Troubles gastrointestinaux

1404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec pour une partie des animaux une induction de cancer intestinal par injection, puis une injection de cellules B régulatrices et des prélèvements sanguins. Le projet teste une thérapie cellulaire contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées pour caractériser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme que les migrations et interactions cellulaires en jeu ne peuvent pas être modélisées in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser l’effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices (Bresg) dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Les MII incluent la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC) qui sont des troubles chroniques et récidivants, dont le cancer est une complication à long terme potentiellement mortelle. Plus de 2 millions d'Européens et 1,5 million de Nord-Américains sont atteints de MII. Bien que les traitements actuels permettent de ralentir la progression de ces maladies chez certains patients, une rémission durable et la prévention du cancer associé ne sont pas toujours possibles, et il n'existe actuellement aucun traitement curatif pour les MII. Les MII impliquent des cellules du système immunitaire responsables de la pathologie intestinale. L’activation de ces cellules pathogènes est normalement empêchée par un autre type de cellules du système immunitaire appelées Bregs. Les Bregs sont déficitaires chez les patients atteints de MII si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices chez ces patients. Des Bregs peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. Les MII peuvent être modélisées chez la souris. En utilisant ces modèles les objectifs de ce projet sont de caractériser l’effet des Bregs produites in vitro sur la progression de la maladie, leur localisation dans les souris traitées, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur effet bénéfique, et leur capacité à compenser pour des défauts dans d’autres mécanismes régulateurs importants dans l’inflammation intestinale. Le projet évaluera également la capacité de ces Bregs à empêcher le développement de cancer intestinal provoqué par l’inflammation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les Bregs pour traiter les MII et empêcher le développement de cancers associés, ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté, l'intestin. Les MII, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, sont des troubles chroniques et récidivants du tractus gastro-intestinal. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif des MII. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale aberrante chez ces patients. L'activation de la réponse immunitaire est normalement contrebalancée par des lymphocytes régulateurs, tels que les lymphocytes B régulateurs (Bregs). Les Bregs sont déficients dans les MII et donc incapables de bloquer la réponse inflammatoire conduisant à la maladie. Il existe un grand espoir qu'il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices à ces patients. Les Bregs peuvent être produits en grand nombre par différenciation des cellules B naïves à l'aide d'un protocole récemment établi.

Procédures

La colite sera induite dans 1404 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson. Ces souris suivront 8 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chacun de ces traitements. 1) injection de Bregs, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 90 souris. 2) injection de PBS, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 15 souris. 3) injection de Bregs, analyse J10 : 345 souris. 4) injection de PBS, analyse J10 : 210 souris. 5) Injection de Bregs, analyse J28 : 384 souris. 6) Injection de PBS, analyse J28 : 96 souris. 7) pré-traitement AOM, injection de Bregs, analyse semaine 12 : 216 souris. 8) pré-traitement AOM, injection de PBS, analyse semaine 12 : 48 souris.

Impact sur les animaux

La colite aiguë est induite par ajout de DSS dans l'eau de boisson pendant une semaine à une concentration de 4,0 % (modèle aigu). Pour le modèle chronique, les souris ont une eau de boisson avec du DSS à 2,5 % pendant une semaine, puis une semaine pendant laquelle l’eau de boisson ne contient pas de DSS, suivie par une semaine avec de l’eau de boisson à 2,5% en DSS (modèle chronique). Dans le modèle aigu, les souris développent la colite quelques jours après l'administration de DSS. Pour le modèle chronique, la concentration de DSS a été optimisée afin que les souris développent une maladie plus légère. Dans le modèle chronique, les souris développent progressivement la colite après le premier cycle d'administration de DSS et sont en rémission pendant la semaine suivante, puis la maladie rechute avec le deuxième cycle d'administration de DSS et se rétablit progressivement après le retrait du DSS. L'induction d'un cancer associé à une colite se fait par injection intrapéritonéale d'AOM suivie de trois cycles d'administration de DSS via l’eau de boisson (modèle AOM/DSS). Dans ce modèle de cancer, les symptômes sont provoqués par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par DSS. Les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur sont généralement peu nombreux et le nombre d’animaux devant être mis à mort pour atteinte de point limite est généralement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole de production des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures contenant uniquement des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le besoin d'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l'effet Bregs dans des modèles de MII et de cancer du côlon associé. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires et impliquent des processus d'interaction entre différents types de cellules et des migrations cellulaires qui ne peuvent actuellement pas être modélisés in vitro. Les maladies inflammatoires intestinales impliquent également la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, puis l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction des MII a été optimisé de manière à ce que les maladies se développent de façon homogène chez des souris génétiquement identiques, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valides. Des mesures de remplacement et d'affinement ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires à ce projet. Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et sur les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power. Nous comparerons le jour d'apparition des signes cliniques, le score clinique maximum et l'incidence de la maladie avec le test de Mann-Whitney, et le niveau global de la maladie avec des ANOVA à mesures répétées. En outre, nous utiliserons une stratégie d'imagerie par luciférase pour suivre le devenir des Bregs au fil du temps sur le même animal, ce qui réduit le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Le protocole d'induction des MII a été affiné de manière à ce que l'évolution de la maladie ne dure que 10 jours dans le modèle aigu, si bien que les souris ne sont malades que pour quelques jours, et soit plus douce dans le modèle chronique afin de réduire la souffrance des animaux. Dans le modèle de cancer associé à la colite, les symptômes sont causés par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par le DSS. Le protocole a été raffiné au niveau des doses utilisées afin que les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur soient généralement rares. Nous avons établi des points finaux pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux, et par les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement pour les expériences avec le modèle de colite aiguë et deux fois par semaine pour les modèles de colite chronique et de cancer de l'intestin.

Choix des espèces

Les modèles de MII et de cancer colorectal proposés ici sont bien standardisés. Les connaissances disponibles sur ces modèles permettent de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de MII. Même si ces modèles ne sont pas une copie parfaite des MII ou des cancers associés, ils constituent des modèles utiles pour le développement de pistes thérapeutiques pour la pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est approprié pour ces études car cela correspond à l’âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est appropriée pour étudier cette maladie.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 600 tuées à l'issue et 40 réutilisées pour des formations. Chaque souris reçoit sous anesthésie une injection intracolonique de composés irritants comme l'huile de moutarde ou la capsaïcine, pour développer un modèle de douleur viscérale du côlon irritable. Le porteur indique que la stimulation ne peut être interrompue en fin d'observation, ce qui justifie la mise à mort des animaux dès la fin de la phase expérimentale. Il affirme que l'étude d'analgésiques chez l'animal vigile reste "la seule option" avant le passage chez l'humain.

Objectifs

Le syndrome du côlon irritable est un trouble gastro-intestinal caractérisé par des douleurs abdominales récurrentes associées à des troubles du transit intestinal. Environ 1 personne sur 10 dans le monde souffre du syndrome du côlon irritable et ce diagnostic est associés à une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des impacts socio-économiques importants. L’objectif de ce projet est de développer deux modèles d’hypersensibilité viscérale non invasifs et ne nécessitant pas l’hébergement isolée des animaux. Ce modèle est basé sur l’administration de composés irritants, l’huile de moutarde et la capsaïcine, naturellement présents dans l’alimentation. L’administration de ces composés permet de stimuler les voies nerveuses viscérales et cause un ensemble de comportements spécifiques qui sont quantifiés afin d’obtenir une estimation de l’hypersensibilité viscérale. Le développement de ces modèles permettra de tester le potentiel analgésique de composés pharmacologiques pour avancer leur développement.

Bénéfices attendus

La douleur viscérale est une cause récurrente de consultation médicale. Les options pharmacologiques pour la prise en charge du syndrome du côlon irritable, qui entraine des douleurs viscérales récurrentes, restent limitées et concentrées sur la régularisation du transit intestinal, bien que la douleur soit la plainte principale des patients. Ce projet vise à développer un modèle d’hypersensibilité viscérale qui sera intégré à batterie de tests conçue pour évaluer rapidement et sur un nombre réduit d’animaux le potentiel analgésique de composés pharmacologiques. Le développement et l’amélioration de modèles afin que ceux-ci se rapprochent de la physiopathologie du syndrome du côlon irritable soutient la recherche pharmaceutique dans le développement de traitements en raffinant les outils d’évaluation des molécules. Enfin, le test de composés pharmacologiques des batteries de tests est une bonne pratique recommandée afin d’augmenter la probabilité de succès des composés lors des phases cliniques de leur développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’administration de composés irritant naturellement présents dans l’alimentation par une injection intracolonique réalisée sur des animaux sous anesthésie gazeuse puis observés pendant les vingt minutes suivant leur réveil. Cette intervention type administration ne prend que quelques minutes. Chaque animal ne subira la procédure qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne inévitablement l’apparition de symptômes douloureux. L’administration intracolonique des composés irritants est réalisée sous anesthésie gazeuse afin favoriser le relâchement musculaire de l’animal et d’éviter tout dommage tissulaire ou stress lié à la contention. Les modèles d’hypersensibilité viscérale par irritation colonique entrainent un ensemble de comportements spécifiques (léchage de l’abdomen, étirement de l’abdomen, écrasement/pression de l’abdomen contre le sol, rétraction de l’abdomen) qui sont quantifiés afin d’obtenir une estimation de l’hypersensibilité viscérale pendant les 20 minutes d’observation. L’interruption de la stimulation chimique à la fin de la période d’observation n’étant pas réalisable, les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de la période d’observation.

Devenir

Le stimulus administré (i.e. injection d’une substance irritante dans le côlon) ne pouvant être effectivement interrompu à la fin de la période d’observation et l’hypersensibilité viscéral induite risquant de se prolonger, les animaux seront euthanasiés dès la fin de la phase expérimentale. Par ailleurs, pour la procédure 1 : le groupe Sham neutre qui reçoit un véhicule et le groupe naïf qui ne reçoit aucune substance pourront être réutilisés pour des formations. De ce fait, ces animaux (n=40) ne seront pas mis à mort à la fin de la phase expérimentale.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur (IASP), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans l’article princeps décrivant le développement des modèles ajusté pour prendre en compte la variabilité de ces modèles rapportée dans la littérature. Ce nombre est cohérent avec l’expérience du laboratoire dans des modèles équivalents (Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet.

Raffinement

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne nécessairement l’apparition de symptômes douloureux et l’objectif des études réalisées ne permet pas la mise en place de dispositions spécifiques (e.g. couverture analgésique). Le choix d’un modèle d’hypersensibilité viscérale aigue constitue un raffinement par rapport aux modèles chroniques qui augmentent la durée pendant laquelle les animaux sont exposés à des nuisances. L’irritation colonique subie par les animaux est limitée à la durée de l’observation et l’administration des composés est réalisées sous anesthésie gazeuse. La concentration des composés irritants sélectionnée sera la concentration minimale permettant d’éliciter une réponse reproductible avec le minimum d’effets secondaires pour les animaux. Les animaux seront suivis de près à la suite de l’instillation. De plus, avant l’instillation les animaux sont habitués au dispositif expérimental pour limiter les impacts sur leur bien-être. La procédure est arrêtée en cas d’atteinte de points limites tels que : Signes notables: freezing, tremblements, immobilité et signes sévères : morsure/mutilation de l'abdomen ou de la zone périanale, saignement anal, prostration/absence de réaction à la stimulation. Ces signes notables/sévères sont traités pour chaque animal. L'apparition récurrente de ces signes pendant la procédure entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet car les modèles développés dans ce projet l’ont initialement été chez la souris et bien reproduits et caractérisés dans la littérature. Les animaux utilisés seront des souris adultes, en cohérence avec la population humaine chez laquelle la prévalence est maximale.

12 porcs Landrace d'environ 28 kg vont être utilisés, et chacun subit en quatorze jours trois anesthésies générales, une laparotomie avec création de stomies sur l'intestin, sept prises de sang, trois IRM, trois biopsies et la pose d'un dispositif médical changé toutes les 72 heures sous sédation. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et tous les porcs sont tués à J14, après la dernière IRM. Le porteur écrit que chaque porc "sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif", ce qui fait de lui son propre témoin. Le but est de lever "les derniers risques" d'un appareil de réinstillation du chyme destiné aux patients porteurs d'une double entérostomie, avant une demande d'essai clinique puis la mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité d’un nouveau dispositif médical intestinal. Cette étude sur le gros animal permettra de lever les derniers risques liés au dispositif et de confirmer son fonctionnement en conditions physiologiques. Les performances de l’appareil seront objectivées par l’évaluation des bénéfices nutritionnels et l’étude de la morphologie intestinale. Les conclusions de cet essai permettront également d’optimiser l’appareil afin de proposer aux patients un produit fini, sécurisé et adapté à leurs besoins.

Bénéfices attendus

Cet essai nous permettra de confirmer les bénéfices nutritionnels de la réinstillation sur un gros animal. Des données microscopiques (Biopsies intestinales) et macroscopiques (poids, selles, prise de sang) seront collectées afin d'observer le changement morphologique de la muqueuse intestinale et l'évolution d'état nutritionnel de l'animal. Nous confirmerons que l'hypothèse de la réinstillation est efficace pour corriger l'insuffisance intestinale en augmentant la capacité d'absorption intestinale. Cet essai sera également une opportunité de confirmer la tenue du dispositif médical en conditions physiologiques ainsi que ses performances.

Procédures

Tous les animaux subiront : - 3 anesthésies générales (J0, J7, J14) - La pose d’un cathéter lors du premier bloc opératoire (J0) - Prélèvements sanguins (7 prélèvements : J0, J2, J4, J7, J10, J12, J14) - 1 laparotomie avec mise en stomie et création d’une jéjunostomie d’alimentation (J0) qui resteront en place pendant tout l’essai -1 radiographie d’opacification (J7) -Pose du DM sous anesthésie générale (J7) et changement sous sédation -3 IRM (J0, J7, J14) -3 biopsies, pendant l'opération sous Anasthésie Genérale (J0, J7, J14)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables correspondent aux points limites nécessitant l’euthanasie de l’animal, c’est-à-dire : L’observation simultanée de 3 points limites, qui persisteraient au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. La présence d’une blessure OU d’une stomie bouchée, enflammée, gonflée OU un saignement au niveau de la muqueuse OU une température corporelle élevée qui persisterait au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. Une respiration pénible nécessitant l’euthanasie immédiate de l’animal.

Devenir

Les procédures 1 et 3 seront réalisées dans le même temps opératoire. A l’issu de l’intervention, l’animal sera gardé en vie. La simulation du grêle court d’amont impose de maintenir l’animal en vie tout au long de l’expérience. Les procédures 4 et 5 regroupent la pose du DM et le changement toutes les 72h. L’animal doit rester en vie tout au long de la pose du DM afin d’observer l’évolution des différents paramètres nutritionnels, physiologiques et morphologiques. L’animal sera euthanasié à l’issu de la dernière IRM de masse graisseuse réalisée à J14 avant sacrifice (procédure 2).

Remplacement

Ce nouveau dispositif propose une nouvelle prise en charge thérapeutique qui doit être scrupuleusement validée. La mise à disposition d’une nouvelle technologie impose de rassembler des données pré-cliniques solides en termes de sécurité et de performances, notamment en vue d’une demande d’autorisation d’essai clinique sur l’Homme puis la mise sur marché. Ainsi, il est essentiel de réaliser des essais sur l’animal afin de valider le fonctionnement du dispositif en conditions physiopathologiques.

Réduction

Depuis le début du projet, aucun animal n’a été utilisé. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons réalisé un ensemble de tests sur banc d’essai (mannequin en plastique avec fabrication artisanale d’un système digestif). Aussi l’animal sera son propre témoin. Il sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif. Les résultats obtenus dans les deux situations seront comparés. Cette stratégie nous évitera de construire un groupe témoin et un groupe de test. Enfin, nous reproduirons scrupuleusement les conditions d’un intestin interrompu avec carences nutritionnelles partielles selon un modèle déjà validé et publié par une équipe de chercheurs allemands. La mise en œuvre de ce protocole nous évitera une étape de validation préalable sur un modèle animal.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 11 jours est prévue à l’arrivée du porc afin de réduire le stress de l’animal. En postopératoire, le porc sera extubé dès lors qu’il aura commencé à respirer spontanément. Les étapes chirurgicales seront réalisées sous lampe chauffante. Le porc sera ramené dans la cage lorsque la température corporelle physiologique sera atteinte (39–39.5°C). Les animaux auront un accès immédiat à l’eau et à la nourriture dès le premier jour postopératoire. Une voie veineuse centrale sera conservée en postopératoire à des fins de prélèvements sanguins. Pour éviter d'endommager le cathéter central, les animaux seront gardés dans des cages séparées, dans la même pièce. La voie centrale sera protégée par un pansement pour éviter toute blessure de l’animal. L'ensemble des procédures sera fait par du personnel formé, les animaux traités avec soin (traitement de la douleur lors du suivi, anesthésie) et dans un hébergement répondant à leurs besoins physiologiques (température, cycle de lumière 12h-12h, ...) et éthologiques (enrichissements, dimension des boxes...).

Choix des espèces

Pour une approche de recherche ciblée et spécifique d'un syndrôme de grêle court d'amont, un modèle animal approprié est nécessaire. Nous considérons les avantages et les inconvénients de chaque modèle afin de sélectionner le modèle le plus adapté. A cet effet, à la fois un petit modèle animal, tel que le rat, ou un grand modèle animal, tel que le porc, conviendraient. Nous considérons également la taille de notre dispositif. Les porcs ont de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Le modèle porcin constitue le modèle expérimental le plus approprié pour la recherche sur le syndrôme du grêle court d'amont et utile pour tester l’efficacité et la sécurité de ce dispositif destiné à l’utilisation humaine. Ainsi, des porcs Landrace pédiatriques pesant environ 28-29 kg seront utilisés pour la réalisation de ce projet.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras et sucré pendant 28 semaines induisant obésité et maladie du foie, une injection d'un virus AAV dans la veine de la queue, des prélèvements sanguins à la joue et à la veine porte, avant mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle d'une protéine hépatique dans la stéato-hépatite non alcoolique, avec des stratégies thérapeutiques annoncées pour l'humain. Le porteur affirme que l'étude de l'axe intestin-foie nécessite un "organisme entier" et des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la maladie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été supprimé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une maladie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme une grande différence entre les hommes et les femmes. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle hépatique de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Après les 2 semaines d'acclimatation, les animaux seront placés sous régime (WD). Dans la même semaine, nous injecterons un volume 100 microlitres de solution contenant les AAV à chaque animal au niveau de la veine de la queue. L'AAV est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. Après 14 semaines de régime, nous exposerons aussi les animaux à 1 prélèvement de sang à la joue (représentant moins de 5% de leur volume de sang total), le geste durera moins de 1 minute par animal. Après les 28 semaines de régime nous procèderons à 1 prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale. Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 28 semaines.

Impact sur les animaux

Le régime WD, qui est un régime enrichi en graisse, en sucre et en cholestérol, mime le régime consommé par les populations occidentales dans lesquelles l'incidence de l'obésité atteint 30% de la population, ce régime induit donc une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. L'AAV quant à lui est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. L'injection de l'AAV au niveau de la veine de la queue demandera une contention de l’animal qui peut entraîner un stress. Enfin, le prélèvement sanguin à la joue demandera une contention et peut entrainer un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après le prélèvement de sang à la joue et après l'injection au niveau de la queue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local la queue avant l'injection au niveau de la veine de la queue. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, l'anesthésie débute dans une cage à induction volatile. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal; apparence physique externe; signes cliniques mesurables; changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique supérieur ou égal à 3, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin et foie notamment) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, afin d’étudier spécifiquement le rôle de la protéine CAR dans cette pathologie systémique, la souris est actuellement le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels cette protéine a été supprimée au niveau de tout l’organisme (modèle knock-out KO). Enfin, nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (souris âgées de 7 semaines minimum)

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une rectite leur est induite par instillation d'une solution irritante (TNBS), suivie de la création de fistules anales par introduction de fils de suture manipulés plusieurs fois par semaine, d'administrations de composés par de multiples voies et d'un suivi par IRM. Le porteur décrit des prestations menées pour des "clients", certains animaux étant tués à la suite des effets indésirables des produits testés. Il affirme que ce modèle de rat est le "seul" disponible et un "prérequis indispensable" à l'étude chez l'humain, les alternatives in vitro étant selon lui inexistantes ou insuffisantes.

Objectifs

Les lésions anopérinéales au cours de la maladie de Crohn sont fréquentes : 1 malade sur 2 présentera une lésion anopérinéale dans les 20 ans. Les lésions anopérinéales secondaires de la maladie de Crohn (fistules simples ou complexes +/- compliquées d'abcès) ont un impact important sur la qualité de vie quotidienne des patients. Les lésions anopérinéales secondaires sont le plus souvent traitées dans un premier temps par une chirurgie en urgence associée à un traitement antibiotique. Les traitements actuelles sont insuffisants et des récidives demeurent très fréquente à court/moyen terme (>50% dans la plupart des séries). A long terme, les lésions anopérinéales de la maladie de Crohn présentent des risques évolutifs mettant en jeu la survie et la qualité de vie des patients, incluant notamment la destruction du sphincter anal et un sur-risque de cancer. L'objectif de ce projet est de tester différents traitements innovants dans le but d'obtenir une cicatrisation complète et durable des fistules dans un modèle expérimental de fistules anale chez le rat.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les fistules anales. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

(1) Induction d'une rectite par instillation rectal avec une solution irritante (1 fois au démarrage des études - durée 5 min). (2) Génération des fistules par introduction de fils de suture (1 fois - durée 15 à 30 min). (3) Manipulation des fils pour permettre la génération des trajet fistuleux (2 à 3 fois par semaine pendant 1 à 4 semaines - durée 2-3 min). (4) Application d'un traitement par voie orale (gavage - 1 min par administration), intrapéritonéale (1 min), sous-cutanée (1 min), transdermique (1 min), intradermique (1 min), intramusculaire (1 min), intraveineuse (1 min), transrectale (1 min) ou transfituleuse (bolus (1-2 min) ou perfusion (2-10 min)). Le composé à tester pourra également être appliqué localement par application sous forme de crème (1-2 min par application). (5) Imagerie par IRM 1 à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude (15-30 min).

Impact sur les animaux

1) Induction d'une rectite par Instillation TNBS. 2) Création de fistules anale sous anesthésie. 3) Les anesthésies pour l'imagerie IRM 4) Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec nos clients pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (10 par groupe).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses incluant les étapes d'anesthésies et d'analgésies nécessaires • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites (échelle de scoring), • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le modèle de LAP chez le rat que nous utilisons est le seul modèle disponible pour tester l'efficacité in situ de nouvelles approches thérapeutiques et est un prérequis indispensable à l'étude sur l'homme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.