Troubles gastrointestinaux

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées quotidiennement pendant douze jours, une partie étant des souriceaux non sevrés séparés de leur mère à chaque manipulation, pour tester des probiotiques destinés d'abord à un usage vétérinaire chez le chien. Le porteur décrit un objectif de commercialisation par un partenaire industriel et une application humaine à plus long terme, et indique que l'infection reste asymptomatique et auto-résolutive chez la souris. Il affirme qu'il est "nécessaire" de vérifier in vivo l'efficacité observée in vitro, aucun modèle ne reproduisant selon lui les interactions hôte-parasite-microbiote.

Objectifs

Giardia est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu'à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, font de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Nous avons établi que la microflore et certains probiotiques, comme les bactéries probiotiques Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus, in vitro et in vivo, montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot où nous avons pu confirmer ses propriétés anti-Giardia. A partir de ces résultats très encourageants, nous avons obtenus au laboratoire 4 nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée sur l’espèce hôte cible (le chien), mais aussi afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus sur ces différentes souches in vitro, par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. Nos objectifs sont la commercialisation par notre partenaire industriel de ce nouveau probiotique chez le chien, d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la giardiose basées sur l'utilisation de probiotiques ou de molécules actives.

Bénéfices attendus

La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels font appel à l’emploi d’antibiotiques, qui non seulement provoquent d’importants effets secondaires, mais sont également de moins en moins efficaces dû à l’émergence de souches résistantes à ces médicaments. Ce contexte préoccupant nécessite le développement de traitements alternatifs novateurs, et nécessite également des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote qui seront à la base de nombreuses thérapies innovantes. Giardia est un parasite ayant une prévalence importante dans l’industrie de l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans l’ensemble des traitements des animaux est un sujet de très haute importance étant donné l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de ce type de traitement alternatif est donc capital, en particulier dans ce type d’industrie. La réduction de souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des traces d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et vétérinaire est au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et pour le futur. Ce projet permettra à court terme le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application chez l’humain. Ceci pourrait permettre un développement de l’éventail thérapeutique, une amélioration de la prise en charge et du traitement de la maladie, pour in fine une amélioration de la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également l’avancement des connaissances fondamentales dans l’application de souches probiotiques produisant des composants toxiques pour le parasite, en particulier dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures dans l’application à la médecine vétérinaire et humaine depuis 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ce qui permettrait d’identifier de nouveaux axes de recherche fondamentaux ou appliqués.

Procédures

Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Prise de poids et gavage quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Prélèvement sanguin : 1 fois juste avant la mise à mort - Mise à mort

Impact sur les animaux

L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas nous procéderons à l’euthanasie immédiate des animaux concernés. Chez les jeunes souriceaux, un stress est engendré lors des gavages et pesées journalières, mais il est également dû à la séparation de sa mère, qui a lieu durant ces différents gestes. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère.

Devenir

A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Préalablement, l’activité transcriptionnelle, la quantité de protéine produite, ainsi que la capacité de ces protéines à hydrolyser les acides biliaires conjugués ont été étudiées afin de sélectionner uniquement des souches ayant un fort potentiel in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.

Réduction

Pour la procédure sur souriceaux non sevrés, le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour mesurer l’efficacité d’un traitement et comparer les traitements entre eux. Afin de déterminer le nombre d’animaux que nous utiliserons au cours de ces études, nous nous appuyons sur l’expérience de collègues ayant déjà utilisé ce modèle. De plus il a déjà été montré et validé par 2 publications que 12 animaux par groupe séparés en 2 lot de 6 animaux étaient suffisants. Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré que 16 animaux par groupe séparés en 2 sous-groupes de 8 animaux étaient suffisants.

Raffinement

Un suivi journalier du bien-être des animaux sera effectué via un cahier de suivi rempli quotidiennement. Les gavages intragastriques des animaux seront pratiqués par des expérimentateurs formés et entrainés. La présence d’une procédure d’entrainement spécifique permettra un raffinement des autres procédures présentes dans le projet. Un enrichissement de milieu sera mis en place pour améliorer les conditions d’hébergement des souris : ajout de cellulose déchiquetée et bâton à ronger. Une attention particulière sera faite pour réduire au minimum les temps de séparation mère-souriceaux dus aux gavages ou aux autres manipulations. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère. L’établissement de points limites s’appuyant sur des paramètres objectifs facilement quantifiables (poids, mobilité) sera mis en place afin d’éviter efficacement tout état de souffrance aux animaux.

Choix des espèces

Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.

398 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une invalidation du gène Bmp9 reproduisant la maladie de Rendu-Osler, sont isolées seize heures par mois pendant quatre mois pour recueillir leur urine et reçoivent des injections sous anesthésie sans être réveillées. Le porteur indique qu'environ 40 % des mâles peuvent perdre du poids rapidement et présenter des atteintes du foie et du rein, et que l'isolement peut les angoisser, tous les animaux étant tués pour prélever organes et tissus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue une maladie touchant plusieurs organes et s'aggravant avec l'âge.

Objectifs

La maladie de Rendu-Osler est une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste par des hémorragies, l’élargissement des vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes (atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, rupture de vaisseaux au niveau du foie, des poumons et dans des cas très rares dans le cerveau). Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Des gènes responsables de cette maladie ont été identifiées chez les patients atteints de Rendu-Osler. Le modèle de souris du laboratoire permet de reproduire la plupart des symptômes des patients. L’objectif du projet est de comprendre comment les vaisseaux sont perturbés chez les patients et à partir de nos observations de proposer de nouvelles pistes de traitement pour une meilleure prise en charge. Nous étudierons les vaisseaux de différents organes, et notamment ceux touchés dans la maladie de Rendu-Osler (poumons, foie, cerveau).

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier et caractériser des manifestations phénotypiques chez les souris Bmp9-KO s’apparentant à celles de la pathologie humaine (dilatations de petits vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses, malformations artério-veineuses dans les différents organes fréquemment touchés par la pathologie). Il est attendu que ces éléments apparaissent et s’intensifient sur les animaux vieillissants comme c’est le cas dans la pathologie humaine. Ces résultats apportent des connaissances fondamentales sur le développement de la maladie. Actuellement les patients ne bénéficient que de traitements pour limiter les symptômes ou leurs effets (traitement contre les saignements de nez, transfusion sanguine pour limiter les effets des hémorragies…) mais il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. Les attendus de ce projet sont d’apporter des connaissances scientifiques en recherche fondamentale, publiées pour être rendues accessibles à l’ensemble de la communauté scientifique. A plus longue échéance, l’objectif est, en étroite collaboration avec des cliniciens, d’élargir le champ des possibilités thérapeutiques pour les patients en ciblant des mécanismes de la pathologie qui n’avaient pas été explorés auparavant.

Procédures

Dans une des procédures, une fois par mois pendant 4 mois, les animaux vigiles sont isolés pendant 16h pour le recueil de leur urine. Pour toutes les autres procédures de ce projet, les animaux seront anesthésiés avant toute intervention (5 à 10 minutes avant tout geste invasif). Dans certaines procédures, les animaux recevront en plus un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Après anesthésie, les animaux peuvent recevoir par injection un produit qui diffuse dans l’organisme pendant 10 à 15 minutes selon les procédures. Les animaux ne sont pas réveillés à l’issue des procédures. Dans une seule des procédures, le groupe d’animaux vigiles recevra une injection d’un réactif (durée du geste n’excédant pas quelques secondes), qui diffusera pendant 3h avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont variables en fonction de la procédure. 1) Dans la procédure d’élevage, environ 40% des mâles peuvent présenter une perte de poids rapide. Les animaux mâles et femelles peuvent aussi présenter de manière variable et non prévisible des atteintes sur différents organes : foie et rein. 2) Dans la procédure de recueil des urines, les animaux peuvent être angoissés par l’isolement pendant 16h.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, sauf pour celle qui concerne le suivi métabolique, tous les animaux soient euthanasiés , afin de récupérer les organes, les tissus ou les cellules. A l’issue de la procédure de suivi métabolique, les animaux seront inclus dans la procédure «Etude de la prolifération cellulaire et collecte d’organes » au cours de laquelle ils seront euthanasiés pour récupérer les organes.

Remplacement

Il est possible d’obtenir des cellules de patients ayant les mutations responsables de la pathologie. Ces cellules sont utilisées pour des études sur la voie de signalisation in vitro. En revanche, il n’est pas possible à partir de ces cellules isolées (qui sont des cellules de poumon ou de foie) d’étudier la manière dont les jonctions anormales entre les veines et les artères se forment, ni d’étudier le retentissement de ces malformations sur différents organes tels que le cœur, ou les saignements intestinaux par exemple. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant reconstituer la pathologie de Rendu-Osler qui affecte différents organes et dont les symptômes s’intensifient avec l’âge. Il est également très difficile, pour des raisons éthiques, d’obtenir des cellules de foie ou de poumon d’individus sains.

Réduction

Nous avons effectué une analyse précise permettant de déterminer la taille des groupes nécessaires. 10 souris par groupe seront nécessaires. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tous les animaux ayant été utilisés dans la procédure pour le recueil des urines, pourront être utilisés dans une autre procédure. De la même manière, les animaux reproducteurs seront également réemployés dans d’autres procédures.

Raffinement

Afin de surveiller le bien-être des animaux, la mise en place de points limites et une visite quotidienne pour évaluer les différents points seront effectuées. Les points limites décrits sont des signes qui pourraient être observés pendant l’élevage de l’animal dans l’animalerie. L’ensemble des interventions sera effectué sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet seront des souris qui présentent une mutation génétique donnant les mêmes symptômes que les patients de Rendu-Osler. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le rôle de ce gène dans le développement de la maladie de Rendu-Osler. Les souris sont suivies tout au cours de leur vie. La maladie de Rendu-Osler est une maladie dont les symptômes apparaissent avec l’âge. Pour évaluer l’évolution des symptômes chez les souris, des groupes d’animaux seront constitués et analysés à différents âges pour comprendre le développement des anomalies et les premiers mécanismes qui se développent avant même l’apparition de symptômes.

48 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ions perchlorates dans l'eau de boisson pendant huit semaines, puis une colite est provoquée par instillation intrarectale d'un mélange d'acide et d'éthanol, l'animal étant maintenu allongé quinze minutes, avant une mise à mort trois jours plus tard. Le porteur teste l'hypothèse d'un lien entre pollution aux perchlorates et maladie de Crohn, et qualifie de "très modérée" la colite obtenue. Sur le remplacement, il affirme l'absence de méthode alternative et juge "indispensables" douze rats mâles par groupe.

Objectifs

Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire de l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive du rat.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment aucune information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse.

Procédures

Les animaux seront soumis pendant 8 semaines à des ions perchlorates administrés par le biais de l'eau de boisson ou non dans le cas des contrôles. Au bout de 8 semaines, une inflammation expérimentale du colon (colite) sera induite par administration d'un mélange d'acide et d'éthanol 50% par voie intrarectale (n=24 animaux au total). L'administration intrarectale du mélange d'acide et d'éthanol se fait très progressivement pendant environ 1 min. Les animaux doivent ensuite être maintenus allongés sur le dos, le tête orientée vers le bas, pendant 15 min supplémentaires afin de prévenir une éjection rapide du produit. Les animaux témoins "colite" (groupes Contrôles et Perchlorates) recevront 100µl en intrarectal d'un mélange sérum physiologique/éthanol. Tous les animaux seront mis à mort 3 jours après l'induction de la colite ou leurs témoins respectifs (solvant).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucune nuisance particulière sur les animaux. Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 8 semaines. Le modèle de colite expérimentale à la dose utilisée est un modèle de colite très modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité. impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=48; n=12/groupe expérimental, 4 groupes) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. S’agissant d’une étude exploratoire « preuve de concept », aucun résultat expérimental n’est disponible à ce jour. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure dans lequel les populations mâles et femelles seront étudiées. En conséquence, 12 animaux mâles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique et d'anti-inflammatoire qui auraient pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables mais ces traitements pourront être administrés avant induction de la colite si nécessaire. Nous fournissons en annexe une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose utilisée est une dose faible permettant d'induire une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat sont observés, excepté une perte de poids et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas d'un dépassement d'un score de 9, l'animal sera isolé de ses congénères et mis à mort par une injection d'euthanasiant chimique. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier. Des points limites ont été mis en place, ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années à cette espèce. Les animaux mâles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 8 semaines consécutives.

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des souches bactériennes dans l'eau de boisson pendant vingt-sept jours, hébergées seules pour mesurer leurs prises alimentaire et hydrique, et subissent un prélèvement de sang à la queue puis un prélèvement terminal par ponction cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que l'apport bactérien pourrait perturber le transit intestinal et que la prise de sang initiale représente 15 % du volume sanguin. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans le développement de composés thérapeutiques visant à moduler ou restaurer le microbiote afin de produire une hormone spécifique. Cette étude se déroulera en deux étapes avec une étape préliminaire ayant pour but de sélectionner la souche bactérienne la plus efficace. Dans un second temps, à partir de cette souche-candidat, une dose-réponse sera effectuée afin de déterminer la dose optimale pour les études futures.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés thérapeutiques visant l'humain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouveau composé modulant ou restaurant le microbiote permettant la production d'une hormone spécifique.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types de prélèvement, un prélèvement sanguin à D0 par la veine caudale (2x100µL) sur animal vigile et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque sur animal anesthésié par l'administration d'un mélange de kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.). Par ailleurs, les animaux auront des souches bactériennes par l'eau de boisson de D0 à D27. Les 24 souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

La nécessité de mesures individuelles de la prise alimentaire et de la prise hydrique implique l'hébergement individuel des animaux. L'administration des souches bactériennes par eau de boisson de D0 à D27 pourrait engendrer des modifications du transit intestinal (non prévue initialement dans l'étude). La seule manipulation pouvant engendrée une nuisance est le prélèvement sanguin à D0 (200µL) par la veine caudale (représentatif de 15% du volume sanguin total). L'ensemble des souris seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/Kg; i.p.). Les souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d'un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et hydrique et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudés sont les suivants : le poids corporel, la prise alimentaire, la prise hydrique, la cytokine IL-10 (serum) et l'hormone ocytocine (plasma). De plus, l'étape 1 du projet nous permet de réduire drastiquement le nombre d'animaux à utiliser pour la dose-réponse de l'étape 2. Cette étape préliminaire est indispensable pour le respect de la règle des 3R.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitement seront administrés via la nourriture ou la boisson, permettant de limiter les manipulations et le stress liés à l'administration des traitements. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois spécialement conçus pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine notamment). L'ensemble des souris sera euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J est le modèle de souris le plus classiquement utilisés et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 7 semaines, au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population de jeune adulte.