Troubles gastrointestinaux

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal boit de l'eau contenant des ions perchlorates pendant quatre mois, avant l'induction d'une colite par instillation intra-colique, provoquant perte de poids et d'appétit sur deux jours. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré car il fausserait les résultats, et que les animaux souffrant trop seront isolés ou tués. Il présente cette étude comme "exploratoire", préalable à un projet "plus complet" sur le lien entre pollution et maladie de Crohn.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. La France est un pays fortement agricole et un des plus utilisateur de pesticides en Europe. Un cluster de sur-prévalence de la MC est notamment situé dans le nord de la France, région très sujette aux épandages massifs de produits phytopharmaceutiques (PP). Depuis quelques années une nouvelle préoccupation autour des effets santé des ions perchlorates est en train de naître. Ces ions sont des contaminants de l'eau de boisson et sont notamment issus de l'ionisation en milieu aqueux des perchlorates d'ammonium et de potassium issus principalement de la dégradation d'anciennes mines et munitions issus de la guerre mais peuvent provenir également de rejets industriels. Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire sur l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive. L’objectif de cette étude exploratoire est de pouvoir répondre à cette demande avant de redéposer un projet plus complet.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment que peu d'information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données essentielles et importantes concernant un potentiel effet pro-oxydant et pro-inflammatoire des ions perchlorates sur le système digestif. D'autre part, le développement d'une colite expérimentale chez des animaux traités ou non par les ions perchlorates apportera des données supplémentaires et capitales sur la capacité de ces ions à modifier le profil inflammatoire colique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des ions perchlorates de sodium dans l'eau de boisson pendant 4 mois consécutilfs. Ce mode d'administration ne génère aucune perturbation dans le bien-être des animaux. Après les 4 mois d'administration des ions perchlorates, nous induirons une colite expérimentale chez certains groupes d'animaux comme décrit dans le protocole expérimental. Ce modèle de colite est un modèle inflammatoire d'intensité modérée d'une durée de 3 jours limitant au maximum les potentiels effets délétères chez les animaux. Ce modèle est parfaitement maîtrisé par l'expérimentateur. Une perte de poids et d'appétit est observée au cours des deux premiers jours de colite. A l'issue des 3 jours de colite, les animaux sont mis à mort pour prélèvements tissulaires comme décrits précédemment.

Impact sur les animaux

Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 16 semaines. La procédure est qualifiée de légère. Le modèle de colite expérimentale est un modèle de colite très modérée. La procédure est qualifiée de modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée. L'administration du TNBS se fait par l'intermédiaire d'un capillaire en plastique inséré dans le colon à 5 cm de l'anus. Cette administration ne dure qu'environ 2 min et se fera sous anesthésie. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage respective et surveillés régulièrement pendant les heures suivant la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale pour les prélèvements de sang et d'organes ainsi que l'analyse ultérieure des marqueurs d'intérêt.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité chez de jeunes animaux soumis ou non à un polluant environnemental administré par voie orale (eau de boisson), impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=96; n=12/groupe expérimental) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles et femelles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure. De ce fait, 12 animaux mâles et femelles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique, cela aurai pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables. Les animaux seront suivi quotidiennement avec une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose induira une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat, excepté une perte d'appétit et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas où nous observerons des signes de douleur trop importants, l'animal sera isolé de ses congénères, voire mis à mort. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années pour cette espèce. Notre hypothèse de travail est que l’exposition aux ions perchlorates pendant des phases critiques du développement (enfance et adolescence) pourrait favoriser la survenue des MICI. Nous avons sélectionné un stade de développement en adéquation. Les animaux mâles et femelles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 16 semaines consécutives. A l'âge d'environ 21 semaines, les animaux subiront une anesthésie pour l'induction de la colite expérimentale. Nous souhaitons travailler pendant la phase aiguë inflammatoire et devront mettre à mort les animaux 3 jours après l'induction de la colite.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des cycles de jeûne de 24 heures alternés avec 24 heures d'alimentation pendant quatre semaines, des piqûres répétées de la queue pour mesurer la glycémie et un prélèvement de sang terminal, avant la mise à mort pour prélever le foie et d'autres organes. Le porteur étudie le rôle d'une protéine du foie chez des souris modifiées pour ne plus la produire, les bénéfices annoncés se limitant à comparer ces effets avec ceux d'un jeûne unique. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire ce processus par des méthodes sans animaux et conclut que le recours à la souris est "approprié".

Objectifs

Chez les animaux, des épisodes de jeûne sont fréquemment observés en cas de blessure ou de manque de nourriture ou encore lors de l'hibernation, dans le but d'économiser l'énergie et de s'adapter aux différents environnements. Les mammifères sont ainsi capables de tolérer de longues périodes de jeûne grâce à une réponse adaptative de l'organisme. Le foie joue un rôle majeur dans cette adaptation aux situations de jeûne car il permet la production de carburants, nécessaires au fonctionnement du cerveau et du coeur notamment. Cette production de carburants par le foie est primordiale et controlée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARα. De nombreuses études examinent les effets sur la santé de différentes stratégies nutrtionnelles qui impliquent des périodes de jeûne. Ces stratégies qui alternent des périodes de jeûne et des périodes d'alimentation ont montré des effets bénéfiques sur plusieurs pathologies, notamment chez la souris. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer le rôle de PPARa dans la réponse au jeûne lorsqu'il est alterné avec des périodes d'alimentation à volonté. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles qui n'ont pas la protéine PPARa dans le foie et leur contrôle, que nous soumettrons à des alternances de jeûne de 24h et d'alimentaion à volonté de 24h sur une période de 4 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes dont le foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir si PPARa spécifiquement dans le foie joue un rôle dans les réponses induites par des jeûnes répétées. Nous pourrons également comparer les effets avec le rôle connu de PPARa lors d'un jeûne unique.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard à volonté ou soumis à des cycles jeûne de 24h/alimentation à volonté pendant 4 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Chaque pesée prend environ 20 secondes par animal. La glycémie sera mesurée chaque semaine par prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne unique et le jeûne répété peuvent induire une perte de poids, une baisse de la glycémie et de la température corporelle. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus physiologique qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie, notamment le foie et le tissu adipeux, et plusieurs hormones qui agissent à distance. Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car elle permet d'étudier le rôle d'une protéine spécifique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie) Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure, renourri et replacé en conditions d’hébergement standard après examination par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, elles subissent chaque jour un stress de contention, olfactif, social, environnemental ou une perturbation de leur rythme circadien, pour reproduire un état dépressif et tester des molécules. Le porteur présente le projet comme une prestation offerte à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques pour la validation in vivo de leurs molécules, et prévoit de tuer les souris par dislocation cervicale afin d'analyser leur intestin et leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire l'état dépressif.

Objectifs

Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte environ 12% des hommes et presque 20% des femmes. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables (troubles du sommeil par exemple). De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression est associée une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu'une dysbiose du microbiote intestinal. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.

Procédures

Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le groupe G2 subira ces stress pendant 8 semaines. Le groupe G3 subira le protocole de stress pendant 8 semaines associé à un traitement antidépresseur connu. Les souris du groupe G4 subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu sur le groupe contrôle (non-CUS - G1). Les souris des groupes CUS (G2, G3 et G4) seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Le groupe G3 aura en plus un traitement antidépresseur. Ce groupe devrait avoir un aspect du poil bien entretenu. Ce traitement antidépresseur chez la souris n'est pas connu pour engendrer d'effet indésirable quelconque. Les souris du groupes G4 qui seront traitées avec des molécules à tester seront des molécules de type probiotiques ou prébiotiques ou compléments alimentaires ne faisant pas l'objet d'une quelconque dangerosité pour l'animal.

Devenir

Les souris seront ensuite euthanasiées par dislocation cervicale afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.

Remplacement

Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris C57BL/6J est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. L'accumulation de ces stress qualifie cette procédure de modérée. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.

Choix des espèces

La souris C57BL/6J est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).

368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une déficience génétique en lipase acide lysosomale, elles subissent un génotypage par biopsie de la queue, une destruction de leur moelle osseuse par deux injections de Busulfan ou une irradiation létale, puis une greffe de cellules souches et jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur indique que la destruction de la moelle peut provoquer une perte de poids et des plaies cutanées, et que les souris seront tuées pour prélever leur moelle osseuse et leur rate. Sur le remplacement, il affirme que les cellules de patients disponibles in vitro ne suffisent pas à reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Le déficit en enzyme (=protéine) : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras (=lipides) au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La transplantation de cellules souches de la moelle osseuse d’un donneur sain peut être bénéfique après déplétion au préalable des cellules du patient. Les cellules saines du sang produisent la protéine manquante et corrige l'accumulation de gras. Le manque de donneur compatible et le risque de rejet de greffe limitent le recours à cette procédure. Nous souhaitons développer un traitement curatif à long terme de la déficience en LAL (LAL-D) en utilisant une traitement génétique pour corriger les cellules souches de la moelle osseuse du patient. Les cellules corrigées du patient pourront à nouveau produire la protéine manquante et corriger l'accumulation de gras sans risque de rejet de greffe. Pour mettre au point cette stratégie, nous souhaitons tester différents méthodes de déplétion de cellules souches de la moelle osseuse afin de garantir une greffe de cellules souches optimales chez notre modèle de souris LAL-D.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de raffiner la méthode de déplétion des cellules souches de la moelle osseuse dans notre modèle de souris LAL-D afin de développer à terme un traitement génétique de la maladie. Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre de développer un traitement curatif pour les patients souffrant de LAL-D.

Procédures

Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance. Les animaux subiront soit 2 injections de Busulfan par voie intra péritonéales réalisé 48h avant la transplantation et espacée de 24H ou une irradiation létale réalisée 3h avant la transplantation de cellules. Pour l’irradiation, les souris seront disposées dans un irradiateur Faxitron (Rayon X, débit : 0,8Gy/min) pendant environ 12 min. Les animaux subiront une injection de cellules souches et des prélèvements de sang (au maximum 4 prélèvements) sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de queue, les injections des cellules ou Busulfan et les prélèvements de sang sont des procédures rapides, et ne devrais pas prendre plus de 10 min par souris.

Impact sur les animaux

Le maintien de la colonie LAL-D correspond à une nuisance légère car bien que les animaux LAL-D souffrent d’hépatosplénomégalie, il n’y a pas de modification de leur comportement (mobilité et alimentation). Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance ce qui est une nuisance légère de courte durée et seront sacrifiés à 8 mois pour éviter toutes souffrances. La nuisance lors des procédures de transplantation sera modérée et dura 16 semaines, en effet, les souris subiront une déplétion de cellules souches hématopoïétiques et seront transplantées par des cellules souches pour reconstituer la moelle osseuse. La déplétion peut entrainer une perte de poids des animaux et d’éventuelle plaies cutanées mais la transplantation de cellules souches permettra aux souris de se développer normalement.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les souris seront euthanasiées afin de récupérer la moelle osseuse et la rate pour faire les analyses de prise de greffe.

Remplacement

Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches hématopoïétiques de patient pour la LAL-D, nous devons d’avoir étudier la transplantation des cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à comparer nos valeurs de prise de greffe à nos valeur observée de référence à savoir 80% de prise de greffe en utilisant l’irradiation létale. Nous souhaiterions atteindre un pourcentage de prise de greffe similaire, à savoir 80% en moyenne, avec un minimum de prise de greffe de 50% plus ou moins 25% (variance). Nous avons utilisé test statique calculé par le logiciel G Power et conclut que 10 animaux par groupe sont nécessaires.

Raffinement

Les souris LAL-D sont plus petites que les souris saines, mais sans souci de motricité ou de douleur donc pas de condition particulière d’hébergement. Lors de la réalisation des procédures expérimentales, l’état général des souris (apparence, posture, comportement...) et leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours, puis toutes les semaines. En cas de plaies cutanées, une pommade sera appliquée tout au long de la cicatrisation. Toutes les procédures potentiellement douloureuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse. En cas de plaies oculaires, les prélèvements de sang seront suspendus et une application locale de gel cicatrisant sera effectuée. Si les plaies oculaires ne cicatrisent pas (infection, œil blessé) dans la semaine après traitement, les souris seront euthanasiées. De plus, afin de raffiner nos études, nous allons évaluer une méthode de myéoablation ayant moins d’effets d’indésirables pouvant ainsi améliorer la survie des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris LAL déficiente car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. Afin d’étudier la prise de greffe, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de douze heures, une diarrhée est provoquée par gavage d'huile de ricin, puis chaque animal est isolé quatre heures dans une cage à métabolisme pour recueillir ses selles, le porteur reconnaissant un inconfort et un stress liés à l'isolement. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le projet teste deux souches de probiotiques et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut remplacer l'animal, dans la perspective d'un futur essai clinique.

Objectifs

La diarrhée est trouble digestif qui touche près de 4,5 milliards de personnes dans le monde chaque année et qui se manifeste notamment par l’émission de selles généralement liquides ou molles, dans une quantité et à une fréquence plus élevée que la normale. Les épisodes de diarrhées aiguës peuvent être la conséquence d’une infection bactérienne, virale ou parasitaire, ou survenir suite à une intolérance alimentaire ou médicamenteuse, notamment suite à la prise d’antibiotiques. Ces épisodes peuvent s’accompagner de déshydratation, de douleur abdominale, de fièvre ... Des médicaments peuvent faire cesser la diarrhée en ralentissant les mouvements intestinaux mais peuvent entrainer par la suite une constipation. D’autres diminuent la secrétion d’eau dans les intestins. Au besoin, des antibiotiques peuvent venir à bout d’une diarhhée causée par une bactérie ou un parasite. Les probiotiques sont des bactéries ou des levures qui modulent la prolifération bactérienne de l’intestin. Ils sont largement utilisés comme compléments alimentaires et comme médicaments dans le traitement et la prévention des diarrhées. Les objectifs de cette étude sont d’évaluer les effets sur la diarrhée et sur la douleur induite de 2 nouvelles souches de probiotiques chez des rats soumis à l’induction d’une diarrhée. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un médicament de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et les intestins seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 nouvelles souches de probiotiques chez le rat soumis à l’induction d’une diarrhée expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un médicament de référence utilisé pour le traitement de la diarrhée aigüe. Les données des différents paramètres observés au cours de la mise en cage spéciale, temps de latence d’émission des premières selles, nombre et consistance des selles émises, ainsi que les données comportementales concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur les intestins et le colon prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ces 2 nouvelles souches de probiotiques sur leur activité anti-diarrhéique et sur les effets sur la douleur perçue chez le rat. Cela permettra d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une ou l’autre de ces 2 nouvelles souches de probiotiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de diarrhée aigüe.

Procédures

Les rats seront placés à jeun pendant 12 heures avant la réalisation des essais. Après cette mise à jeun, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué, geste effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Une heure après le traitement, la diarrhée sera induite par administration par voie orale d’un composé induisant une diarrhée expérimentale (huile de ricin), geste également effectué en quelques secondes par une personne expérimentée. Après induction de la diarrhée, les rats seront placés individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 4 heures afin de recueillir les selles émises par chacun d’entre eux et d’observer leur comportement, permettant ainsi d’évaluer l’effet des composés administrés.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des animaux la veille au soir de la réalisation des traitements et de l’induction de la diarrhée, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques, va induire une légère perte de poids des animaux. Cette perte de poids sera en effet peu importante car les animaux étant placés en cycle de lumière inversé, la période de jeûne correspondra à la phase lumineuse du cycle au cours de laquelle les animaux sont peu actifs voire inactifs, avec une prise alimentaire très limitée voire nulle. L’induction de la diarrhée va quant à elle induire un inconfort des animaux, se traduisant par l’émission plus ou moins rapide et importante de selles au cours des 4 heures de mise en cage spéciale, et par des modifications du comportement des animaux se traduisant par une baisse de l’activité, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée, et des yeux moins ouverts. Le traitement avec les 2 souches de probiotiques devraient limiter cet inconfort. La mise en cage spéciale, nécessaire pour recueillir individuellement les selles de chaque rat et observer individuellement le comportement de chaque rat pendant 4 heures suivant l’induction de la diarrhée, va induire un stress modéré par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 32 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des intestins pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets anti-diarrhéiques et comportementaux de composés. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de diarrhée, dont certains ont été publiés. Une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée à l’issue des expérimentations.

Raffinement

Au cours de la semaine d'acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux seront placés à 2 par cage avec de l'enrichissement pour assurer leur bien-être, et avec accès libre à la nourriture et à l’eau de boisson. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après la réalisation des traitements, l’induction de la diarrhée et la mise en cage spéciale, les animaux étant observés en continu pendant les 4 heures de mise en cage spéciale. L’expérimentation étant de très courte durée, sur 5 heures le jour des essais, les seuls points limites identifiés seraient des convulsions, tremblements ou paralysie des animaux suite à l’administration orale des produits à tester. Cela ne serait pas le cas après administration orale du médicament de référence et du composé induisant la diarrhée car nous avons une très bonne expérience de ce modèle et nous n’avons jamais observé de trouble des animaux traités avec ces composés. Ce modèle étant validé et ayant été utilisé de nombreuses fois en plaçant les animaux individuellement en cage spéciale pour une durée de 4 heures sans habituation à ces dispositifs, aucune habituation des animaux aux cages spéciale n’est envisagée. Les rats seront placés dans une salle d’expérimentation attenante à leur pièce d’hébergement, placée en lumière blanche attenuée pour ne pas les perturber et maintenir des conditions proches de celles de leur hébergement.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée et majoritairement utilisée pour la mise en évidence des effets anti-diarrhéiques de candidats médicaments et de compléments alimentaires. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de diarrhée.

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.

75 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit par voie rectale un produit destiné à provoquer une inflammation du côlon, subit des coloscopies et des IRM sous anesthésie, puis l'administration orale ou rectale d'un anticorps. Le porteur indique que l'induction de l'inflammation peut entraîner saignements, douleurs, diarrhées et déshydratation, et que les animaux sont tués par injection intracardiaque en fin de protocole. Il décrit le mini-porc comme le "modèle le plus adapté" pour tester une nouvelle forme orale d'un médicament déjà commercialisé en perfusion.

Objectifs

L’inflammation chronique de l’intestin et du côlon (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Selon l'Association François Aupetit (AFA), 8000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année en France. Les traitements conventionnels des MICI sont à base d’antiinflammatoires (acide 5-amino-salicylique, Pentasa®), de corticoïdes ou d’immunosuppresseurs (Azathioprine). Dans cet arsenal thérapeutique, l'utilisation des anticorps monoclonaux anti-TNF en monothérapie s’avère être efficace, notamment sur les cas compliqués. Ce sont les molécules les plus puissantes disponibles actuellement en clinique. En 2014, 3 formes de ce médicament à base d’anti-TNF ont obtenu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en France pour le traitement des MICI administré par perfusion. Leurs indications ciblent le traitement de la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique modérée à sévère chez les patients réfractaires aux traitements conventionnels cités ci-dessus. Cependant, les effets secondaires de ces nouveaux médicaments sont parfois importants pour les patients, notamment l’apparition des saignements liées à l’injection répétée par voie intraveineuse de ce médicament. De façon intéressante, nous avons développé une autre forme de ce médicament de manière à l’administrer par voie orale. Cette voie permettra ainsi d’éviter ces effets secondaires. Cependant, l’efficacité de ce médicament administré par voie orale reste à démontrer. Cette recherche préclinique chez le mini-porc permettra de valider d’une part la faisabilité et la tolérance de la voie orale pour l’administration de ce médicament et d’autre part, l'efficacité thérapeutique de son activité anti-inflammatoire dans un contexte pathologique. Cette étude comportera deux grands objectifs : (1) Valider un modèle animal (mini-porc) qui développe la maladie de l’inflammation chronique de l’intestin et du colon, (2) confirmer la sécurité et l’efficacité du traitement administré par voie orale par rapport à la voie parentérale (perfusion) et rectale.

Bénéfices attendus

Notre étude apportera la validation préclinique d’une formulation pharmacologique innovante permettant d’administrer un traitement anti-TNF par voie orale. De manière générale, cette étude apportera un intérêt clinique majeur chez les patients souffrant de pathologies chroniques et déjà sous traitement parentérale (perfusion). L’utilisation d’une nouvelle forme galénique innovante s’accompagnera d’une meilleure tolérance et d’une action d’installation plus rapide que les traitements actuellement mises sur le marché. Les bénéfices attendus par l’utilisation d’un bio-médicament avec une nouvelle forme galénique administrée par voie orale sont nombreux : 1. Une libération locale ciblée de la substance active au site d'action. 2. Réduction des infections à répétitions. 3. Une meilleure observance du traitement liée à un mode d’administration plus simple, sans les contraintes de stockage et de stérilisation retrouvées avec les formes injectables. 4. diminution importante de la charge hospitalière (soulagement du système économique de la santé) 5. La fabrication d'une forme galénique sèche (comprimé) est simple et moins couteuse.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection par voie intra-rectale (induction de l’inflammation par 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) et le Dextran Sulfate Sodium (DSS) + injection du traitement en solution ou dispersion), un gavage (administration des comprimés) et deux examens d'imagerie pour l’évaluation et le suivi du traitement (coloscopie + IRM avec injection de produit de contraste sous anesthésie générale). L’administration du médicament par voie orale à travers la sonde nasogastrique et par voie rectale à l’aide d’une canule rectale (dispositif médical) après fixation d’une seringue va durer approximativement 10-15 min. Une surveillance rapprochée des animaux sera effectuée afin de s’assurer de la tolérance des interventions.

Impact sur les animaux

La plupart des animaux notamment ceux inclus dans les phases 1 (sauf lot 1.1 : contrôle négatif), 2 et 3 (modèle de MICI), seront soumis à une injection d'un produit pouvant être irritant par voie rectale, afin de déclencher une inflammation colique. Cette intervention nécessite une anesthésie générale et l'utilisation d'une procédure de coloscopie. Cette intervention peut entrainer un saignement du colon, les animaux peuvent ressentir des douleurs, rarement une modification du poids (+/- 10%), des diarrhées pouvant entrainer une déshydratation. Par ailleurs, un stress lié à l'administration du traitement orale sera remédié avec une prémédication. Le traitement peut nécessiter une courte sédation de l'animal car le comprimé de 5 mm de diamètre ne doit pas être croqué (comprimé enrobé). Les animaux seront euthanasiés par l'injection létale intracardiaque du T61 à la fin du protocole expérimental ou lorsqu’un des points limites sera atteint.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à chaque date (Mois 3 : Phase 1 et 2, Mois 12 : Phase 3), puis une autopsie (évaluation macroscopique des tissus) et des prélèvements de tissus biologiques pour une analyse moléculaire et histologique seront effectués. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas d’apparition d’un point de limite.

Remplacement

Pour réaliser cette étude préclinique, nous utiliserons un modèle de maladie inflammatoire chronique intestinale (MICI) chez le mini-porc pour mimer la pathologie chez l’homme. Il s’agit d’un modèle animal le plus adapté d’une part par les ressemblances anatomiques et processus physiopathologiques du tube digestif avec l’homme, et d’autre part par sa corpulence proche de la taille humaine. Cette étude comporte la sécurité et l’efficacité de la forme galénique du traitement antiinflammatoire des MICI ciblant la partie distale de l’intestin. De ce fait, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation du modèle animal par une évaluation in vitro ou ex vivo ou un modèle d’intestin artificiel « in silico ». Une administration des comprimés à taille humaine chez la souris ou le rat n’est pas réalisable, elle ne reflèterait pas les conditions physiopathologiques observées chez l’Homme. De plus, ce mammifère est le plus couramment utilisé dans les évaluations pharmacologiques des MICI. A notre connaissance, aucune étude expérimentale n’a évalué à ce jour l’efficacité d’un bio-médicament sous une forme galénique par voie orale. L’utilisation chez le mini-porc d’un bio-médicament sous une nouvelle forme galénique (développé en collaboration avec un industriel) permettra de démontrer la preuve de concept in vivo (efficacité, tolérance et sécurité) dans le traitement des MICI avant la réalisation des premiers essais cliniques sur l'homme.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. De surcroît, le nombre des animaux choisis permet de réaliser une étude comparative entre les groupes d’animaux sains et avec un MICI induite. Ce qui permet de valider le modèle pathologique. Ensuite, une étude d’efficacité du traitement selon le mode d’administration « orale versus intra-rectal » sera réalisée pour comparer les groupes traités avec les non-traités « placebo ». Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une évaluation efficace de l'induction ciblée de l'inflammation au niveau du colon. Il est prévu d’évaluer l'efficacité des formes galéniques innovantes pour une période de 5 ans sur 75 mini-porcs, soit 15 mini-porcs par an en moyenne. Nous envisageons de faire des groupes de 6 à 7 mini-porcs. Ce nombre est le minimum possible, puisqu’il tient compte des analyses statistiques et des éventuelles pertes de mini-porcs pendant l'anesthésie ou des procédures liées à l’induction de l'inflammation. Nous allons réaliser des tests statistiques de comparaison entre les différents groupes de type « Mann-Whitney » non paramétrique. Les différences entre les groupes seront jugées statistiquement significatives lorsque la valeur P est inférieure à 0.05.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les mini-porcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE. La douleur liée aux interventions chirurgicales est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'induction de l'inflammation pour visualiser tout signe de complications post-opératoires imprévues qui nécessiteraient l’euthanasie de l’animal. Ainsi, les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo chez l'animal, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins, chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux (analgésiques en pré- et post-opératoire et médication spécifique pour limiter les éventuelles douleurs induites par l'inflammation). Les membres de l'équipe possèdent la formation "concevant et réalisant" et la formation de chirurgie chez l'animal (AUEC).

Choix des espèces

Le modèle d'induction de l'inflammation chronique de l'intestin (MICI) chez le mini-porc sera utilisé pour évaluer et caractériser l’efficacité in vivo de nouvelles formes galéniques. C’est l’un des meilleurs modèles d’étude des MICI puisqu’il permet de s'approcher aux conditions physiopathologiques observées chez l'homme (similitudes de l’anatomie de l'appareil digestif, de la composition de la flore intestinale et du temps de transit). De surcroît, ce modèle permettra d’utiliser des technologies perfectionnées utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme (IRM, coloscopie) dans le diagnostic, le contrôle, le traitement et le suivi de la maladie. Cette étude préclinique permettra ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des MICI et leur traitement. L’objectif est de confirmer la preuve de concept in vivo avant de passer aux études cliniques chez l'Homme. - Dans un premier temps, les mini-porcs seront utilisés pour valider l’induction de l’inflammation chronique intestinale chez le groupe non-traité et le groupe traité par voie intra-rectale avec le bio-médicament. Ce dernier est administré soit en solution ou en dispersion d’un comprimé broyé contenant la dose thérapeutique de l’anticorps monoclonal afin de montrer d’abord son efficacité locale. L’induction de la maladie et l’efficacité locale du bio-médicament seront évaluées par le calcul des scores Wallace (étude macroscopique : extension des lésions) et Ameho (étude microscopique : immuno-histologie) et par le dosage des marqueurs biologiques (réponses inflammatoires, dosage des cytokines, MPO, TNFα, numération formule sanguine, …). -Dans un deuxième temps, les mini-porcs seront utilisés dans le cadre d'efficacité de la thérapie par voie orale. - Puis, afin de se rapprocher de la clinique en termes de taille et de structure anatomique de l'appareil digestif humain, le modèle du grand mammifère mini-porcs de type Gottingen adultes (40 à 60 kg) sera utilisé pour évaluer l’efficacité, la sécurité et la répétabilité de la thérapie à long terme (6-12 mois).