Troubles gastrointestinaux

1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une inflammation chronique de l'intestin par injection rétro-orbitale de lymphocytes T sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant huit semaines de composés fournis par des laboratoires clients. Le porteur indique une perte de poids, des selles molles, des diarrhées et des saignements rectaux attendus pendant l'étude, tout en affirmant que les doses testées n'induiront aucun effet indésirable. Ces prestations évaluent des composés contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées le jour de l'analyse de leurs organes.

Objectifs

Les différents laboratoires privés ou publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Les MICI sont des troubles gastro-intestinaux chroniques caractérisés par une inflammation intestinale chronique, des réponses dérégulées contre le microbiote intestinal et un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Les MICI se présentent sous deux formes principales, la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn. L'incidence et la prévalence des MICI sont en constante augmentation dans le monde et ces maladies sont associées à une morbidité marquée et ont un impact majeur sur la qualité de vie et la capacité à travailler. Les traitements conventionnels actuels visent à atténuer l'inflammation. Cependant, environ un tiers des patients ne répond pas au traitement ou devient réfractaire avec le temps. L'objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques de l’intestin afin de diminuer les échecs thérapeutiques. Pour cela, nous induirons des modèles murins de MICI et nous testerons différents composés thérapeutiques afin d’évaluer leurs effets sur le développement des MICI. A l'issu de l'expérimentation, la composition du système immunitaire sera évaluée et des études histologiques seront menées afin d'évaluer l'efficacité des différents traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les maladies inflammatoires de l’intestin, maladies dont actuellement un tiers des patients recevant des traitements anti-inflammatoires ne répond pas ou devient réfractaire avec le temps .

Procédures

La procédure expérimentale repose sur : - une induction de l'inflammation de l'intestin par une unique injection intraveineuse rétro-orbitale (150 μl) de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice sous anesthésie générale gazeuse induite à l'isoflurane. Cette procédure dure 3 minutes et 30 secondes, temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection rétro-orbitale. - des injections intrapéritonéales (dose-poids de 200μl de mélange/20g de souris) 3 fois par semaine pendant 8 semaines maximum de molécules thérapeutiques afin d'évaluer leur efficacité. La durée de cette procédure est de 1 minute par souris, temps comprenant la pesée, la contention et l’injection des composés ; - des pesées 1/2j afin de suivre le développement de la pathologie pendant 8 semaines maximum. En effet, le poids est un critère d'évaluation clinique de la pathologie. Cette procédure est rapide et dure 20 secondes par souris ; - et un unique prélèvement sanguin de 200μl par voie submandibulaire afin de récolter le sérum le jour de la caractérisation du système immunitaire et des études histologiques. Cette procédure dure 1 minute par souris, temps comprenant la contention et la prise de sang.

Impact sur les animaux

L'induction de l'inflammation de l'intestin par injection intra veineuse de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice entrainera une perte de poids et probablement des selles molles, diarrhées et / ou saignements rectaux sur la durée de l'expérimentation (5 à 8 semaines dépendamment de l'induction de la pathologie). Les tests de toxicité des composés thérapeutiques seront effectués en amont par les laboratoires demandeurs. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie, pesées, injections et prise de sang). Chaque gestes techniques sera réalisé par du personnel expérimenté et expert dans ces actes dans le respect du bien-être animal afin de limiter les contraintes subies par l’animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire (immunophénotypage) ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Les modèles de MICI étant hétérogènes, le nombre utilisé pour ces expériences sera de 10 animaux par groupe expérimental, sexes identiques, soit mâles ou femelles dépendamment du partenaire, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules ou doses sont à tester.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation EOPS, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux déficients en lymphocytes T « hôtes » adultes de plus de 8 semaines avec un poids supérieur ou au minimum égal à 22g. En effet, les animaux doivent avoir un poids suffisant pour être stable au début du protocole afin de suivre le développement de la pathologie entrainant une perte de poids de 20% dans le groupe contrôle. Les animaux « donneurs » de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice seront également utilisés à l’âge adulte car le système immunitaire doit être mature.

110 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant trois semaines un régime contenant de la viande, puis passent jusqu'à 72 heures seuls en cage à métabolisme pour le recueil de leurs urines et fèces, une phase que le porteur reconnaît comme génératrice de stress. Les animaux sont tués pour prélever leur côlon et y mesurer l'oxydation et l'inflammation. Le porteur teste des antioxydants censés contrer l'effet cancérigène du fer héminique de la viande rouge, et affirme qu'aucune étude in vitro ne rend compte d'un "organisme entier".

Objectifs

Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation importante de viande rouge et de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les études réalisées chez le rat ou la souris confirment cette association et montrent que le fer héminique (le rouge de la viande), contenu en grande quantité dans ces aliments pourrait être responsable de leur effet néfaste. Le fer héminique est un agent pro-oxydant qui provoque l’oxydation, dans la lumière intestinale, de composés du régime alimentaire, comme les lipides, aboutissant à la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d'extraits végétaux antioxydants, ajoutés directement dans la viande (volet 2), ou bien indirectement dans la ration des bovins (volet 1), sur leur capacité à contrecarrer l’effet délétère du fer héminique de la viande. Les antioxydants ajoutés directement dans la viande (volet 2) seront choisis pour leur capacité antioxydante intrinsèque mais aussi pour leur capacité à moduler une voie importante impliquée dans le dialogue entre différents types cellulaires au niveau colique (études in vitro sur lignée cellulaire en amont de ce projet). Les antioxydants ajoutés dans la ration des bovins seront choisis pour répondre à un triple objectif : avoir non seulement un effet antioxydant, destiné à contrecarrer l’effet du fer héminique chez le consommateur de viande (volet 1), un effet de réduction d’émission de méthane lors de la digestion des bovins (étude sur digesteurs artificiels en amont de ce projet), mais aussi une absence de modification ou une amélioration de la qualité organoleptique (évaluation gustative par un jury de testeurs humains). La viande issue de ces bovins (8 bovins, 2/lots, 1 lot témoin/élevage, 3 lots/rations enrichie en antioxydant) sera testée en l’ajoutant à la ration des rats dans le volet 1. Dans ce projet, nous proposons deux volets où 110 rats Fisher F344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la viande pendant 3 semaines. Leur urine et leur fèces seront récupérées lors d’un passage de 2 jours et demi en cage à métabolisme et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides et de l’inflammation et permettront des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans chacun de ces 2 volets permettront l’identification de molécules prometteuses afin d’élaborer des stratégies de prévention nutritionnelles visant à limiter l’effet de la viande rouge sur le risque de cancer colorectal. La première stratégie (volet 1) constitue un levier de prévention nutritionnelle dès la production du bétail qui outre la limitation du risque de cancer colorectal devra provoquer une diminution des émissions de gaz à effet de serre par le bétail tout en maintenant une bonne qualité organoleptique des viandes. La seconde stratégie (volet 2) devra permettre de proposer un levier de prévention nutritionnelle du risque de cancer colorectal défini sur la base d’une étude mécanistique innovante.

Procédures

Tous les prélèvements in vivo, sur rat vigile, se feront sans contention de l'animal (animal posé sur le bras ou maintenu dans la main). Les fèces à l’anus seront prélevées 1 fois à J21 pour des analyses du microbiote. Une crotte sera prélevée par rat. Ce prélèvement dure environ 1 à 3 min par rat. Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h séparées, les rats seront hébergés en cage à métabolisme maximum 48h en continues. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toutes la production de 24h en féces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h. Les rats n’ont pas besoin d’être manipulés. Les rats seront également manipulés sans contention pour les identifié par tatouage à l'oreille (pince Aramis spécifique aux rongeurs avec une aiguille type insuline, encre spécifique pour rongeurs, un point par rat).

Impact sur les animaux

Le projet comporte un passage en cage à métabolisme pendant au maximum 72h ce qui peut générer du stress pour les animaux qui sont hébergés seuls.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que le côlon soit prélevé pour analyses.

Remplacement

Les études sur digesteurs artificiels mimant le rumen des bovins ont permis de choisir les extraits végétaux antioxydants qui réduiront le plus les émissions de méthane par les bovins (amont du volet 1). Des études in vitro sur des cellules permettront de choisir les antioxydants les plus à même d’avoir un effet intéressant sur le dialogue entre les différents types cellulaires du côlon (volet 2). Ces études en amont de ce projet permettent de limiter le nombre d’animaux en testant beaucoup de molécules in vitro puis de ne tester que les plus pertinentes chez l'animal. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés antioxydants, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et le rôle des antioxydants dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été limité au maximum à 10 animaux par lot. Pour ces études nutritionnelles de 22 jours, notre expérience et nos publications montrent qu'un nombre minimal de 10 animaux par lot est nécessaire pour une modulation des marqueurs biologiques analysés. Par exemple, un nombre de 10 animaux par lot suffit à obtenir des résultats significatifs sur un marqueur urinaire tel que le DHN-MA (composé issue de la dégradation physiologique d'un acide gras lors de l'oxydation des lipides). Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables, et d'être dans des conditions expérimentales équivalentes, nous prévoyons d'utiliser le même nombre d'animaux dans ce projet, soit 10 rats par lot

Raffinement

Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement ou deux fois par jour lorsqu’ils passeront 48h dans une cage à métabolisme (animal isolé). La surveillance sera réalisée à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire où sont listées et scorées différentes observations spécifiques au rat F344 utilisé dans cette étude. Cela concerne globalement le comportement alimentaire/social et l’état général. Si l'état sanitaire des animaux se révèle modérément modifié (exemple de score 2 : poils non toilettés, prise de poids modéré, …), la surveillance sera augmentée en conséquence (action préétablie à suivre). Si les observations montrent un état général ou un comportement classé sévère (exemple de score 3 : baisse de la prise de poids ou comportement non curieux) ou très sévère (exemple de score 4 = point limite : baisse du poids à 15% par rapport à la dernière mesure), alors le vétérinaire référent sera sollicité pour vérifier que l’action préétablie suffise (score 3) ou l’animal sera euthanasié et autopsié (score 4).

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que le rat Fisher F344 était un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en viande rouge. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particuliers ceux de l'appareil digestif. L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec les résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.

7500 rongeurs, 3750 souris et 3750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une mise à jeun de quatorze heures sur grille, ils reçoivent par gavage ou injection les composés testés ou des agents ulcérogènes comme l'éthanol ou des anti-inflammatoires, avant le prélèvement de l'estomac après la mise à mort. Ces études réglementaires évaluent le potentiel de nouvelles molécules à provoquer ou atténuer des ulcères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative validée n'existe pour étudier un système digestif "intègre".

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer : - les effets potentiels ulcérogènes gastriques de nouveaux composés, - la capacité de modulation par de nouveaux composés des effets ulcérogènes gastriques de composés comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine), les acides (HCl). Les modèles expérimentaux développés chez le rongeur (principalement chez le rat) sont très largement décrits.

Bénéfices attendus

Dans le cadre d'étude de type pharmacologie de sécurité, ces études vont permettre de déterminer d'éventuels effets délétères sur la muqueuse gastrique de candidats médicament et fournir ainsi des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament. Dans le cadre d'étude d'efficacité/pharmacologie de sécurité de candidat médicament, ces études vont permettre de déterminer le potentiel de modulations par le candidat médicament des ulcères gastriques induits par des agents comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine). Cela apportera des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament ou en terme d'efficacité thérapeutique.

Procédures

Mise à jeun avec hébergement sur grille de 14h pour éviter les phénomènes de coprophagie (1 fois) avant traitements par gavage ou administration intra péritonéale (maximum deux traitements à 1h d'intervalle, durée d'un gavage ou d'une injection intrapéritonale de 15 secondes environ) suivi 6 heures au plus tard après le premier traitement d'une anesthésie pour prélèvement sanguin et prélèvement de l'estomac (et éventuellement d'autres tissus) après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de déterminer les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Des nuisances peuvent être liées aux administrations (infection au site d’injection, lésion œsophagienne liée au gavage ou erreur de gavage). Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être des troubles du comportement ou les nuisances consécutives de l'ulcération qui peuvent in vivo être objectivées par la présence de traces de sang dans la région périanale. Enfin, la mise à jeun sur grille est également source de nuisance pour les animaux, mais est requise pour éviter les phénomènes de coprophagie.

Devenir

Mise à mort selon les procédures réglementaires pour prélèvements terminaux post mortem requis

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour l'évaluation d'effet sur la muqueuse gastrique est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système gastrointestinal intègre, y compris dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative connue et validée à ce jour.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le choix de doses sera effectuée. L'analyse statistique évaluera les scores d'ulcérations comparant les effets des traitements.

Raffinement

La mise à mort des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors la mise à mort de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Les animaux resteront hébergés en groupe et des tunnels seront utilisés comme enrichissement.

Choix des espèces

L’évaluation de l’efficacité thérapeutique et de la sécurité pharmacologique des molécules destinées à devenir des médicaments est requise par les autorités. La 1ère évaluation préclinique des effets sur la sphère gastrique est généralement conduite chez les rongeurs (rats, souris). Le stade adulte sera généralement utilisé pour tester l’efficacité de nouvelles entités pharmacologiques, les applications thérapeutiques visant la population adulte. Néanmoins, des investigations pourront être réalisées sur des animaux après sevrage pour répondre à des besoins relatifs au plan d’investigation pédiatrique le cas échéant.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.