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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Gastroentérologie : Prélèvements de tissus du système digestif chez l’animal pour isoler des cellules primaires
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 250
Cochons d'Inde : 125
Tués pour qu'on leur retire l'estomac, l'iléon, le côlon et le foie, 250 rats, 125 souris et 125 cobayes vont être utilisés, 100 d'entre eux sous anesthésie sans réveil et 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La procédure tient en deux gestes : un jeûne de moins de vingt-quatre heures sur grille, puis une anesthésie de moins de trente minutes suivie de la mise à mort. Le porteur décrit ces prélèvements comme une alternative à l'utilisation d'animaux vivants qui réduit le nombre d'animaux non-humains utilisés en recherche, alors que le projet consiste à en tuer 500 pour la produire. Les cellules et fragments d'organes obtenus alimenteront des études in vitro sur la physiologie digestive et des tests de candidats médicaments, chaque animal fournissant du matériel pour plusieurs conditions expérimentales.
Objectifs
Le projet vise à étudier la physiologie et la physiopathologie gastro-intestinal in vitro et ex vivo en isolant des cellules ou du tissu du tractus gastrointestinal chez le rongeur ou le cobaye. L'isolement des cellules gastriques ou l’utilisation d’organes isolés sont des techniques utiles dans le domaine de la recherche biomédicale pour explorer la physiologie et la pathologie du système gastrointestinal, ainsi que pour développer et tester de nouvelles thérapies médicamenteuses. Ces modèles cellulaires primaires et d’organes isolés permettent d'étudier les fonctions normales des cellules, telles que la sécrétion acide, la sécrétion de mucus, et d'autres processus liés à la digestion. Les études in vitro et ex vivo contribuent à la compréhension des mécanismes sous-jacents à des maladies gastrointestinales telles que les ulcères gastriques ou des troubles de la mobilité intestinale ou d’inflammation et évaluer les effets de médicaments potentiels sur la fonction gastrique. L’évaluation in vitro et ex vivo permet de se concentrer sur des mécanismes de signalisation spécifiques, ce qui peut fournir des informations importantes sur la régulation des processus cellulaires tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Les modèles cellulaires primaires et ex vivo avec des parties d’organes restent nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certains troubles gastriques pouvant être induits par exemple par une flore bactérienne délétères. De plus, ils permettent de réduire le nombre d'animaux utilisés en recherche et la sévérité des procédures qui leurs sont appliquées.
Procédures
Les animaux nécessitant une mise à jeun de moins de 24 heures seront hébergés sur grille. Les animaux prélevés seront préalablement placés sous anesthésie et analgésie (1 fois, moins de 30 minutes) avant euthanasie.
Impact sur les animaux
La mise à jeun de moins de 24 heures ainsi que la mise sur grille au lieu de litière sont les deux stress qui affecteront les animaux lors de cette procédure.
Devenir
La procédure nécessite de prélever différentes pièces anatomiques du système digestif (estomac, iléon, colon, foie …) des animaux en terminal , ne permettant pas leur maintien en vie.
Remplacement
L’utilisation de cellules primaires normales issues d’un contexte physiologiques ou des organes isolés peuvent permettre d’évaluer des modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques, ces modifications étant nécessaires pour les études d’efficacité de candidats médicaments. Ce modèle représente une alternative à l'utilisation d'animaux vivants (les études seront réalisées sur des cellules ou des tissus). Cependant, l'utilisation d'animaux est nécessaire pour collecter les cellules.
Réduction
Les cellules isolées pouvant être amplifiées, c’est-à-dire multipliées, ainsi un nombre limité d’animaux (avec un maximum de 10 et en moyenne 5 animaux par procédure) sera utilisé, et ces cellules pourront servir dans plusieurs études. Les tissus qui serviront pour tester différentes conditions expérimentales seront collectés à partir d'un même animal limitant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Ce projet dans son ensemble participe donc à la réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Le programme d’euthanasie (anesthésie et analgésie) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet au niveau d l’hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... à l’exception de la phase de mise à jeun où un enrichissement plus limité sera fourni sous la forme de jouets et de la présence de congénères.
Choix des espèces
La physiopathologie gastrointestinal présente des processus complexes impliquant une série de types et de mécanisme de signalisation cellulaire entrainant une prolifération cellulaire et une inflammation. Aujourd’hui encore, les rongeurs et cobaye demeurent essentiel à étudier ces processus et à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux sont largement décrits chez le rat, la souris et le cobaye. Nous utiliserons principalement des animaux sevrés, âge variant entre 3 semaines et 12 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.
Identification de molécules pour traiter un stress chronique imprévisible (CUS) chez la souris et évaluation du comportement 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Un projet qui vend à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques la validation in vivo de leur molécule antidépressive utilise 1 500 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère pour 1 250 d'entre elles. Pendant huit semaines, chaque animal reçoit un stress par jour, contention, stress olfactif, stress social, perturbation du rythme circadien, avant cinq jours d'isolement en cage individuelle pour mesurer sa préférence pour l'eau sucrée. Toutes sont tuées ensuite, pour mesurer la motilité de leur intestin et doser des marqueurs de dépression dans leur cerveau. Le porteur classe chaque stress isolé comme léger en raison de sa brièveté, et reconnaît que leur accumulation sur huit semaines relève de la classe sévère.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs -EU 1/2 et EU 2/2/). Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte 15% de la population. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables. De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression sont associés une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu’un déséquilibre de la flore intestinale. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.
Procédures
Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le second groupe (G2) subira ces stress pendant 8 semaines. Le troisième groupe (G3) subira le protocole de stress pendant 8 semaines et recevra un traitement antidépresseur connu. Ce groupe permet de comparer les effets des molécules à tester contre la dépression avec l’antidépresseur connu. Enfin, les souris du quatrième groupe (G4) subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple). Cette étape d'induction d'un stress chez l'animal s'effectuera dans l'EU ½. Après 8 semaines, une évaluation comportementale des souris sera effectuée dans l’EU 2/2. Le niveau d’anxiété des animaux, leur activité exploratoire, ainsi que leur état “dépressif” sera évalué au moyen de tests de comportement sur une période de 8 jours.
Impact sur les animaux
Les souris des groupes stressés ou CUS seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Ces animaux vont subir certaines contraintes d'une courte durée (une fois par jour, le matin). L’intensité de la nuisance de ces stress cumulés est modérée. De plus, le groupe stressé recevant le traitement avec l’antidépresseur de référence recevra une injection quotidienne tout le temps du protocole de stress (8 semaines). L’intensité de la nuisance de ces injections répétées est modérée. Le dernier groupe recevra par voie orale le traitement à tester pendant la durée du protocole. L’intensité de la nuisance de ces gavages sur 8 semaines est faible. Les animaux vont également subir des contraintes de courte durée pendant les tests comportementaux, et notamment lors d’un test de comportement au cours duquel les animaux seront placés dans une position inconfortable pendant quelques minutes. L’intensité de la nuisance de ce test est modérée. Lors du test de préférence au sucrose, les souris vont être placées en cage individuelle pendant 5 jours afin de mesurer leur consommation hydrique. L’intensité de la nuisance due à l’isolation des animaux pendant 5 jours consécutifs est modérée.
Devenir
Les souris seront ensuite mises à mort afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.
Remplacement
Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.
Réduction
Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. Deux des tests comportementaux peuvent être chacun considéré comme modérée, du fait de l’inconfort et de l’isolement nécessaire à leur exécution. Le temps de repos entre chaque test comportemental bien qu'important et suffisant pour permettre un retour à la normale de l’état des animaux, l'accumulation de l'ensemble de ces stress nous semble de classe sévère. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.
Choix des espèces
La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).
Evaluation de nouveaux traitements dans les modèles de colite induite chimiquement ou par des agents infectieux
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 2400
Perte de poids d'au moins 20 %, hypothermie, difficulté à respirer, automutilation, absence prolongée de réponse aux stimulus : les points limites retenus disent l'état attendu des animaux. 7 500 souris et 2 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 000 souris de plus dans des procédures d'un niveau modéré, tous tués ensuite pour prélever leurs organes. Une colite leur est provoquée par une administration orale, intrarectale ou intrapéritonéale, et le porteur indique qu'ils développeront des signes de douleur, perte de poids et prostration. Il s'agit d'évaluer des molécules, des fibres, des vitamines ou des minéraux, tous décrits comme sans danger, à raison de dix animaux par groupe, ce qui suppose plus de mille groupes expérimentaux pour atteindre 11 900 animaux.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une thématique générale d’évaluation de l’effet thérapeutique anti-inflammatoire de certaines molécules chez la souris ou le rat. Ces études permettront d’évaluer l’efficacité de traitements préventifs ou thérapeutiques sur l’inflammation ainsi que la compréhension des mécanismes associés aux modifications de l’immunité et de l'ensemble des bactéries intestinales de l’individu dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. En effet, le nombre de ces maladies telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse s’accroît depuis ces dernières années, en particulier chez les personnes de 20 à 30 ans et chez les adolescents. En Europe, 2.2 millions de personnes sont affectées par les maladies inflammatoires intestinales. Malgré une évolution clinique et une recherche intensive, les causes sont encore mal connues. Il a été clairement établi que ce sont des maladies multifactorielles impliquant des facteurs génétiques, bactériens et environnementaux. Les patients atteints de ces pathologies sont caractérisés également par un déséquilibre intestinal. L’utilisation des traitements actuels ne permet pas de guérir de ces maladies et certains patients deviennent résistants aux traitements actuellement sur le marché. Les travaux envisagés comprennent; l’évaluation de nouvelles molécules, l’évaluation des conditions nutritionnelles, l'apport de fibres alimentaires, vitamines ou minéraux, seuls ou en combinaison, tous considérés comme sans danger. Ces évaluations pourront être réalisées dans des modèles d'inflammation intestinale qui feront l'objet de procédures et qui seront choisies en fonction de leur pertinence pour le mécanisme d'action ciblé par la molécule à tester.
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements encore plus adaptés et plus personnalisés des maladies digestives. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les maladies digestives qui sont des maladies de plus en plus présentes.
Procédures
Les inductions des colites se feront par differents modes d'administration en fonction des procédures : soit une seule administration par voie orale, intraréctale ou intra-péritonéale. Aucun prélèvement sur animal vigile ne sera effectué et il n'y aura aucune procédure chirurgicale. Les prélèvements sur les animaux se feront uniquement post mortem.
Impact sur les animaux
Du fait de l'administraion aigüe ou chronique de produits induisant une colite, les animaux vont développer des signes de douleurs (perte de poids, prostration). Ces signes seront surveillés pour chaque expérimentation. Les types d'administration (intraréctale, gavage, injection) sont susceptibles également de créer une douleur légère. Ces paramètres seront surveillés en observant l'animal quotidiennemnt dans sa cage.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animaux seront mis à mort selons les réglementations en vigueur afin de prélever les organes d’intérêt
Remplacement
Les interactions entre le microbiote, la barrière intestinale et le système immunitaire sont indispensables pour l’étude des mécanismes infectieux et inflammatoires. L’étude des interactions de nouveaux médicaments ainsi que leur efficacité et l’absence d’effets secondaires implique de disposer d’un modèle mimant au mieux l’écosystème intestinal humain, tenant compte des différences d’absorption, de biodisponibilité et de composition des microbiotes et de l’état inflammatoire induit par la colite et également de modèles mimant spécifiquement la maladie ciblée ainsi que les lésions ou symptômes associés. Bien que des sélections et modélisations in vitro se réalisent en amont, le modèle rongeur reproduit la physiologie des muqueuses digestives humaines pour analyser la dissémination des produits dans les organes cibles, les processus de biotransformation et de détoxification de l’hôte, avec sa composante métabolique et immunitaire, pertinents pour étendre les conclusions à l’Homme. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte necessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres modèles expérimentaux n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'informations.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 10, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes). Afin de pouvoir conclure à l'efficacité du traitement, ce protocole n'est mis en place qu'avec des molécules qui ont été validées sur des études in vitro précédentes.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (intraréctales, intraveineuses etc) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l'étude. Les animaux trouvés dans des conditions moribondes ainsi que les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse seront mis à mort. Les points limites sont définis selon les Directives de l'OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l'animal d'accéder à la nourriture ou à l'eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou plaie de la plaie etc. Un tableau de suivi a été mis en place en adaptant les points limites au seuil le plus bas. Si les signes persistent au bout de 24H, l'animal sera sorti de la procédure et mis à mort. Afin de réduire le stress des animaux, leur milieu sera enrich avec du matériel de nidification afin qu'ils puissent se cacher et ronger. La sociabilisation avec l'expérimentateur sera plus importante pour les animaux isolés dans leur cage. Les procédures seront réalisées dans une zone calme, différente de la pièce d'hébergement. Pour limiter le stress et l'angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l'expérimentateur) avant le début de l'étude. L'objectif est de préserver le bien-être des animaux; la satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d'éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.
Choix des espèces
La souris et le rat représentent les modèles les plus accessibles et les plus pertinents pour modéliser la physiologie digestive des vertébrés supérieurs à sang chaud; en particulier, le système immunitaire complexe et la diversité des microbiotes sont relativement proches. De plus les modèles de colite sont validés dans ces espèces. Le choix de l'espèce rat ou souris dépendra de l'efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s'avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l'autre espèce afin de montrer une efficacité espèce dépendante. Les animaux seront commandés en fonction de leur poids entre 22 - 25g soit environ 10 semaines. Nous avons besoin d'animaux adultes avec un poids assez élevé contenu de la perte de poids qui sera engendrée par l'induction des colites.
Exploration de l’efficacité d’un inhibiteur de nécrose régulée dans un modèle de lésions hépatiques (chirurgie et greffe du foie) chez le modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une transplantation du foie, ou une interruption puis une reprise de la circulation artérielle hépatique, est pratiquée sur 71 cochons de 30 à 35 kilos. Cinquante d'entre eux relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, seize sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, cinq relèvent d'un niveau modéré. Chacun subit des biopsies du foie au poinçon de quatre millimètres avant, pendant et après l'ischémie, puis des prélèvements de sang une heure avant l'opération et à trente minutes, une heure, trois heures et chaque jour après la greffe, en cage individuelle. L'ensemble teste une molécule candidate contre les lésions d'ischémie-reperfusion, les cochons donneurs de foie étant tués immédiatement après la chirurgie et les receveurs sept ou quatorze jours après leur réveil.
Objectifs
L’ischémie correspond à la diminution ou à l’arrêt de la circulation artérielle dans un tissu ou organe, tandis que la reperfusion correspond à la reprise de cette circulation. Les lésions d'ischémie/reperfusion (IRI) hépatiques sont une complication majeure de la chirurgie du foie, notamment la résection (enlèvement) hépatique, la transplantation hépatique et la chirurgie traumatique. Ces événements physiopathologiques influencent considérablement le pronostic de la fonction hépatique et une méthode de prévention ou de traitement efficace fait toujours défaut. La mort cellulaire est un indicateur pathologique constant de l'IRI. Par conséquent, il semble probable que l’inhibition de la cascade de mort cellulaire associée à l'IRI pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique actuellement non satisfaite. L’objectif de ce projet est de tester les effets d’une nouvelle molécule (SBL01) appartenant à la famille des inhibiteurs de mort cellulaire. Au cours de ce projet, SBL01 sera évaluée comme candidat médicament pour le traitement des lésions hépatiques d’ischémie-reperfusion, sur des modèles d’ischémie hépatique et transplantation chez le modèle porcin.
Bénéfices attendus
Il n’existe pas actuellement de petites molécules proposées pour la protection du foie ou des greffons contre les lésions d’ischémie-reperfusion. La molécule d’intérêt, candidat médicament que nous souhaitons tester, trouverait de nombreuses applications dans le domaine de la chirurgie hépatique et de la transplantation. La plupart des solutions en développement se focalisent davantage sur les modalités de conservation des greffons dans l’objectif d’améliorer l’oxygénation des organes. La solution proposée dans ce projet, c’est-à-dire l’inhibition de la mort cellulaire par administration (supplémentation des solutions ou par voie systémique) d’une molécule thérapeutique serait pionnière.
Procédures
Des échantillons de sang de 0,5-1 mL seront prélevés 1h avant la chirurgie du foie, puis 30 min, 1h, 3h, et chaque jour après la transplantation. Des biopsies hépatiques seront prélevées à l'aide d'un poinçon stérile de 4 mm avant l'ischémie (arrêt de la circulation artérielle), à la fin de l'ischémie et après la reperfusion (reprise de la circulation artérielle), sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Douleur/lésion physique après intervention chirurgicale. Toxicité éventuelle du produit injecté pouvant induire un stress physique. Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement en cages individuelles, même si les animaux ont toujours des contacts visuels et auditifs avec des congénères.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort soit immédiatement après chirurgie sous anesthésie générale (animaux donneurs de foie), soit 7 ou 14 jours maximum après le réveil post-chirurgie (animaux receveurs et selon la phase du protocole) afin de pratiquer des prélèvements post-mortem à des fins d'analyses biologiques.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’une part d’évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule pour atteindre une concentration plasmatique efficace qui permettra de réduire les lésions d’ischémie/reperfusion hépatiques (i.e. arrêt et reprise de la circulation artérielle) en inhibant la cascade de mort cellulaire associée, et d’autre part de tester les effets in vivo de cette molécule chez le modèle porcin au travers de deux modèles d’ischémie hépatique et transplantation. Cette nouvelle molécule doit impérativement être testée sur un modèle in vivo pertinent avant de l’appliquer à une étude clinique chez l’humain. Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain.
Réduction
Comme précédemment validé et publié, un effectif de 5 animaux par traitement représente le strict minimum nécessaire pour observer des différences significatives entre groupes expérimentaux dans le domaine des modèles d’ischémie (arrêt de la circulation artérielle) et de transplantation hépatique, mais nous avons décidé d’inclure 8 animaux par groupe/traitement afin de garantir une puissance statistique satisfaisante tout en palliant d’éventuels imprévus.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par des chirurgiens spécialistes de la transplantation hépatique chez l’humain, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Une prise en charge de la douleur per- et post-opératoire sera effectuée avec un traitement analgésique adapté à l'espèce et aux procédures. Des points limites précis ont été établis et une grille optimisée pour l'évaluation de la douleur et du bien-être animal sera utilisée.
Choix des espèces
Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont particulièrement proches de ceux de l’humain. Porcs en croissance (30-35 kg)
Identification de molécules pour traiter un stress chronique imprévisible (CUS) chez la souris et évaluation du comportement 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
La finalité annoncée est d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, la validation in vivo de leur molécule comme antidépresseur. 1 500 souris vont être utilisées, 1 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour mesurer la motilité intestinale et des marqueurs cérébraux. Chacune subit un stress différent par jour pendant huit semaines, contention, stress olfactif, stress social, stress environnemental, perturbation du rythme circadien, puis huit jours de tests comportementaux dont un test de préférence au sucrose imposant cinq jours d'isolement et un autre, non nommé, plaçant l'animal dans une position inconfortable. Le porteur qualifie chaque stress de léger pris isolément, et l'accumulation de l'ensemble de classe sévère.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs -EU 1/2 et EU 2/2/). Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte 15% de la population. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables. De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression sont associés une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu’un déséquilibre de la flore intestinale. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.
Procédures
Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le second groupe (G2) subira ces stress pendant 8 semaines. Le troisième groupe (G3) subira le protocole de stress pendant 8 semaines et recevra un traitement antidépresseur connu. Ce groupe permet de comparer les effets des molécules à tester contre la dépression avec l’antidépresseur connu. Enfin, les souris du quatrième groupe (G4) subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple). Cette étape d'induction d'un stress chez l'animal s'effectuera dans l'EU ½. Après 8 semaines, une évaluation comportementale des souris sera effectuée dans l’EU 2/2. Le niveau d’anxiété des animaux, leur activité exploratoire, ainsi que leur état “dépressif” sera évalué au moyen de tests de comportement sur une période de 8 jours.
Impact sur les animaux
Les souris des groupes stressés ou CUS seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Ces animaux vont subir certaines contraintes d'une courte durée (une fois par jour, le matin). L’intensité de la nuisance de ces stress cumulés est modérée. De plus, le groupe stressé recevant le traitement avec l’antidépresseur de référence recevra une injection quotidienne tout le temps du protocole de stress (8 semaines). L’intensité de la nuisance de ces injections répétées est modérée. Le dernier groupe recevra par voie orale le traitement à tester pendant la durée du protocole. L’intensité de la nuisance de ces gavages sur 8 semaines est faible. Les animaux vont également subir des contraintes de courte durée pendant les tests comportementaux, et notamment lors d’un test de comportement au cours duquel les animaux seront placés dans une position inconfortable pendant quelques minutes. L’intensité de la nuisance de ce test est modérée. Lors du test de préférence au sucrose, les souris vont être placées en cage individuelle pendant 5 jours afin de mesurer leur consommation hydrique. L’intensité de la nuisance due à l’isolation des animaux pendant 5 jours consécutifs est modérée.
Devenir
Les souris seront ensuite mises à mort afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.
Remplacement
Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.
Réduction
Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. Deux des tests comportementaux peuvent être chacun considéré comme modérée, du fait de l’inconfort et de l’isolement nécessaire à leur exécution. Le temps de repos entre chaque test comportemental bien qu'important et suffisant pour permettre un retour à la normale de l’état des animaux, l'accumulation de l'ensemble de ces stress nous semble de classe sévère. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.
Choix des espèces
La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).
Evaluation de l’effet anti-inflammatoire de composés dans un modèle murin dans le cadre du traitement de la rectocolite hémorragique et de la maladie de Crohn
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
Quarante-deux jours d'administration quotidienne par gavage ou par injection, et une colite entretenue par un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des cycles de cinq jours espacés de neuf : 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le produit altère le côlon, provoque des diarrhées et une perte de poids d'environ 10 % malgré une alimentation normale. La molécule testée a déjà passé un essai de phase 2 chez des patients atteints de rectocolite hémorragique et se trouve en phase 3, et il s'agit ici de tester son association avec d'autres composés en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le porteur retient des souris de neuf semaines, âge qu'il décrit comme optimal pour une colite ni trop importante ni trop mineure.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (rectocolite hémorragique et maladie de Crohn) touchent plus de 0,3% de la population mondiale et sont de plus en plus fréquentes avec l'industrialisation des pays. Les traitements existants ne sont parfois pas efficaces ou non-suffisamment efficaces avec une très grande variabilité au sein des malades. Ainsi, la proposition de nouvelles thérapies est nécessaire. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2 et est actuellement évaluée dans un essai de phase 3. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de l’associer avec d’autres composés déjà sur le marché ou en développement, pour améliorer la réponse des patients au traitements.
Bénéfices attendus
La démonstration de l’intérêt d’une association de notre molécule avec d’autres thérapies existantes, permettra d’offrir de nouvelles possibilités aux malades qui ne répondent pas aux traitements actuels des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.
Procédures
Les animaux seront exposés à l'ingestion d'un produit chimique ajouté à l'eau de boisson sur des périodes de 5 jours entrecoupées de 9 jours. Ils recevront un traitement par voie orale ou par injection (intrapéritonéale ou intraveineuse) de façon quotidienne sur une durée de 42 jours maximum. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte faible en environ 10 secondes. Une prise de sang sera réalisée à la fin du protocole afin d'analyser différents paramètres biologiques. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et est réalisée en maximum 30 secondes. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé chimique qui mime une inflammation du colon chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération du colon provoquant une inflammation suivie par une perte de poids de l’ordre de 10% chez les souris, malgré une alimentation et une hydratation normale, et des diarrhées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.
Remplacement
Nous voulons étudier le traitement d’une inflammation du colon et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il permet d’étudier les effets sur un organisme vivant dans son intégralité étant donné que ce traitement a vocation d’être ensuite utilisé chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats solides garantis par des analyses statistiques. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle d’inflammation murine du colon et les données recueillies dans la littérature.
Raffinement
La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur grâce à l'utilisation d'une grille de score, permettant d'évaluer l'atteinte des points limites. L'administration répétée des composés par voie orale ou injection sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide, ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser leur hydratation.
Choix des espèces
Le modèle murin d’inflammation du colon est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide et non invasive (ajout d’un composé chimique dans l’eau de boisson) tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets des composés thérapeutiques.
Evaluation des effets de candidats médicaments dans un modèle de colite induite chez la souris par administration orale de DSS
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Du dextran sulfate de sodium versé dans l'eau de boisson pendant quatre à dix jours, une phase de rétablissement, puis le cycle recommencé jusqu'à trois fois sur soixante jours : 600 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'inflammation intestinale provoque une diarrhée, un mal-être général et une cachexie, effets que le porteur donne pour certains et "nécessaires" puisqu'il s'agit d'un modèle pathologique. Entre-temps les souris reçoivent des candidats médicaments sur animal vigile et jusqu'à un prélèvement sanguin par jour. Toutes sont tuées à la fin de chaque expérience pour prélever les organes et mesurer les dommages intestinaux.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) : maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, se caractérisent par l’inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire. Les MICI touchent principalement les jeunes adultes (20-30 ans). En France, plus de 200'000 personnes sont concernées. Ces maladies se présentent sous forme de crises avec des périodes de rémission. Chez environ 15% des patients, les crises sont sévères : leur intensité peut imposer l’hospitalisation, l’arrêt de l’alimentation, un traitement par perfusion pendant quelques jours ou encore un recours à de la chirurgie. Bien qu’il n’existe pas de traitement pour guérir ces maladies, les médicaments actuels permettent de mieux contrôler la maladie et d’améliorer la qualité de vie des patients. Malheureusement, le plus souvent, les traitements finissent par être inefficaces et il faut alors changer. De plus, environ 20% des patients développent des manifestions extérieures au système digestif telles que de l’arthrite, du psoriasis. C’est pour cela qu’il est important de comprendre ces pathologies et de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de stopper l’avancée de la pathologie et améliorer la vie des patients. Ce projet a pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant avoir un effet bénéfique dans les MICI dans un modèle de colite induite par DSS (dextran sodium sulfate) chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont: 1- une meilleure compréhension des mécanismes d'action impliqués dans les MICI. 2- le développement de nouveaux médicaments pour traiter ces pathologies (=démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée et d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques).
Procédures
Dans ce modèle, l'agent inducteur de la colite sera du dextran sodium sulfate (DSS) donnée par voie orale, dans l'eau de boisson (1-6%), pendant 4 à 10 jours. Le rétablissement post-induction sera évaluée. Durant cette période, aucun DSS ne sera présent dans les biberons. La phase de rétablissement durera entre 2 jours à 2 semaines après le pic d'inflammation. Afin de mimer des crises et donc, une inflammation chronique, des cycles d'induction et rétablissement pourront être réalisés (3 cycles maximum et total de 60 jours maximum). Les candidats médicaments seront administrés aux animaux vigiles par différentes voies, avec 1 à 3 minutes par administration (douleur équivalente à une piqure d'aiguille). Si des prélèvements de sang doivent être réalisés en cours d'étude, ils seront effectués sur animal vigile ou sous anesthésie (environ 2min par prélèvement). Les prélèvements de sang seront de maximum une fois par jour. En cas de prélèvement sanguin terminal, il se déroulera sous anesthésie et analgésie locale (durée entre 4 et 6 minutes). De façon mineure, d'autres nuisances sont possibles. En effet, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer les composés à tester peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.
Impact sur les animaux
L'inflammation intestinale et les dommages transitoires ou permanents sur les intestins vont provoqué un mal-être générale, de la diarrhée et une cachéxie. De façon mineure, d'autres nuisances sont possibles. En effet, lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie ou l'administration d'un candidat médicament, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Enfin, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer les composés à tester peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience afin de procéder à des prélèvements d'organes et donc, d'évaluer les effets des candidat médicament sur l'inflammation digestives et systèmiques et les dommages intestinaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et ses conséquences locales sur le tractus digestifs et systémiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’Homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, les rongeurs dont la souris est l'espèce la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Compte tenu de la variabilité du modèle, le nombre d’animaux minimal et suffisant pour réaliser une analyse statistique est estimé à 10 par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un hébergement en groupe, • la détermination des points limites. • Un suivi quotidien du poids et des signes cliniques des animaux (suivi du poids, consistance des fèces, état physique: aspect pelage + yeux et activité motrice). S'agissant d'un modèle pathologique, l'apparition de signes cliniques est certaine et nécessaire. Cependant, un recours aux procédures d’euthanasie sera effectué dès l'atteinte des points limites.
Choix des espèces
La souris fait partie des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, les rongeurs et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques (plus de 90% de gènes en communs). De plus, les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles réproductif et de vie courts. Par conséquent, la souris est la plus couramment utilisée dans la recherche médicale et notamment, dans les modèles d'inflammation intestinales. Animaux adultes (âge supérieur à 8 semaines). Ce projet n'a pas pour objectif d'étudier les effets des candidats médicaments sur l'animal à d'autres stades de développement. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin chez l'Homme touche principalement des personnes adultes (20-30 ans).
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Entre 12 et 20 semaines d'âge, des rats porteurs de mutations d'un gène lié à une maladie neurodéveloppementale rare, et des rats témoins, passent une batterie de tests : activité locomotrice et anxiété, coordination, force musculaire, troubles compulsifs, apprentissage et mémoire, fonction musculaire sous anesthésie, avec une prise de sang et un prélèvement de fèces sous contention. 96 rats, dont 64 mutants et 32 témoins, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet doit vérifier si ces lignées reproduisent les symptômes de la maladie humaine, et pour l'une des mutations le porteur parle d'un "léger phénotype" chez des mâles plus chétifs, plus agressifs, qui peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Les tests ne sont désignés que par ce qu'ils mesurent. Le porteur évoque un test "impliquant de l'eau" seulement pour décrire le séchage des rats, et cite en passant, pour une partie d'entre eux, une perfusion au paraformaldéhyde absente de la description des procédures.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype : les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention rapide durant quelques secondes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Effet de la modulation du microbiote intestinal par antibiothérapie sur les cellules entéroendocrines de souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.
Objectifs
Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.
Bénéfices attendus
Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.
Procédures
Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.
Impact sur les animaux
Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques
Remplacement
L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.
Rôle du biofilm dans la survenue des récurrences de l’infection à Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rendues sensibles à l'infection par une antibiothérapie qui altère leur microbiote, 360 souris reçoivent par gavage la bactérie Clostridioides difficile puis quatre injections intrapéritonéales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet déclaré est de savoir si les biofilms de la bactérie expliquent les rechutes chez les patients, en vue de stratégies anti-biofilms. Le porteur annonce des points limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de la souffrance sans préciser lesquels, et justifie huit animaux par groupe pour cinq temps de prélèvement, ce qui laisse l'effectif de 360 souris sans explication.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie première cause de diarrhée nosocomiale chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées, la plus connue étant la colite pseudomembraneuse, associée à 3% de mortalité). Depuis les années 2000, l'impact de l'infection à Clostridioides difficile (ICD) dans les hôpitaux a considérablement augmenté avec une multiplication par 5 de sa prévalence, des taux de rechutes plus élevés jusqu'à 48% et une augmentation des formes graves (2,5 fois) et de la mortalité (3 fois). Par conséquent, les ICD ont un impact économique majeur sur la santé publique avec un coût direct de plus de 4 milliards d'euros/an dans l'UE, une charge financière qui devrait doubler dans la prochaine décennie en raison de la population vieillissante. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant les principales étapes de l'ICD et notamment la persistance de C. difficile au niveau intestinal. Cette persistance pourrait être associée à la formation de biofilms mono ou multi-espèces responsables des rechutes des ICD. Dans ce projet, notre but est d’étudier le rôle du biofilm dans la persistance de C. difficile et la rechute des ICD en utilisant le modèle murin.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d'évaluer le rôle des biofilms de C. difficile dans la rechute des ICD. Si les biofilms contribuent aux rechutes des ICD, le projet permettra de développer des stratégies anti-biofilms contribuant à la diminution des rechutes au niveau clinique.
Procédures
Le modèle d'infection des souris par la bactérie Clostridioides difficile nécessite un gavage oral de la bactérie (réalisé en moins de 5 secondes). Les souris recevront 4 injections intrapéritonéales au cours du projet (réalisées en moins de 5 secondes et avec une qualification de gravité légère).Aucune procédure chirurgicale n'est nécessaire dans le cadre du projet.
Impact sur les animaux
Les souris conventionnelles ne deviennent sensibles à l'infection par C. difficile qu'en cas de dysbiose intestinale obtenue après antibiothérapie. L'infection par C. difficile entraine des diarrhées résolutives en quelques jours et une perte de poids légère (
Devenir
Le prélèvement d'organes à des fins expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro permettent la sélection de la souche de C. difficile productrice de biofilms. Il en est de même pour la souche mutante non productrice de biofilms. Bien que les organoïdes représentent un modèle très intéressant pour l’étude des interactions d’un pathogène avec les cellules intestinales, il n’est pas encore possible d’introduire un microbiote dans les organoïdes et d’étudier ainsi l’impact du microbiote perturbé dans les infections aiguës et récurrentes de C. difficile. De plus, le projet a une durée de 40 jours et la viabilité de C. difficile au sein des organoides ne peut excéder quelques heures.
Réduction
Les différentes conditions sont testées le plus possible ensemble afin de ne pas avoir à démultiplier les animaux utilisés comme contrôles. 8 animaux par groupe seront nécessaires par temps de prélèvement (5 temps). En effet, les analyses statistiques seront faites par un test de Mann-Whitney pour échantillons non appariés, avec pour paramétres une puissance de test de 0.9 et un effet size de 1.5.
Raffinement
Les litières seront changées quotidiennement, les animaux pouvant avoir la diarrhée. Des points limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Différents modèles animaux (souris et hamsters) ont été utilisés pour étudier l'infection à C. difficile. Le modéle le plus adapté pour étudier la rechute des infections à C. difficile est le modéle de souris conventionnelles, les hamsters succombant à l'infection en 48 h. Suite à une antibiothérapie visant à altérer le microbiote digestif, l'administration de C. difficile par voie orale permet une implantation reproductible et maîtrisée de la bactérie au niveau du tube digestif. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteint l'âge adulte et répondant au modèle d'infection par la bactérie.
Evaluation de l’efficacité d’une formulation administrée par voie orale à 2 doses sur le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tués à l'issue d'une procédure unique pour qu'on prélève leur côlon et les matières fécales qu'il contient, 40 rats vont être utilisés dans cette étude. Trente-deux d'entre eux subissent sous anesthésie une induction d'ulcération colique de quarante minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les huit autres recevant une substance neutre. Suit un gavage quotidien pendant six jours, puis cinq minutes en isolement dans un dispositif mesurant l'activité exploratoire pour évaluer la douleur ressentie. Le porteur décrit un inconfort et une douleur "notoires", avec perte de poids et posture prostrée, et indique qu'aucun antidouleur ne sera administré parce qu'il interférerait avec les résultats de l'étude.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité distale du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’une formulation ayant des propriétés anti-inflammatoires et antidouleur, administré par voie orale à 2 doses, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets d’une formulation à 2 doses différentes chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec cette nouvelle formulation sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec cette formulation, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 32 des 40 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 8 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 6 jours sur les animaux vigiles, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. Le traitement avec la formulation à évaluer devrait limiter cet inconfort et cette douleur ressentie et donc les effets sur les différents paramètres mesurés, tout comme le traitement anti-inflammatoire intestinal de référence comme nous l’avons démontré dans de précédentes études. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps..
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 40 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner la formulation ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal..
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront placés à 2 par cage dans des cages transparentes avec des briques d’Aspen et du papier kraft comme enrichissement, et ils auront accès à la nourritue et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur de la formulation testée sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires de la formulation qui sera testée, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale, et pour les études sur le comportement. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative.
Développement de modèle murin de souffrance hépatocytaire et implication de FAT10/UBD
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
5 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 448 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant subir plusieurs prélèvements de sang par incision de la queue espacés de quinze jours, puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal. Un agent chimique administré de façon chronique installe une fibrose puis une cirrhose du foie, avant qu'une infection ne fasse basculer les animaux du stade compensé au stade décompensé, que le porteur décrit comme irréversible. Les régimes obésogènes utilisés peuvent faire apparaître des nodules du foie évoluant vers un carcinome, et il reconnaît que cela peut causer des douleurs, tout en écrivant que l'injection chronique de l'agent fibrosant, elle, n'en provoque pas. Les souris sont retirées du protocole et tuées lorsqu'elles perdent 15 % de leur poids ou présentent prostration, poil hirsute, vocalisation ou morsures.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie comprennent un large spectre de maladies pour lesquelles il n’existe pas de thérapies pharmacologiques à l’heure actuelle. Ces maladies chroniques se caractérisent le plus souvent par un état inflammatoire chronique du foie qui entraîne une altération de la fonction et de l’identité des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, conduisant au développement d’un état fibrotique pouvant évoluer juqu’au stade de Cirrhose, voir d’hépatocarcinome (HCC). Les causes majeures de ces pathologies sont les MAFLD (Metabolic dysfunction Associated Fatty Liver Disease), les maladies du foies liés à l’alcool ou encore les hépatites virales et bactérienne. La cirrhose hépatique est un stade important du développement de la fibrose hépatique qui est retrouvée dans la majorité de ces pathologies hépatiques et qui représente le stade irréversible de la maladie. Un événement précipitant (infection, alcool) peut chez les patients cirrothiques entrainer une perte aigüe de la fonction hépatique défine comme ACLF (Acute on Chronic Liver Failure). L’absence de thérapies efficaces démontre l’importance de mieux comprendre et caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de ces défaillances hépatocytaires. De nombreuses études de la littérature, ainsi que des données prélimiaires obtenues au laboratoire ont montré le rôle important de la protéine FAT10 dans le développement et l’installation de ces pathologies. En effet, il a été démontré que FAT10 était surexprimé dans le foie de patients atteints de ASH (Alcooholic steatohepatitis), de MASH (Metabolic dysfunction Associated to SteatoHepatitis) et d’hépatite virale. Des résultats d’études menées au laboratoire ont montré que FAT10 interagit avec le récepteur nucléaire, Pparα (, afin d’inhiber son action sur le métabolisme des lipides et l’inflammation et contrôlait également la senescence de l’hépatocyte au cours de la MASH. Ainsi, l’objectif de ce projet de recherche est de déterminer si la modulation d’expression de FAT10 module la souffrance hépatocytaire et la progression des maladies chroniques du foie, tels que la MASH, la ASH (Alcoholic SteatoHepatitis), l’ACLF ou encore la réponse hépatique à une infection bactérienne (Sepsis)
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence le rôle de FAT10 dans la souffrance hépatocytaire et le développement et la progression de la MASH et l’ACLF. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlés par FAT10 dans ces pathologies pourrait permettre de déterminer FAT10 comme une cible thérapeutique intéressante pour soigner les pathologies hépatiques, où à l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie.
Procédures
Des prélévements sanguins seront réalisés avant le début des différents protocoles ou en fin de protocoles, soit après légère incision de la queue pour des prélévements au cours du protocole, alors que des prélévements en rétro-orbitaire seront réalisés en fin de protocoles avant l’euthanasie des animaux. L’ensemble de ces prévelements sera réalisé sur animal anesthésié par isoflurane, sauf au moment des différents tests métaboliques (GTT, ITT, PTT) car l’utilisation d’un anesthésique perturbe le métabolisme de l’animal. Sur un même protocole, les souris pourront subir plusieurs prélévements sanguins à la queue avec au moins 2 semaines de délai entre deux prélévements. Pour d’autres protocoles, des injections intra-péritonéales ou gavages seront réalisé sur animaux vigiles. Pour finir, les souris seront anesthésiées, suivi immédiatement d’une mise à mort pour des prélévements d’organes.
Impact sur les animaux
La lignée C57BL6/J utilisée dans nos différentes procédures ne présente aucun probléme physique ou physiologique. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en œuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. L’utilisation de régimes induisant la MASH chez l’animal peut conduire à l’apparition de nodules hépatiques pouvant évoluer vers un carcinome hépatique pouvant causer des douleurs à l’animal au cours du protocole. La mise en place de régimes obésogènes dans un modèle murin peut également entrainer des problèmes de prise alimentaire et donc le développement de faim et de malnutrition de l’animal. L’utilisation de modèles permettant le développement de la souffrance hépatocytaire et notamment les modèles qui permettent d’étudier l’ACLF nécessitent l’administration chronique d’un agent chimique qui permet d’induire la fibrose hépatique et la cirrhose, suivi d’un épisode infectieux qui va permettre de passer d’un stade compensé (asympotomatique) à un stade décompensé (stade irréversible). Il est bien établi que l’injection chronique de l’agent chimique n’induit pas de douleur à l’animal. L’épisode infectieux étant susceptible d’entrainer des réactions inflammatoires avec possibilités de fièvre et d’autres symptomes de souffrance de l’animal, elle sera effectuée le matin afin de pouvoir effectuer une observation accrue de l’animal le jour de l’infection. L’ensemble des procédures vont également nécessiter la prise des animaux en contention, pouvant provoquer un stress léger à l’animal. Ainsi, pendant l’ensemble de la durée de l’étude, le bien-être des animaux sera estimé quotidiennement et l’observation de signes de douleurs ou de mal-être entraînera la sortie du protocole de l’animal et sa mise à mort. Une attention particulière sera portée aux paramètres cliniques définissant les points limites de nos expériences : 1) perte de poids de 15% et 2) modification de l’apparence physique et du comportement (prostation, infection, poil hirsute, vocalisation et comportement agressif avec morsure).
Devenir
A l’issus des différentes procédures mise en place dans ce projet de recherche, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Ce projet de recherche est mis en place à partir d’études préliminaires réalisée sur des lignées cellulaires. Ces études ont montré un rôle important de la protéine FAT10 dans les cellules du foie. Cependant, les maladies du foie associées à une dysfonction hépatique sont des pathologies complexes impliquant de nombreux organes autres que le foie. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal (modèle murin) nous permettra de reproduire au mieux la physiopathologie et de mieux comprendre le rôle clé joué par la protéine FAT10 dans la souffrance hépatocytaire, ainsi que le développement et la progression des maladies chroniques ou aïgue du foie.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum, sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. De plus, une analyse appronfondie de la littérature permet également d’éviter des répétitions d’expériences inutiles.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum lorsqu’ils ne sont pas nourris avec un régime alimentaire induisant un contexte physiopathologique. Si les animaux ne sont pas nourris ad libitum, une vigilance accrue sera accordée à la quantité de nourriture restante dans la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons. La définition précise des points limites précoces, ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant tout le protocole permet de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de la souris. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espéce que nous avons choisi car de nombreuses données de la littérature sont disponibles sur ce modèle d’étude. De plus, cette espéce est fréquemment utilisée pour étudier les pathologies telles que la MASH ou l’ACLF. Elle présente de nombreux avantages : facilité d’élevage, possibilités d’utiliser des modéles génétiquements modifiés et sont sensibles aux régimes alimentaires et aux traitements pharmacologiques induisant la MASH et l’ACLF. Les souris seront utilisées à l’âge adulte de 12 semaines car les souris adultes offrent une une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions des pathologies métaboliques via un régime « spécial » ou des pathologies caractétisées par une souffrance hépatocytaire induite par des stimulations chimiques.