Troubles gastrointestinaux

160 souris d'une lignée génétiquement modifiée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant huit semaines pour supprimer leur microbiote, toutes subissent des jeûnes de six heures, des prélèvements sanguins répétés à la queue et des gavages, avant mise à mort pour trier les cellules intestinales. Le porteur étudie l'effet des bactéries intestinales sur les hormones digestives, avec une application humaine dans l'obésité et les maladies inflammatoires présentée comme lointaine. Il indique que la déplétion du microbiote produit "a priori peu d'effets indésirables" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre bactéries et intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bacteries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des produits (hormones) qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines. Ces cellules jouent le rôle de senseurs, libérant les hormones en réponse à des modifications de leur environnement Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous éliminerons les bactéries intestinales par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment les cellules produisant les hormones intestinales sont impactées lors de la suppression du microbiote intestinal. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées. Compte tenu du rôle important de ces hormones, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux lorsque les fonctions de ces hormones sont altérées, dans le but à terme de prévenir et/ou guérir des maladies.

Procédures

La moitié des animaux recevra un mélange d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 8 semaines, conduisant à la déplétion de leur microbiote intestinal. Pour mesurer les niveaux des hormones et les activités des cellules produisant ces hormones, trois tests métaboliques seront réalisés, espacés de 15 jours, sur tous les animaux. Un test métabolique permet de mesurer l’effet d’un stimulus particulier sur l’animal, notamment au niveau intestinal en comparant l’animal avant et après ajout du stimulus. Chaque test comporte une phase de jeun (6h), trois prélèvements sanguins, un avant l’administration du stimulus, et deux après, à 5 et 15 minutes respectivement après l’administration pour un volume total de 150µLet un gavage par voie orale ou une injection en intrapéritonéal, permettant de mesure la libération des hormones en réponse au stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas une heure entre la première prise de sang et la dernière. Des mesures de transit intestinal par gavage (au maximum trois par animal, deux au cours de l’expérience (avec un suivi pendant 48h) et un au moment de la mise à mort (gavage une heure avant) seront également réalisées pour mesurer les fonctions intestinales, ainsi que des prélèvements de sang avant la mise à mort et la récupération des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux, les antibiotiques étant introduits séquentiellement pour éviter tout rejet par néophobie. Les animaux seront conservés en groupe et manipulés régulièrement. Le gavage oral et la prise de sang à la queue seront réalisés par des personnes compétentes, avec des temps de manipulations réduits. Les prises de sang séquentielles se faisant de manière rapprochées, une seule incision à la queue est nécessaire pour réaliser le prélèvement. Les jeûnes seront limités dans le temps, induisant une perte de poids réduite qui est en général rattrapée les jours suivants. Les souris seront suivies pendant l’heure qui suit l’administration des stimuli puis pendant le reste de l’expérimentation pour s’assurer qu’aucun n’induit d’effets indésirables, aucun n’effet étant attendu sur le type de stimuli testés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin. La lignée de souris utilisée permettra d’étudier spécifiquement les fonctions des cellules entéroendocrines, ce qui n’est pas possible dans un autre modèle. Les intestins récupérés dans ces expérimentations serviront à la production de culture de cellules intestinales (organoïdes intestinaux) qui seront utilisés dans des projets ensuite pour étudier (1) le développement de l’épithélium intestinal issu de souris déplétées en microbiote et (2) la réponse des cellules entéroendocrines à des produits spécifiques, notamment produits par les bactéries.

Réduction

160 animaux au total répartis en 20 lots seront utilisés dans ce projet, répartis en 10 procédures. Chaque procédure incluera un lot de 8 souris traitées par antibiotiques et un lot contrôle de 8 souris non traitées et sera effectuée sur des animaux de même sexe pour tester l’effet de trois stimuli et récupérer les tissus pour un usage spécifique. 5 procédures différentes permettront de tester au total 15 stimuli de cellules entéroendocrines (par exemple, glucose, mélange d’acides aminés et protéines, acides gras, produits microbiens..), ainsi que pour récupérer les tissus intestinaux des souris pour différents usages, un seul tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage lors du tri cellulaire (transcriptomique, peptidomique, génération d’organoides, histologie…). Les procédures seront reproduites sur les femelles et les mâles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage. L’hydratation, notamment lors de l’introduction des antibiotiques, sera surveillée et si nécessaire, l’ajout d’antibiotiques sera modifié pour permettre une meilleure tolérance. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés (ainsi que leur ingéré alimentaire) 2 fois par semaine. Une grille de décision (points limites) est établie et permet d’agir de façon appropriée en cas d’apparition de signes de souffrance chez un animal, Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux, avec un maximum de 10µL/g et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements. Les souris seront au moins 2 par cage pour éviter l'isolement. Une grille de score de bien être permettra de suivre régulièrement chaque animal individuellement en prenant en compte son aspect général, son poids et son comportement. En cas de hausse modérée du score, un suivi plus attentionné sera réalisé avec l’ajout de nourriture plus facilement accessible. Dans le cas d’une forte dégradation du score les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. Les procédures seront appliquées sur les femelles et les mâles avec un lot de souris traitées aux antibiotiques et un lot contrôle. Les procédures seront reproduites 5 fois pour tester différents stimuli et pour différents usages des tissus, chaque tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées.

16 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pratique une chirurgie pour interrompre la continuité digestive et créer une stomie, puis un rétablissement par voie endoscopique ou chirurgicale, avant prélèvement des tissus. Le porteur reconnaît que des simulateurs existent pour apprendre la pose des prothèses, mais juge le modèle animal indispensable pour le suivi dans le temps. La première phase sert aussi à la formation d'internes de chirurgie.

Objectifs

Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte, souvent dans le dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon. Cette intervention consiste à retirer la partie du côlon lésée. La partie basse, le rectum, est refermée (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon, en partie haute est relié à l’extérieur du corps via une stomie pour l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie pratiquée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, moins d’un patient sur deux sera candidat à cette opération, avec des risques supplémentaires. Très récemment, l’endoscopie digestive a permis dans diverses indications de réaliser des anastomoses digestives par voie endoscopique. Cette technique d’anastomose endoscopique a été largement évaluée dans les maladies de l’intestin grêle ou de la voie biliaire principale. Devant le caractère invasif de cette opération de rétablissement de continuité digestive, et avec les progrès des techniques d’écho-endoscopie (échographie sous endoscopie) thérapeutique, les objectifs de ce projet de recherche sont : - De créer un modèle expérimental de colostomie temporaire (intervention de Hartmann) - D’évaluer la faisabilité des anastomoses colorectales par voie endoscopique, au moyen de prothèses permettant l’apposition du côlon et du rectum - De définir les facteurs pronostiques de succès et d’échec de la technique d’anastomose colorectale endoscopique - De comparer la faisabilité et l’efficacité des anastomoses colorectales réalisées en fonction de deux techniques : écho-endoscopie versus chirurgie Par ailleurs, au sein de ce projet, la première phase de chirurgie (intervention de Hartmann), étant une pratique relativement courante, elle pourra également permettre la participation d’internes de chirurgie. Ceci sera fait avec la participation d’un médecin sénior, ce qui permettra de l’inclure dans leur cursus de formation pédagogique chirurgicale.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, avant d'envisager en cas de succès une plus grosse série d'animaux. Cette seconde cohorte permettra de définir plus précisément les facteurs de succès et d’échec de la technique, afin d’identifier quels patients humains pourront par la suite entre candidats à un rétablissement de continuité par endoscopie. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients aux antécédents lourds une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de ré-intervention pour sténose ou fistule anastomotique.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à une procédure chirurgicale destinée interrompre la continuité digestive et à créer la stomie (durée 1h-1h30). Un lot d’animaux sera ensuite traité par voie endoscopique (durée 40 min environ), l’autre lot le sera par voie chirurgicale (1 heure environ).

Impact sur les animaux

Du stress et de l’angoisse peuvent être présents. Une stomie sera pratiquée (abouchement du côlon à l’extérieur du corps), qui sera effectuée en position ventrale plutôt que latérale pour limiter la gêne pour l’animal. Une mise à jeûn des animaux ainsi qu’un lavage intestinal (par prise de médicament) doit être effectuée pour réaliser les manipulations dans les meilleures conditions en limitant les risques pour l’animal. Des risques de blessures entre individus sont envisagés en post-opératoire, notamment au niveau des sutures. Une surveillance particulière sera effectuée ainsi qu’une possibilité d’isolement le temps de la cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d’analyse des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.

Remplacement

Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Cependant, l’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum concernant les procédures les mieux maitrisées (3 anastomoses colorectales manuelles et 3 anastomoses mécaniques). La participation d’internes de chirurgie (sous la surveillance de médecins séniors) pendant la première phase chirurgicale leur permet de se former aux techniques évoquées précédemment sur un modèle vivant utilisé en formation et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 2 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers ) pour leur permettre d’exprimer des comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le porc est un modèle animal dont l’anatomie digestive est particulièrement proche de l’anatomie humaine. Il constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche depuis de nombreuses années. Animaux âgés de 3 à 6 mois à leur arrivée afin qu’ils présentent une corpulence suffisante pour l'utilisation du même type de matériel que pour un humain adulte.

24 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit par voie orale une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée, avant de prélever l'ensemble du système digestif. Le projet évalue un ingrédient naturel censé limiter cette inflammation après le sevrage et réduire le recours aux antibiotiques. Le porteur indique vouloir croiser ces résultats avec un modèle de cellules intestinales in vitro pour, à terme, réduire ou supprimer le recours aux animaux.

Objectifs

L’objectif du projet est d’une part de valider un modèle d’inflammation intestinale par voie orale sur le porcelet puis d’utiliser ce modèle pour évaluer l’efficacité d’un ingrédient naturel sur l’inflammation. L’objectif est d’autre part de mettre en parallèle ces résultats avec ceux déjà obtenus in vitro sur modèle de cellules intestinales porcines afin de construire un modèle pharmacologique permettant de limiter les études sur animaux.

Bénéfices attendus

Dans la production porcine, le sevrage précoce et brusque est un événement très stressant obligeant le porcelet à s’adapter rapidement à des changements drastiques (changements brusques du régime alimentaire, séparation de la mère, nouvel environnement, etc.). Ces évènements ont des conséquences négatives sur la santé intestinale du jeune porcelet, ce qui augmente la susceptibilité aux maladies et entraîne également une diminution des performances. Au niveau intestinal, le sevrage induit en effet une dégradation de la barrière intestinale. La production incontrôlée de molécules inflammatoires contribue à influencer négativement l’intégrité intestinale et donc la barrière avec par exemple modifications de la perméabilité aux macromolécules, du transport des nutriments et des ions. La composition du microbiote intestinal est également affectée et l'association avec l’inflammation intestinale locale peut entraîner une expansion de bactéries pathogènes intestinales qui se traduit par l’apparition de diarrhée phénomène classique en post-sevrage pouvant conduire à l’utilisation d’antibiotiques. L'utilisation de molécule naturelle pourrait permettre de diminuer l'utilisation d'antibiotique et l'amèlioration du bien-être de l'animal.

Procédures

Il n' y a pas d'intervention sur animaux vigiles pendant la durée des procédures. Les prélèvements seront réalisés sur animaux non vigiles.

Impact sur les animaux

L’objectif est d’induire une inflammation digestive modérée. Elle pourra se traduire par l’apparition de diarrhée légère chez l’animal. Ce type de diarrhée n'a pas d’impact fort sur le comportement et/ou la consommation d’aliment et d’eau des porcelets.

Devenir

L'ensemble du système digestif doit être prélevé pour pouvoir évaluer l'effet protecteur de l'ingrédient.

Remplacement

L’objectif des procédures expérimentales nécessitent l’utilisation d’animaux pour valider les résultats obtenus in vitro et déterminer les doses à appliquer in vivo. En effet il n'est pas possible de simuler dans les tests in vitro (culture cellelaire intestinale) la réponse de l'organisme à l'inflammation intestinale et donc de modéliser la réponse physiologique. L'étude permettra de corréler les réponses obtenus in vitro et in vivo afin de pouvoir identifier les manques du modèle in vitro. A terme l’objectif majeur est de réduire ou de supprimer le modèle animal

Réduction

Un nombre minimal de porcelets a été calculé en tenant compte de l’amplitude de réponse attendue sur l’expression des gènes et de la variabilité de la réponse, en effectuant un calcul statistique du nombre de sujet nécessaire. Ces calculs nous ont permis de fixer un nombre d'animaux par groupe et qui au total représente un nombre de 24 animaux.

Raffinement

Les porcs seront hébergés en box individuels. Cependant, les cloisons entre les box permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux

Choix des espèces

La problématique de ce projet concerne la gestion des diarrhées chez le porcelet en post-sevrage. Le porcelet d’élevage est donc l’espèce cible retenu pour réaliser ce projet. Stade de développement : sevrage. Ces porcelets seront âgés de 28 jours et pèseront environ 8.5 kg. L’âge de 28 jours du porcelet correspond au passage de l’allaitement vers la phase sevrage de l’animal. La problématique de ce projet concerne la gestion des diarrhées chez le porcelet au stade de développement "sevrage". Ce stade est choisi car il représente une période de stress importante pour le porcelet d’élevage. En conséquence nous avons choisi ce modèle pour réaliser ce projet et améliorer le bien-être des animaux durant cette phase de sevrage

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter pylori puis gavées d'un composé nommé EX-01, jusqu'à deux fois par jour pendant quatorze jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur vise un médicament contre l'infection à H. pylori, associée aux cancers de l'estomac, et renvoie cette retombée à terme. Il affirme que des expériences chez la souris sont "indispensables" pour confirmer l'activité du composé, jugée impossible à modéliser in vitro.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant reponsable dans plus de 93% des carcinomes gastriques. Le composé EX-01, naturellement présent dans l’alimentation, dont l’inocuité a été montrée mais dont la composition est actuellement confidentielle car en instance de brevetage, a montré des effets antibiotiques in vitro sur Helicobacter et Campylobacter. Il a également montré des effets anti-cancéreux dans les cancers de la prostate et du pancréas mais son action n’a pas encoré été étudiée dans le cancer de l’estomac. Nous souhaitons donc à présent étudier in vivo les effets de ce composé, l’objectif à terme étant la création d’un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo chez la souris les effets du composé EX-01 sur la colonisation de l’estomac par la bactérie Helicobacter pylori.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage sur animal vigile: 20 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Gavage sur animal vigile: 40 souris, 1 fois par jour sur 3 jours puis 2 fois par jour sur 14 jours

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour, et à l’infection à H. pylori. L’infection à H.Pylori peut induire une légère inflammation au niveau de l’estomac au bout de 5 semaines

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé EX-01 sur la croissance de H. pylori a été montré in vitro (dépôt de brevet en cours). L’absence de toxicité chez la souris a été démontrée. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique (environnement acide susceptible d’affecter l’activité de la molécule), éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé par notre équipe. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des analyses biologiques de H. pylori à partir de la muqueuse gastrique des souris infectées, et l’analyse histopathologique pour quantifier l’inflammation gastrique. Des études statistiques seront réalisées : d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori, qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs. Si l'animal commence à perdre du poids, de la nourriture humidifiée sera mise dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement euthanasié. Si l'animal présente des signes de souffrance trop importants il sera euthanasié sans attendre. Les souris seront pesées deux fois par semaine, si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris C57BL6J et est maitrisé au laboratoire. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.