Autres troubles humains

50 souris âgées de 12 à 18 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde après un prélèvement de sang ou d'organes. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection d'antibiotique puis un gavage de Clostridioides difficile, ou des solutions témoins, et pendant 21 jours un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution, avec neuf prises de sang et neuf prélèvements de selles. Le projet vise à réduire, grâce à la seconde bactérie, la mortalité d'une colite provoquée chez la souris par la première, première cause mondiale de diarrhée contractée à l'hôpital. Parmi les effets attendus, le porteur ne cite pourtant que des réactions au point d'injection, des changements temporaires d'appétit ou de comportement et des effets de l'infection "potentiellement réversibles avec des soins appropriés".

Objectifs

La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisiterait en l’évaluation de l’efficacité et de la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.

Bénéfices attendus

- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.

Procédures

Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.

Réduction

L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 50 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 10 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.

Raffinement

Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.

Produire des sérums sur commande, un par animal, pour équiper en anticorps polyclonaux les services de diagnostic de l'établissement : 300 souris, 75 cobayes et 50 lapins vont être utilisés sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intrapéritonéales d'antigènes inactivés avec adjuvants, deux prélèvements sanguins à la lancette au niveau de la jugulaire pour les souris et les cobayes, puis une injection létale avant les prélèvements post-mortem. Aucun n'est gardé vivant ni placé, le porteur invoquant l'immunisation avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3, même inactivés. Il indique que les méthodes existantes, phage display, fusion cellulaire, puces, in vitro, servent la production d'anticorps monoclonaux et ne visent pas "l'ensemble des anticorps ciblant le maximum d'épitopes d'un antigène ou d'un organisme entier", d'où le caractère "incontournable" du recours aux animaux.

Objectifs

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire. Nous avons besoin pour cela de produire des anticorps dirigés contre ces agents biologiques après une immunisation effectuée soit chez la souris soit chez le lapin ou le cobaye. Le choix de l’espèce se fait en fonction de l’affinité et de la quantité souhaité ainsi que de l’agent biologique étudié. Tout agent pathogène sera inactivé avant injection afin de préserver l’animal. Des adjuvants pourront être utilisés pour favoriser les réponses immunitaires. Le nombre de sérum obtenu dépendra du nombre d’antigène à tester dans l’année. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an et autant de sérum. On peut ainsi produire 300 sérums avec les 300 souris pour 60 à 100 Antigènes qui nous seraient fournis. Pour les cobayes, 75 sérums pour 25 à 75 antigènes et pour le lapin : 50 sérums pour 25 à 50 antigènes, le tout sur 5 ans.

Bénéfices attendus

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront les 3 injections en IP pour l'immunisation, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant avant les 2 prélèvements (préimmuns et intermédiaires). Puis, in fine, l'injection en IP d'anesthésiant/euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. La durée de chaque injection contenant des adjuvants est d'environ 2 minutes maximum par animal. Pour les prélèvements intermédiaires à l'aide des lancettes au niveau des jugulaires pour les souris et les cobayes, le geste est rapide (1 minute environ par animal). Pour les lapins, une attente de 20-30 minutes pour s'assurer de l'effet de la crème lidocaïne avant le prélèvement dont la durée variera en fonction du débit sanguin (soit 2-3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles potentiellement dûes aux injections en IP pour les immunisations puis des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements finaux.

Devenir

Euthanasie. Les animaux sont majoritairement immunisés avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3 qui même inactivés ne sont pas compatibles avec la possibilité de réutiliser ces animaux dans une autre procédure ou d’envisager un placement.

Remplacement

A ce jour, seul l’utilisation d’animaux permet la production d’anticorps polyclonaux sur la totalité de l'antigène afin d'obtenir des tests de diagnostic et des outils de recherches efficaces et fiables (Immunofluorescence en particulier) utilisés dans les services concernés dans notre établissement sur des microorganismes identifiés ou pas encore, pathogènes ou non. Les méthodes alternatives existantes à ce jour telles que Phage display ou fusion cellulaire, puces, in-vitro ou ex vivo, sont des méthodes développées et utilisées à des fins de production d’anticorps monoclonaux ou test thérapeutiques ou pharmacologiques. Ils ne sont pas adaptés à nos besoins qui sont de viser l’ensemble des anticorps ciblant le maximum d’épitopes d’un antigène ou d’un organisme entier. L’utilisation des animaux reste alors incontournable pour nous.

Réduction

Un minimum d’animaux est utilisé pour des productions polyclonales ciblant la totalité de l’antigène. Chaque animal est son propre témoin : avant l’immunisation, du sérum pré-immun est prélevé pour s’assurer de la réponse immunitaire attendue. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an. Au total nous aurions au maximum : 300 souris, 50 lapins et 75 cobayes sur 5 ans.

Raffinement

Chaque groupe ou animal sera stabulé dans une cage dans un même portoir ou armoire ventilé durant la totalité de l’expérimentation. Chaque groupe ou animal sera suivi de manière quotidienne, un enrichissement approprié (en fonction de l’espèce : igloos, matériel de nidification) sera disposé dans chaque cage. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) et pesés (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. Une grille de Morton et Griffits adaptée sera utilisée pour suivre les animaux immunisés. Tout signe de douleur et/ou souffrance entraînera l’arrêt de la procédure et les animaux seront euthanasiés par injection de surdosage de produit létal précédée d’une sédation profonde. Lors de procédures de prélèvements des anesthésies générales et/ou locales seront réalisées en fonction de l’animal.

Choix des espèces

Les espèces choisies (souris, lapin et cobaye) sont celles retenues pour la production d'anticorps avec un titre relativement élevé en fonction de l'affinité du microorganime pour son hôte. Des souris âgées de 4-6 semaines seront utilisées. Des lapins âgés de 3 mois seront utilisés. Des cobayes âgés de 5-6 semaines seront utilisés. Le jeune âge de chaque espèce est favorable à une bonne réponse immunitaire.

Une lésion nerveuse, un défaut tissulaire ou une ligature de vaisseaux sont créés chirurgicalement chez une partie des animaux avant qu'un dispositif ne leur soit implanté, l'intervention pouvant durer plusieurs heures. 150 cochons, 150 moutons et 75 chèvres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des prises de sang pouvant aller jusqu'à une par semaine. Le porteur écrit que l'anesthésie générale évite "tous stress et douleur", tout en annonçant une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité de la technique. Il précise que l'effectif n'a fait l'objet d'aucune approche statistique, et que tous les animaux sont tués pour une nécropsie et un examen histologique destinés à établir la tolérance et la durabilité des implants.

Objectifs

Le système nerveux périphérique (SNP) est constitué des nerfs et des ganglions périphériques, il prolonge jusqu’aux organes le système nerveux central (SNC = cerveau et moelle épinière). Le SNP comprend le système nerveux somatique qui transmet des informations sensorielles de la peau, des muscles et des articulations et des informations motrices et participe à l’équilibre et la motricité. Les pathologies du système nerveux somatique se traduisent par des troubles moteurs et de l’équilibre, des manifestations sensitives anormales, des douleurs, elles peuvent avoir des origines traumatiques, métaboliques, inflammatoires ou génétiques. Lorsqu’elles atteignent la jonction avec les muscles sont qualifiées de neuromusculaires. Il comprend aussi le système nerveux autonome (SNA ou végétatif) qui assure de façon involontaire le maintien des fonctions organiques internes. Le SNA est constitué des systèmes nerveux sympathique et parasympathique aux fonctions de régulation réciproques sur l’homéostasie. Il assure la régulation de fonctions physiologiques comme la pression artérielle, la fréquence cardiaque, la température corporelle et la sudation, contrôle les équilibres hydrique et électrolytique ainsi que la miction, il contrôle les secrétions, la digestion, la défécation, la fonction érectile chez l’homme. L’objectif de ce projet de recherche est l’évaluation et le développement de nouveaux dispositifs médicaux, techniques chirurgicales et stratégies innovantes pour traiter les pathologies et les affections du système nerveux périphérique somatique, ou pour traiter les pathologies et les affections par une modulation du SNA. L’évaluation et le développement de ces dispositifs et techniques nécessitent une phase de recherche et de développement.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif neuropériphérique avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif neuropériphérique associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion nerveuse, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour réduire au maximum ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroidiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Le modèle porcin (n=150) est largement utilisé dans l’étude des implants neurologiques, le volume du crâne est adapté pour l’étude des dispositifs en développement pour une application chez l’Homme. Le modèle ovin (n=150) et le modèle caprin (n=75) présentent une longue région cervicale facilitant les abords chirurgicaux de l'emergence du système nerveux autonome et des ganglions nerveux. Pour toutes ces espèces, la distribution, la longueur et le diamètre des nerfs périphérique sont comparables à ceux de l'Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme. Les animaux pourront être des mâles ou des femelles.

Saignés sous anesthésie générale toutes les huit semaines au minimum, jusqu'à dix-huit fois chacun sur la durée du projet, 25 moutons et 15 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué au terme de ce projet, tous étant destinés à être réutilisés dans d'autres procédures, ceux jugés inaptes devant être replacés. Le sang prélevé alimente une banque servant à transfuser d'autres animaux non-humains pendant les chirurgies de validation de dispositifs médicaux implantables menées au laboratoire. Le porteur présente cette banque comme une mesure de réduction et de raffinement, alors qu'elle repose sur des saignées répétées infligées à quarante individus dont le nombre a été fixé sur les besoins en poches de sang du bloc opératoire, sans calcul statistique.

Objectifs

Le risque hémorragique est lié à la réalisation d'interventions chirurgicales complexes menées dans le cadre de l'évaluation et de la validation des dispositifs médicaux implantables et de leur techniques chirurgicales d'implantation. Ce risque est important lors de chirurgies invasives du compartiment cardio-vasculaire mais persiste néanmoins lors de toute intervention chirurgicale et ce malgré le respect des bonnes pratiques chirurgicales et d'hémostase. C'est un risque potentiellement létal inhérent à la pratique chirurgicale. Lors d'hémorragie importante per-opératoire, la transfusion sanguine permet de corriger le volume sanguin et l'hypoxémie du choc hémorragique par la perfusion des organes vitaux pour améliorer la survie du patient. L'objectif de ce projet est de décrire et d'encadrer l'utilisation d'animaux dans le cadre de la constitution et du maintien d'une banque de sang pour pouvoir répondre aux besoins immédiats en transfusion sanguine lors des procédures chirurgicales réalisées au laboratoire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est d'améliorer la survie et la récupération des animaux utilisés lors des procédures chirurgicales décrites dans les différents projets autorisés du laboratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins sous anesthésie générale. Les prélèvements pourront se faire au minimum toutes les 8 semaines, soit 18 pélèvements maximum par animal sur la durée du projet. La procédure est classée moderée.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie.

Devenir

Chaque animal utilisé dans ce projet pourra être réutilisé pour répondre à une nouvelle question scientifique dans une nouvelle procédure expérimentale de classe " légère", " modérée" ou " sans réveil", à condition que la gravité réelle des procédures expérimentales précédentes établie lors de l’appréciation rétrospective qui sera menée à l’issue de ce projet soit compatible avec une réutilisation (classes " légère" ou " modérée" uniquement). Après examen par un vétérinaire, l'animal devra avoir également pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et l’avis favorable du vétérinaire prendra en considération le sort de l'animal concerné sur toute sa durée de vie. Les animaux qui ne pourraient être réutilisés seront replacés.

Remplacement

Il n'existe pas de sang artificiel et le recours à des méthodes alternatives à l'expérimentation animale pour la constitution d'une banque de sang n'est à ce jour pas possible.

Réduction

Le recours à la transfusion sanguine constitue le seul traitement contre les conséquences potentiellement létales d'une hémorragie aigüe et qui impliqueraient l'utilisation d'un nouvel animal pour répondre à la question scientifique et aux besoins de l'éxpérimentation. La transfusion améliore la survie des animaux utilisés lors des procédures chirurgicales décrites dans les différents projets autorisés du laboratoire. La constitution d'une banque de sang au laboratoire permet de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux pour ce projet a été déterminé en fonction des besoins en poches de sang au bloc opératoire ainsi que de la durée maximale de stockage d’une poche de sang lorsqu’elle collectée, soit 35 jours à 4 degrés celsius. Une approche statistique n’est pas nécessaire pour déterminer le nombre d’animaux inclus dans le projet. Tout au long des projets chirurgicaux autorisés au laboratoire, pour lesquels un besoin potentiel en transfusion sanguine est identifié, les meilleures techniques et pratiques chirurgicales en termes d’hémostase seront appliquées pour réduire au maximum le recours à la transfusion sanguine et donc au nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet. Les animaux déjà prélevés au minimum 8 semaines au préalable et jugés aptes à être reprélevés après examen vétérinaire favorable seront utilisés pour minimiser le nombre total d’animaux dans le projet (utilisation continue).

Raffinement

Pour les animaux donneurs, l'utilisation d'animaux robustes et de grands gabarits sera privilégiée. La procédure de prélèvement est réalisée sous anesthésie générale la plupart du temps ou éventuellement sur animal sédaté. Le suivi renforcé des animaux donneurs pendant 48 heures permettra la mise en place d'un traitement adapté si nécessaire. Pour les animaux receveurs, le recours à la transfusion sanguine constitue le seul traitement contre les conséquences potentiellement létales d'une hémorragie aigüe et qui impliqueraient l'utilisation d'un nouvel animal pour répondre à la question scientifique et aux besoins de l'éxpérimentation. La transfusion sanguine améliore la récupération des animaux utilisés lors des procédures chirurgicales décrites dans les différents projets autorisés du laboratoire. La constitution d'une banque de sang au laboratoire permet de raffiner ces procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le recours aux espèces ovine et porcine est justifié par l'utilisation de ces espèces dans les projets autorisés au laboratoire pour l'évalution et la validation de dispositifs médicaux implantables ainsi que leur technique d'implantation. Le principe de compatibilité entre donneur et receveur implique que ces mêmes espèces soient utilisées dans ce projet. Ovins N=25 L'espèce ovine est en volume l'espèce la plus utilisée au laboratoire dans les procédures chirurgicales. Porcins N=15

Injectés sous la peau ou dans le derme, des dispositifs médicaux de type III sont testés sur des rats, des lapins et des cochons, ces derniers pouvant subir jusqu'à vingt biopsies cutanées sous anesthésie générale. 300 animaux non-humains, 200 rats, 50 lapins et 50 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart sont tués pour prélever les sites d'injection, et une partie des cochons biopsiés peut être gardée en vie pour une réutilisation, 10 animaux non-humains étant déclarés réutilisés toutes espèces confondues, le tout pour constituer des dossiers de mise sur le marché. Le porteur invoque le règlement européen 2017/745 et la norme ISO 10993, et affirme que seule l'implantation "dans un organisme complet et vivant" renseigne sur la réponse inflammatoire.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables, ainsi qu'au comportement de ces derniers au sein des tissus, notamment en ce qui concerne leur résorption et leur intégration.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits.ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatiblesen solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme 10993-6. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

Douze rats vont être utilisés pour mettre au point au laboratoire une méthode d'isolement et d'analyse des microparticules sanguines, sans question scientifique posée sur l'accident de décompression lui-même. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous tués à l'issue, pour prélever leur sang et leurs tissus. Chacun subit une contention et un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis, un mois plus tard, 135 minutes en caisson hyperbare qui simulent une plongée. Le porteur range parmi les effets attendus la douleur provoquée par les symptômes d'accident de décompression, et indique que l'effectif de douze repose sur des expériences précédentes sans qu'aucun test statistique ait été réalisé.

Objectifs

Il est communément admis que le facteur déclencheur de l’Accident de Décompression est la formation de bulles subséquente à la réduction de la pression ambiante. Les microparticules sont des vésicules extracellulaires circulantes libérées par les cellules sanguines (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales). Par les protéines qu’elles arborent à leur surface mais aussi par les molécules (protéines, microARN, …) qu’elles renferment, les microparticules jouent un rôle important dans la transmission d’information et, notamment, l’inflammation. Ainsi, par exemple, leur nombre et leurs caractéristiques sont modifiés dans les pathologies vasculaires. Il a été montré (i) : que leur nombre augmente après la décompression et (ii) : qu’elles sont capables d’induire certains symptômes de l’accident de décompression. De plus, certaines d’entre elles contiennent du gaz et pourraient constituer un site de formation des bulles circulantes pendant la décompression. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place, dans notre laboratoire, une méthode d’isolement, d’analyse et de caractérisation des microparticules dans le cadre d’études sur l’accident de décompression. Pour ce faire, nous avons besoin dans un premier temps, de récupérer chez des rats, des échantillons sanguins afin de valider le protocole d’isolement des microparticules à l’état de base et après l’exposition hyperbare. Dans un deuxième temps, la méthode d’analyse de ces microparticules nécessite de déterminer la concentration d’anticorps optimale pour le marquage des cibles d’intérêt, indispensable à leur détection et à leur analyse.

Bénéfices attendus

A court terme, le bon fonctionnement du protocole d’isolement des microparticules et de leur analyse permettra la mise en place d’une nouvelle expertise au laboratoire. A moyen terme, cette méthode sera utilisée pour la réalisation de projets nécessitant l’analyse de microparticules circulantes chez le rat. A plus long terme, cette méthode pourra être utilisée dans d’autres projets relatifs à l’accident de décompression dans notre laboratoire mais également dans des projets liés à l’inflammation ou à la dysfonction vasculaire.

Procédures

Les rats seront contentionnés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Un mois après, ils seront placés dans le caisson hyperbare pendant 135 min (30 min d’acclimatation + 105 min de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée) ; (2) : le stress lié à la contention et à l’anesthésie (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 5 minutes, et réalisé 1 fois) pour la réalisation des prélèvements sanguins ; (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée (acte de gravité modérée, d’une durée totale de 2h30) ; (4) : La douleur induite par l’apparition de symptômes d’accident de décompression lors de la période d’observation (ces nuisances seront modérées, d’une durée moins de 1 minute).

Devenir

Les 12 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des mécanismes à l’origine de l’accident de décompression. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé sur la base des expériences précédentes et aucun test statistique n’a été réalisé. Les effectifs demandés vont nous permettre de réaliser toutes les mises au point nécessaires à la mise en place de cette nouvelle méthode d’analyse. Les animaux seront intégrés progressivement par lot de 4. Nous commencerons par un premier lot de 4 animaux, puis, si besoin, nous passerons à un deuxième lot, puis à un troisième. Si les mises au point sont terminées avant d'utiliser tous les lots, le projet peut être arrêté, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport aux estimations initiales. Nous estimons à 12 le nombre d’animaux nécessaire au vu de la faible quantité de sang que nous pouvons prélever pour réaliser ces mises au point.

Raffinement

Une habituation au dispositif expérimentale (caisson hyperbare) sera réalisée avant l’entrée dans l’étude afin d’habituer les rats à l’environnement et de réduire le stress. Tout au long du projet, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De fait, nous disposons d’un important corpus de données pour ce type d’étude. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.

Gardés en vie pour être réintroduits plus tard dans d'autres protocoles, 50 porcs, 25 macaques à longue queue et 25 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur prélèvent sous anesthésie salive, cellules de joue, sang ou moelle osseuse, cette dernière ponction pouvant provoquer une douleur au point de piqûre et imposant au moins quatre semaines de récupération. Aucune question scientifique propre n'est posée ici. Ces prélèvements alimentent des tests in vitro préalables, destinés à décider si telle ou telle espèce sera utilisée ensuite, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour obtenir ces échantillons.

Objectifs

Cette demande correspond à un autorisation de prélèvements d’échantillons biologiques en dehors et/ou en amont de projet autorisés. Effectivement, il est parfois nécessaire de réaliser en dehors et/ou en amont de protocoles autorisés des prélèvements biologiques de petits ou moyens volumes/quantité (sang, moelle osseuse, salive, cellules buccales par exemple …) pour permettre la réalisation de test in vitro préalable à une étude.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces prélèvements sont de pouvoir étudier et évaluer in vitro certains paramètres liés à ces espèces. Ces résultats préliminaires établis in vitro en amont des protocoles d’expérimentation animale permettent de définir, de cibler et d’affiner l’intérêt et la rationalité d’utiliser ou non telle ou telle espèce, et potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans une démarche de respect de la règle des 3R.

Procédures

Prélèvements sous anesthésie : salive par aspiration (5 min), prélèvement de cellules de bas-joues par frottement (5 min), de sang (5 min) ou de moelle osseuse (15 min). Prélèvement unitaire suivi d’une période de récupération pour chaque individu.

Impact sur les animaux

Les prélèvements biologiques sont réalisés sous anesthésie de façon à atténuer le stress des animaux. Les prélèvements de salives, cellules buccales et de sang sont des prélèvements peu invasifs qui peuvent induire de l’inconfort. Les prélèvements de sang nécessitent un temps de récupération selon le volume prélevé. Le prélèvement de moelle osseuse peut induire une douleur au point de ponction et sera associée à une analgésie. Il nécessite un temps de récupération d’au moins 4 semaines après le prélèvement.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et pourront être introduits ultérieurement dans un autre projet expérimental dans le cadre d'une procédure légère ou modérée, après décision du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de remplacement possible pour l’obtention d’échantillons biologiques intrinsèques aux animaux pour tests in vitro. Ces prélèvements répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement.

Réduction

Cette autorisation correspond à des besoins ponctuels d’échantillons biologiques chez des animaux en dehors et/ou en amont de protocoles, c’est pourquoi aucune approche statistique n’est envisagée. Cependant les animaux concernés par cette autorisation, en première utilisation ou en réutilisation après un protocole antérieur, seront inclus ultérieurement dans différents projets d’études expérimentales pré-cliniques autorisés, selon décision du vétérinaire, ce qui contribue à une réduction du nombre d’animaux utilisés à moyen terme.

Raffinement

De façon à diminuer le stress et l’inconfort des animaux, les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, sur tapis chauffant. Le volume des prélèvements sanguins sera limité à la volémie de chaque individu. Leur fréquence sera limitée au temps de récupération par rapport au volume précédemment prélevé. Cependant, dans la grande majorité des cas, les volumes de sang prélevés seront largement inférieurs aux limites. Le prélèvement de moelle osseuse sera accompagné d’un traitement analgésique. De façon à diminuer les interventions et si les besoins scientifiques de mise au point le nécessitent, plusieurs prélèvements pourront être réalisés en même temps sur un même individu à conditions qu’ils n’altèrent pas la récupération de l’individu. De façon à s'assurer du bien-être des animaux prélevés, les points limites mis en place seront observés et appliqués si besoin. Les primates sont hébergés en volière de façon à respecter leur mode de vie en communauté. Les porcs, selon leur taille, sont hébergés par 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. L’ensemble des animaux sera soumis une surveillance quotidienne.

Choix des espèces

Les prélèvements échantillons biologiques de macaques, babouins et porcs, sont nécessaires à la connaissance de plusieurs paramètres en amont d’évaluation précliniques. Ces animaux présentent des similitudes au niveau anatomique, physiologique, métabolique et immunologique avec l’homme. Il s’agit de jeunes adultes et adultes correspondant aux animaux utilisés dans notre établissement selon l’objectif des projets.