Troubles gastrointestinaux

Pour mesurer l'effet de pesticides alimentaires sur le métabolisme, 256 souris sont utilisées pendant vingt-six semaines dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les organes. Nourries avec un régime riche en graisse contenant des pesticides seuls ou en mélange, elles développent une obésité, un diabète et une accumulation de graisse dans le foie. Le porteur décrit ces perturbations comme survenant "sans souffrance visible des animaux", et retient parmi les nuisances le stress de contention, les piqûres, les gavages et l'isolement de vingt-quatre heures en cage à urines. Le lien entre pesticides et troubles métaboliques a déjà été rapporté chez l'humain par la cohorte NutriNet-Santé, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit le dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux.

Objectifs

L’incidence des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2 et stéatose hépatique) a augmenté ces 30 dernières années et constitue un enjeu majeur de santé publique. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation riche en lipides), de nombreuses études appuient l’hypothèse que l’exposition à des contaminants environnementaux, tels que les pesticides, est un facteur de risque au développement de ces pathologies. Dans ce projet nous travaillerons sur un modèle murin d’exposition alimentaire aux pesticides pour mimer l’exposition des consommateurs. Les animaux seront exposés à des pesticides seuls ou en mélange à des doses non toxiques telles qu’elles sont définies par les agences réglementaires, dans des conditions d’alimentation équilibrée ou déséquilibrée (riche en graisse). Nous suivrons les marqueurs caractéristiques des pathologies hépatiques non alcooliques, du diabète et de l'obésité tout au long de l’expérience qui durera 26 semaines.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire aux pesticides seuls ou en cocktail dans un contexte d’alimentation équilibrée ou d’alimentation déséquilibrée source de troubles métaboliques. Ce projet apportera des arguments en faveur ou non du lien entre exposition aux pesticides et le risque de développer des pathologies métaboliques rapporté dans des études récentes réalisées dans la cohorte Française Nutrinet santé.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime contrôle ou un régime riche en graisse contenant les pesticides. Au cours des 26 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests pour évaluer la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour ces tests, le glucose et l’insuline seront administrés après 6h de jeûne. Les gestes de contention et de gavage dureront moins de 30 secondes par animal. Pour les mesures de taux de glucose sanguin (glycémie), le prélèvement d’une seule goutte de sang sera réalisé à la queue. Ces tests seront réalisés en alternance et espacés au minimum d'une semaine, et réalisé seulement 2 fois au cours des 26 semaines. Des prélèvements intermédiaires de sang qui prennent environ 15 secondes, pourront aussi être réalisés. Les animaux seront placés individuellement pendant 24h dans des cages adaptées à la récolte des urines. Avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la joue.

Impact sur les animaux

Le régime utilisé dans cette expérience est riche en graisse. Il induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées comme un diabète, une accumulation de graisse dans le foie, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le prélèvement sanguin et l’administration de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, à la piqûre, bien que légère, au gavage, bien que très rapide, ainsi qu’une légère douleur (piqûre). L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine peut entraîner un stress de l’animal.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires). En effet, la stéatose hépatique non alcoolique est caractérisée par une accumulation de lipides dans le foie qui viennent majoritairement du tissu adipeux ; de plus le microbiote intestinal joue un rôle prépondérant dans son développement et sa progression.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur des études similaires précédentes et en respectant la règle des 3R. Le nombre idéal d’animaux par groupe est donc de 16, et avec un total de 256 animaux.

Raffinement

Comme il est convenu réglementairement, les animaux seront hébergés dans des cages de 4 à 5 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. En ce qui concerne les cages à métabolisme, les souris disposeront également d'un abri en inox. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme respiratoire) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal, une absence totale et pérenne des 5 signes indiqués, ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition de la MASLD. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques.

Réutilisés pour 2 000 d'entre eux dans d'autres projets, tués pour les autres afin de prélever leurs organes, 3 000 souris et 3 000 rats sont soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des substances jusqu'à trois fois par jour pendant cinq jours, subissent l'insertion d'une bille dans la partie terminale du colon, une privation de nourriture jusqu'à vingt-quatre heures sur grille et un hébergement individuel sur sol grillagé pour que soient comptés et pesés leurs excréments. Une partie reçoit une substance qui provoque artificiellement une diarrhée ou une constipation, afin de tester si un candidat médicament la corrige. Le porteur qualifie ces atteintes de gêne ou d'inconfort, et affirme que les modèles animaux "restent plus adaptés" que les tests in vitro pour évaluer la motilité intestinale humaine.

Objectifs

Les troubles gastrointestinaux constituent un large éventail de pathologies qui affectent l’appareil digestif depuis la cavité buccale jusqu’au rectum affectant plus de 40 % de personnes dans le monde. La diarrhée et la constipation sont les principaux symptômes des troubles de la motilité intestinale. Ils sont associés à un certain nombre de maladies chroniques (tel le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l’intestin) ou à la médication. La constipation est définie par une diminution de la fréquence des selles associée à une difficulté pour les évacuer et se caractérise par un ralentissement du transit et une déshydratation des selles. A l’inverse, la diarrhée est une émission de selles fréquentes, abondantes et de consistance très molle à liquide. Ces troubles sont associés à une morbidité accrue, à un inconfort, à la perte de productivité au travail et à la consommation de ressources médicales. Le présent projet consiste à évaluer d’une part l’effet des substances sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces) et d’autre part le potentiel effet à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives lors de l’évaluation clinique de nouveaux candidats médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament.

Bénéfices attendus

Ces études ont pour objectifs d’évaluer l’efficacité de potentiel nouveaux candidats médicaments à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives et d’autre part évaluer leurs potentiels effets indésirables sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces).

Procédures

Les substances d'essais sont administrées par bolus durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées ( 3 fois par jours au maximum) pendant plusieurs jours (maximum 5 jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont mis à jeun sur grille pour une période n’excédant pas 24h (test compris). L’effet des substances sur le transit du colon est évalué soit après insertion d’une bille dans la partie distale du colon (durée de quelques minutes) ou après évaluation du nombre et de la consistance des fèces récupérées aprés hébergement inviduel des animaux sur sol grillagé (6 h maximum). Dans certains cas, les animaux peuvent recevoir une substance réactive ralentissant artificiellement le transit clonique (administration unique , durant quelques secondes). L’effet reverse des substances sur la diarrhée ou la constipation est évaluée après administration unique ou répétée (2 fois par jours au maximum / durée de quelque seconde) d’une substance réactive induisant la diarrhée ou constipation. Pour les modèles de constipation la prise de poids et la consommation d'eau et de nourriture sont monitorées au cours de l'étude nécessitant un hébergement individuel des animaux pendant au maximum 24h. Enfin, des prélèvements de sang (8 maximum) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire : un stress lié à la privation de nourriture temporaire (pour une durée n’excédant 24 h),à un hébergement individuel (pour une durée n’excédant 24 h), à une gêne ou un inconfort lié à l’induction des modèles symptomatiques de diarrhée ou de constipation, ou à une incommodité lors de l’insertion de la bille dans la partie distale du colon. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, des points limites clairement établis permettraient de sortir l'animal de l'étude.

Devenir

Dans le cas où des prélèvements terminaux d'organes (estomac, intestin...) sont obligatoires, les animaux ne pourront pas être maintenus en vie à la fin de l'étude et seront donc euthanasiés. Dans le cas contraire, (i.e; prélèvements terminaux d'organes non nécessaires pour atteindre les objetifs de l'étude) les animaux seront réutilisés dans un autre projet pour évaluer l'impact de la substance sur le transit intestinal par exemple.

Remplacement

De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne représentent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central et le système endocrinien. Ainsi, les modèles animaux, restent plus adaptés pour évaluer l'effet global des médicaments sur la motilité intestinale pour le développement de nouvelle thérapie et pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) présentent une motilité intestinale similaire à celle de l'Homme et réagissent de la même manière aux substances dont les effets prokinetique ou ralentisseur du transit sont connus. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage, car les substances testées dans ce projet sont principalement destinées pour l'Homme adulte).

Soumis à sept anesthésies générales en dix semaines, dont une pour leur retirer les deux tiers de l'estomac, 45 jeunes porcs femelles sont tués au terme du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit cinq fibroscopies, cinq mesures de pH œsophagien, cinq transits radiologiques et sept prises de sang, avant le prélèvement de l'œsophage, de l'estomac et du foie. Le porteur annonce des douleurs abdominales, des vomissements, un arrêt du transit, une mobilité réduite après la chirurgie, une ration réduite de moitié la première semaine, et la mise à mort en cas de douleur persistante ou de perte de poids de 30 %. L'objet du projet reste la comparaison de deux variantes de chirurgie de l'obésité, dont l'une n'a jamais été pratiquée ni chez l'humain ni chez le porc.

Objectifs

La chirurgie bariatrique a démontré une efficacité en termes de perte de poids, d’amélioration des comorbidités liées à l’obésité mais aussi en termes de mortalité. Cette chirurgie connaît un très grand essor en France. La sleeve gastrectomie (SG) ou gastrectomie en manchon est une intervention qui consiste à retirer environ 2/3 du volume de l’estomac afin de laisser en place un manchon gastrique tout en conservant sa continuité. Cette procédure peut potentiellement favoriser l'apparition ou l’aggravation en postopératoire d'un reflux gastro-oesophagien (RGO). Une technique de SG au cours de laquelle la tubulisation de l'estomac est effectuée le long de la grande courbure a récemment été décrite afin de potentiellement diminuer l'incidence du RGO en postopératoire. Le but de ce projet est d’étudier l’effet de la procédure de Sleeve Gastrectomie par tubulisation de l'estomac le long de la Grande Courbure (SGGC) chez le porc. L'objectif principal de cette étude est de montrer que cette technique permet une diminution de l'incidence et de la sévérité du RGO en comparaison à la technique classique de SG.

Bénéfices attendus

La sleeeve gastrectomie (SG) est l’intervention la plus fréquemment réalisée en chirurgie bariatrique. Il existe cependant un vrai questionnement autour de cette procédure sur un possible risque d’aggravation postopératoire du reflux gastro-oesophagien (RGO). Bien que cette chirurgie soit salvatrice pour les patients concernés, il y à un risque de développer ou d'agraver un RGO après SG (environ 20%) ainsi que de développer sur le long terme un oesophagite ou un endobrachyoesophage (respectivement de 28% et 8%). Le but de ce projet est de développer une nouvelle technique de chirurgie bariatrique ayant les avantages de la SG (technique relativement peu invasive qui garde la continuité du tube digestif) mais permettant de mieux contrôler le risque d’aggravation du RGO en postopératoire, et ainsi de prévenir l’oesophagite, l’endobrachyoesophage et une éventuelle dégénérescence de l’œsophage. Les bénéfices attendus pour les patients et la société sont donc potentiellement majeurs étant donné qu’en France environ 40 000 patients sont opérés d’une SG tous les ans et que plusieurs centaines de milliers de patients sont potentiellement candidats à cette chirurgie.

Procédures

Chaque porc recevra 7 anesthésies générales aux jours suivants : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63. Ces anesthésies nous permettrons de réaliser les différents gestes. Aucun geste n'est effectué sans anesthésie. Sept prélèvements sanguins auront lieu comme suit pour chaque animal : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63. Cinq fibroscopie auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Cinq mesures de phmétrie auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Cinq TOGD (Transit oesogastroduodénal) auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Sept prélèvements de selles auront lieu comme suit pour chaque animal : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63 pour l'analyse du microbiote. Ces prélèvements seront prélevés de la cage directement au moment du nettoyage de cette dernière, en l'occurence sans contact direct avec l'animal. Tous les animaux seront mis à mort à J63 de la première procédure afin de réaliser des mesures du volume de l'estomac, des prélèvements du bas oesophage, de l'estomac (fundus et antre) et de foie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des effets directement liés à l’intervention chirurgicale : douleur abdominale, vomissements, reprise tardive du transit (iléus paralytique), asthénie, mobilité réduite et devraient s’amender progressivement au bout d’une semaine après l’intervention chirurgicale. L'estimation de la souffrance des différentes interventions chirurgicales de la procédure est estimée à ''modérée'' mais gérée par l'anesthésie, l'analgésie et un monitoring spécifique. Des analgésiques seront administrés en per et post opératoire pour réduire les douleurs post opératoires des animaux. Des antiémétiques seront aussi administrés pour réduire les nausées et les vomissements post opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J63 de la première procédure afin de réaliser des mesures du volume de l'estomac, des prélèvements du bas oesophage, de l'estomac (fundus et antre) et de foie.

Remplacement

Il n’existe aucun modèle alternatif non animal permettant d’étudier l’impact d’une nouvelle technique de chirurgie bariatrique telle que celle que nous souhaitons développer. L’étude faite sur les chiens est une étude de faisabilité de la technique. La comparaison entre la sleeve le long de la grande courbure et la sleeve classique a été basée uniquement sur la perte pondérale à 2 mois et sur les complications chirurgicales uniquement. Aucune mesure de ph oesophagien ou d’étude de reflux gastrooesophagien n’a été faite. Aucun Transit oesogastroduodénal évaluant la vidange gastrique n’a été réalisé. Aucune fibroscopie gastrique n’a été faite. La SGGC est toujours une technique en phase expérimentale et n’a jamais été réalisée ni chez l’homme, ni chez le porc. La seule étude qui rapporte cette technique est celle sur les chiens sus cité. L’utilisation d’un animal vivant (porc) est indispensable afin d’évaluer : la tolérance de la procédure (alimentation, vomissement), l’efficacité de la procédure en termes de perte pondérale, et l’impact de la procédure sur : le RGO (mesure du PH oesophagien et biopsie du bas œsophage), la vidange gastrique, le microbiote et au niveau métabolique et endocrinien. Le but de notre étude étant d’évaluer scientifiquement avec des critères objectifs la physiopathologie du reflux gastrooesophagien après les différentes techniques chirurgicales de Sleeve Gastrectomie, ce qui est non reproductible en dehors d'un organisme vivant complexe avec une anatomie proche de l'homme. Cela nous permettra d’avancer des résultats qui pourront favoriser une technique sur l’autre.

Réduction

L’analyse de la littérature permet d’estimer à environ 70% le taux d'acidité anormal (pH < 4 pendant au moins 4% du temps mesuré) après SG classique. Grace à la technique de SGGC, nous espérons obtenir un taux d'acidité anormal de 20%. Ces données nous ont permis de déterminer que le nombre de sujets nécessaires dans chaque groupe était de 15. Dans un principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude de l’impact physiologique et métabolique de la procédure d’innovation chirurgicale, l’ensemble des explorations (pH métrie, fibroscopie, recueil d’échantillons biologiques) seront réalisées sur chaque animal inclus dans le protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux : - un traitement antalgique sera donné en per et postopératoire et un infitration de la cicatrice à l’aide d’anesthésiants locaux sera réalisée à la fin de la procédure chirurgicale. L’analgésie péri-opératoire est assurée par injection IV. En fin de procédure, une infiltration de part et d’autre de la laparotomie sera effectuée pour réduire les douleurs. L’analgésie post-opératoire sera assurée par un traitement médicamenteux adapté. - les rations alimentaires seront diminuées de moitié en postopératoire la premiere semaine qui suit la chirurgie afin de réduire le risque de douleurs abdominales et de vomissements. Notre point limite se situera à l’apparition des signes cliniques de douleur persistante malgré le traitement antalgique ou en cas de modifications évocatrices du comportement, qui sont chez le porc l’absence d’interaction avec les congénères, l’absence de recherche alimentaire (réduction du fouissage), le refus d’alimentation, la léthargie avec décubitus prolongé, la modification des vocalises. La persistance de l’atteinte du point limite une heure après nouvelle administration d’antalgiques entraînera la mise à mort de l’animal. Une perte de poids ≥ 30% entraînera aussi la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir une approche chirurgicale et anatomique suffisamment proche de l'Homme et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux. Le choix du modèle porcin est justifié par le fait qu'il a été largement utilisé comme modèle anatomique de validation dans de nombreux protocoles de chirurgie bariatrique. Par ailleurs, plusieurs chirurgiens de notre équipe enseignent dans des sessions de formation chirurgicale sur modèle porcin et ont donc l’expérience de la réalisation de SG dans ce modèle. Les animaux seront de jeunes porcs dits « à croissance lente » femelles, âgés de 2 à 3 mois. Ces porcs sont caractérisés par une évolution pondérale spontanée relativement stable en comparaison aux porcs classiquement utilisés pour l’expérimentation animale. Cette stabilité pondérale spontanée sera nécessaire pour évaluer l'impact direct des procédures sur le poids des animaux. Enfin, le choix du genre féminin se justifie par une meilleure stabilité pondérale spontanée et d’un comportement plus adapté à l’hébergement en groupe.