de l’atteinte hépatique dans la GSDIII est le développement progressif de fibrose et la dégénerescence des cellules du foie au cours du temps. Notre projet peut répondre à cette problématique grâce à une stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation d’un virus médicament intégratif pour transporter le gène manquant jusqu’aux cellules du foie. En effet, le gène transporté par ce type de virus s’intègre dans l'ADN de la cellule cible et permet ainsi une expression stable au cours du développement cellulaire, un réel avantage pour corriger à long-terme le défaut héptatique dans GSDIII, en particulier chez les patients pédiatriques, dans lesquels le foie subit une forte croissance.

Procédures

La gestion de l'élevage des souris GSDIII nécessite une biopsie (queue) afin de confirmer le défaut génétique des souris qui entreront en protocole ( réalisé une fois par animal, geste qui dure moins d'une minute). Ce projet décrit l'évaluation d'un traitement injecté par voie intraveineuse, sur animal vigile, placé sous contention: 1 seule injection par animal, ce geste dure 1 minute. Un bilan sanguin mensuel sera réalisé ches les souris, grâce à un prélèvement réalisé sous anesthésie générale (ce geste dure 1 minute)

Impact sur les animaux

Les souris GSDIII présentent à l'âge adulte une faiblesse musculaire, mais pas de difficulté motrice évidente ni essoufflement. Ces souris sont capables de s’alimenter et de se déplacer normalement. Elles développent, également à l'âge adulte une fibrose hépatique, pouvant entrainer, dans un tiers des cas, des tumeurs, vers l'âge de 14-15 mois. Nous utilisons des virus médicaments non dangereux et à des doses non toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Seuls les gestes techniques pourront provoquer d'eventuelles nuisances aux souris. Ces gestes comprennent une biopsie de la queue pour confirmer le défaut génétique, l’injection du virus (intraveineux) ainsi que de prélèvements sanguins mensuels. Ces actes de gravité légère seront réalisés à l’aide d’outils appropriés et auront des répercussions mineures pour l’animal.

Devenir

Afin de pouvoir évaluer la correction de la glycogénose de type III grâce au virus médicament, le foie doit être prélevé et analysé. Tous les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir récupérer cet organe.

Remplacement

Afin de sélectionner le virus médicament le plus performant, l’idéal serait de pouvoir le tester sur des cellules. Néanmoins, une fois dans l’organisme, le virus doit échapper au système immunitaire, traverser la paroi des vaisseaux sanguins et pénétrer dans le foie afin d’apporter le gène manquant. Malheureusement, ces étapes ne sont pas encore réalisables dans des cellules. Il est donc indispensable de devoir recourir à des animaux pour se rapprocher le plus possible de ce qu’il se passera chez l'humain.

Réduction

Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat fiable nous permettant de répondre aux problématiques posées. De plus, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de s'assurer que le maximum d'informations possible est recueilli sur chaque animal.

Raffinement

Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. En cas de biopsies à la queue, l'hémostase sera vérifiée en appliquant une pression sur la partie coupée de la queue avec de la gaze jusqu’à ce que le saignement se soit arrêté. L'animal sera ramené dans sa cage et surveillé pendant au moins 5 minutes pour détecter la réapparition d'éventuels saignements. Pour réaliser les injections par voie intraveineuse, les souris seront positionnées sous une source chaude pour favoriser la vasodilatation des veines. Selon l'âge des souris, elles seront réalisées dans la veine temporale, sous anesthésie (souriceaux) ou dans la veine de la queue sur animal vigile (adultes). Ces voies d’administration ont été choisies pour leur efficacité et leur rapidité. Ces injections seront réalisées lentement pour éviter toute augmentation brutale de la volémie. Un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point d’injection. Après l’injection des différents vecteurs, les souris seront surveillées pour vérifier l’absence de signes de souffrance (souris prostrée, diminution d’activité locomotrice spontanée, poil piqué). Dès les premiers signes de souffrance, la souris sera pesée et surveillée quotidiennement. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Les prélèvements de sang mensuels seront réalisés par voie mandibulaire, sous anesthésie gazeuse (Isoflurane).

Choix des espèces

Les souris atteintes de la glycogénose de type III présentent les différentes caractéristiques de la pathologie observée chez l’humain. C’est un modèle validé par la communauté scientifique, prédictif de l’efficacité du traitement qui sera utilisé en clinique. Par conséquent, nous allons optimiser notre traitement dans cette espèce animale. Pour répondre à notre objectif, les souris seront traitées à différents stade de sévérité de la maladie (de la naissance à l’âge adulte), afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique de notre vecteur. Nous souhaitons comprendre si ce traitement sera capable de (i) prévenir la maladie chez les plus jeunes souris (traitement avant l’apparition de fibrose) et maintenir une correction sur le long-terme malgré la croissance du foie, et (ii) corriger la pathologie chez les souris plus âgées et donc plus sévèrement atteintes (traitement de foies fibrotiques).