Autres troubles humains

Administrations par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, intracérébrale, intravésicale ou par minipompe posée chirurgicalement, jeûnes pouvant durer seize heures, phase expérimentale allant jusqu'à douze mois : 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'effectif se répartit entre 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, pour une prestation de mesure de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués. La plupart seront tués pour récupérer les organes et de grands volumes de sang, 10 400 pouvant être gardés vivants et réutilisés s'ils sont restés moins d'une semaine en procédure après une administration unique. Le porteur écrit qu'un phénotype dommageable "n'affectera pas le bien-être animal", tout en précisant dans la même phrase que les animaux concernés pourraient boire davantage ou devenir obèses.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations de la SBEA. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués peuvent être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique et intracérébrale sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); injection intraportale ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Pour les administrations orales et oro-gastriques où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés avant et après le jeûne. Les volumes administrés et les fréquences d’administration respecteront les recommandations de la SBEA. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement. En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. De plus, les animaux seront réhydratés une fois par jour avec avec du Ringer Lactate. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance, les expérimentateurs seront formés pour reconnaître ces signes. Les poses et retraits d’implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait dans la vie de l’animal. Les voies intracérébrale, intrathécale et intraportale ne pourront être réalisées que maximum une fois dans la vie de l’animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Les implants (pose et retrait) ne pourront pas être combinés avec d’autres administrations nécessitant une chirurgie. A la suite de chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie, des soins locaux seront apportés si nécessaire. La fréquence de changement des litières sera augmentée si nécessaire et de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique. Les administrations oro-gastriques via un dispositif de gélules ne pourront être réalisées uniquement sur des rats de plus de 150g et les animaux devront être anesthésiés. Ces administrations pourront être pratiquées à une fréquence maximale d’une fois par jour avec le matériel adapté à la taille de l’animal. De plus, un lubrifiant inerte devra être utilisé afin de faciliter le passage de la canule dans l’œsophage. Les variations de poids seront enregistrées quotidiennement à la suite des administrations oro-gastriques. Les perfusions IV de plus de 15 minutes et de 30 minutes maximum devront être réalisées sur des animaux anesthésiés.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Le protocole s'achève par un prélèvement de sang poursuivi jusqu'à la mort de l'animal, dix à douze minutes sous anesthésie. Il concerne 120 790 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit d'abord deux injections d'une suspension cellulaire à quatorze jours d'intervalle, puis subit deux saignées de cinq à huit minutes à l'artère médiane de l'oreille, maintenu vigile dans une boîte de contention et refermé à la colle chirurgicale, avec une anémie de deux à six jours que le porteur reconnaît. Le sérum obtenu entre dans la fabrication d'un immunosuppresseur commercialisé dans plus de quatre-vingts pays, et le porteur décrit au titre de la réduction une sélection génétique menée sur les reproducteurs de l'élevage pour augmenter la quantité de sérum tirée de chaque lapin.

Objectifs

Le projet a pour objectif la production de sérum de lapin entrant dans la fabrication d'un médicament à usage humain, immunosuppresseur visant à lutter contre le risque de rejet de greffe chez l'Homme et également utilisé dans le traitement de l'aplasie médullaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la production d'un médicament humain, commercialisé dans plus de 80 pays à travers le monde et considéré comme un "life saving drug", c'est-à-dire un médicament vital pour de nombreux patients. Il est utilisé en milieu hospitalier. Ce médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé pour lutter contre les rejets de greffe chez l'Homme en période pré et post-opératoire. Le médicament est également utilisé dans le cadre de la prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques ainsi que pour le traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë corticorésistante. Enfin, le médicament sert au traitement de l'aplasie médullaire. Il est inclus sur la liste des médicaments critiques de l’Union Européenne (Union list of critical medicines), pour lesquels un stock minimal de 4 mois est requis afin d’éviter toute rupture d’approvisionnement des pays.

Procédures

Les animaux sont changés de cage au moment de la mise en place en salle de protocole et pesés individuellement. Puis le protocole comprend différentes étapes pouvant impacter les animaux : - une phase d'immunisation : l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu (durée : 1 minute) et l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu 14 jours plus tard (durée : 1 à 2 minutes) - un premier prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - un second prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille controlatérale sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - l’anesthésie de l’animal par injection intraveineuse d’un mélange d’anesthésiques sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : 1 minute), puis un prélèvement de sang terminal, jusqu'à la mort de l’animal (durée : environ 10 à 12 minutes).

Impact sur les animaux

Le protocole comprend différentes étapes sur les animaux inclus dans le projet : - une phase d'immunisation avec deux injections d'une suspension cellulaire sur animal vigile réalisées à 14 jours d’intervalle entrainant une douleur légère de courte durée ; - une phase de prélèvements avec deux prélèvements successifs à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile entrainant une douleur légère de courte durée ; - un prélèvement terminal sous anesthésie générale, entrainant une douleur légère de courte durée lors de l’anesthésie. Les prélèvements peuvent entrainer une anémie de courte durée (entre 2 et 6 jours) et celle-ci reste légère à modérée (selon une étude interne réalisée en 2023 sur le suivi de l’anémie des animaux par le biais de la mesure du taux d’hématocrite).

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure sont mis à mort, puisque le protocole prend fin à la mort des animaux lors du prélèvement de sang sous anesthésie générale.

Remplacement

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production d'anticorps polyclonaux tels qu'inclus dans la composition du médicament final. La diversité et la quantité d'anticorps produits par l'animal permettent une compatibilité sans équivalent avec un nombre très élevé de patients receveurs de greffes dans les différents pays du monde. Cette diversité n’est pas reproductible via la production d’anticorps in vitro. En effet, plus de 80 épitopes différents de cellules de l’immunité sont ciblés par le médicament, ce qui provoque chez le patient une immunosuppression majeure et durable.

Réduction

La procédure expérimentale appliquée a été définie afin d'obtenir la plus grande quantité possible de sérum par animal utilisé (sérum contenant la concentration requise en anticorps polyclonaux). De plus, un travail de sélection génétique mené sur les animaux reproducteurs de l'élevage a permis d'optimiser la quantité de sérum prélevée sur chaque lapin lors du prélèvement terminal, et d'améliorer la concentration en immunoglobulines du sérum produit. De plus, la répétition des prélèvements de sang, réalisée sous surveillance du bien-être des animaux, augmente la quantité moyenne de sérum prélevée par animal. Il est donc possible de fabriquer une plus grande quantité de médicament avec un nombre équivalent d'animaux utilisés. Enfin, les lapins mâles et femelles sont utilisés dans le cadre du protocole, ce qui permet d'inclure dans la procédure tous les lapins élevés au sein de l'établissement.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences de la règlementation et de respect du Bien-Etre Animal, ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger, de tunnels pour se cacher). Les animaux élevés ensemble depuis leur naissance sont de préférence hébergés dans la même cage, afin de limiter le risque d’agression entre lapins. Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement ; des fiches de suivi permettent d’enregistrer les soins adaptés prodigués aux animaux et de suivre l’évolution de l’état de santé des animaux. Un suivi renforcé est effectué sur les animaux durant les phases de prélèvements du protocole expérimental. Une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance excessive. Une prise en charge spécifique de la douleur par l'application d'un protocole d'anesthésie générale validé est appliquée lors du dernier prélèvement de sang. Enfin, l'utilisation de colle chirurgicale lors de chaque injection intraveineuse ou prélèvement de sang assure un meilleur confort à l'animal.

Choix des espèces

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe aucune méthode alternative permettant de produire le sérum entrant dans la composition du médicament humain in vitro. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin, espèce qui fait référence dans la production d'anticorps polyclonaux pour l'usage pharmaceutique. L’AMM du médicament fixe également l’âge et le poids requis pour utiliser les animaux dans le cadre du protocole expérimental. Les lapins ne sont inclus dans la procédure d'expérimentation animale qu'à partir de l'âge de 14 semaines et pour un poids minimum de 2,8 Kg. C'est en effet à partir de cet âge que leur système immunitaire est capable de produire les anticorps nécessaires à la fabrication du médicament humain, en quantité et concentration suffisantes. Les animaux sont également aptes à supporter les différentes phases de la procédure (prélèvements de sang répétés notamment).

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque l'agrégation de la protéine tau et un déclin cognitif dès cinq mois, et reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 28 jours, en alternant les flancs pour limiter l'inflammation aux points de piqûre. S'y ajoutent un passage de dix minutes dans un labyrinthe en croix et jusqu'à trois passages quotidiens de dix minutes en champ ouvert pendant cinq jours consécutifs, avant le prélèvement des cerveaux. Le porteur rappelle que la plupart des composés testés jusqu'ici ont échoué en essai clinique faute d'effet sur le déclin cognitif des patients, et qualifie néanmoins sa molécule de "très prometteuse" si l'effet se confirmait chez la souris.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la première cause mondiale de démence et est un problème de santé publique majeur. En 2019, 30 millions de personnes étaient atteinte de cette pathologie dans le monde. Elle se caractérise par un déclin cognitif progressif se traduisant par des pertes de mémoire et finalement l’installation d’une démence après plusieurs années. Au niveau cellulaire, l’un des marqueurs principaux de la maladie est l’agrégation anormale d'une protéine (la protéine tau) sur laquelle nous nous focalisons dans le cadre de ce projet. Cette agrégation, autrement appelée tauopathie se solde par la mort des neurones, cause du déclin cognitif chez les patients. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire chez la souris adulte montrent que la molécule 1) est distribuée au sein du cerveau, 2) restaure les troubles cognitifs associés au vieillissement, 3) prévient les troubles de la formation de nouveaux neurones, 4) améliore la connectivité entre les neurones. Nous avons montré que cette molécule a également un effet bénéfique au niveau de la vascularisation cérébrale. L’ensemble de ces résultats prometteurs nous a conduits à émettre l’hypothèse que cette molécule pourrait atténuer la tauopathie dans un contexte de maladie d’Alzheimer. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d'un composés dans un modèle de souris transgénique par l’étude de ces propriétés sur la tauopathie et de son effet pro-cognitif. Si nous établissions la preuve de son efficacité, cette molécule pourrait devenir un potentiel médicament dans le contexte de la maladie d’Alzheimer pour laquelle aucun traitement n’existe jusqu’alors.

Bénéfices attendus

Ce projet, qui a pour objectif d’évaluer un candidat médicament, pourrait apporter de nouvelles perspectives thérapeutiques si l’effet de la molécule testée était confirmé sur la tauopathie et se traduisait par une amélioration cognitive chez les souris transgéniques. Si la molécule testée permettait d’envisager un arrêt de l’évolution ou une amélioration du déclin cognitif, cette molécule serait très prometteuse car bon nombre de composés testés jusqu’alors ont échoués en essai clinique ces dernières années par manque d’effet significatif sur le déclin cognitif chez les patients.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidiennement avec la molécule développée, en intra-péritonéal. Pour limiter l'apparition d'une inflammation au point d’injection, les injections se feront alternativement dans le flanc droit et dans le flanc gauche de l’animal. Enfin, les animaux participeront à des tests cognitifs pour lesquels ils seront préparés par une acclimatation préalable afin de réduire leur stress potentiel. Pour les tests comportementaux, les souris seront placées 1 fois dans un labyrinthe en forme de croix pendant 10 minutes. Pour d’autres tests comportementaux, les souris seront placées, individuellement dans une boite (openfield) pendant 10 minutes, 1 à 3 fois par jour pendant 5 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les souris seront injectées quotidiennement avec la molécule pendant 28 jours. Ces injections qui nécessitent de manipuler l'animal ce qui peut induire un stress ponctuel de quelques minutes et une douleur légère au point d'injection. Enfin, une perte de poids pourrait être associée au traitement. La répétition des injections quotidiennes pendant 28 jours pourrait également conduire à des nuisances additionnelles pour les souris (perte de poids / répétition d'un stress potentiel). C'est pourquoi le dégré de gravité de cette procédure est modérée. A l'âge de 5 mois, les signes cognitifs observés n'altèrent pas gravement l'état général des animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux seront prélevés pour valider l’action de la molécule. Ainsi, à la fin de l’étude, l’effet pro-cognitif de la molécule pourra être déterminé dans le cadre de tauopathies.

Remplacement

L’étude de l’effet de la molécule sur la tauopathie pourrait être menée sur des cellules en culture mais cette alternative ne permettrait pas de mettre en evidence l’effet pro-cognitif du composé qui représente un aspect fondamental de cette étude.

Réduction

Pour ce projet, des animaux transgéniques et des animaux controles seront testés à l'aide de tests comportementaux. Pour ce type d'expérimentation, les effectifs nécessaires pour obtenir des statistiques robustes ont été déterminés par un test statistique via un logiciel spécialisé. Ainsi, grâce a ce logiciel, nous nous sommes assurés de pouvoir obtenir des résultats statistiques exploitables en employant un nombre d'animaux minimal. Au cours du projet, des analyses statistiques intermédiaires seront réalisées et si les résultats des expériences sont déjà robustes, cela nous permettrait de réduire encore le nombre de souris déterminé au départ.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement 2 à 3 minutes par les mêmes expérimentateurs pendant 7 jours avant le début des expérimentations. Ces mêmes expérimentateurs feront les injections et les tests comportementaux tout au long du projet. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettront de garantir leur bien-être. Une grille d'évaluation permettra de suivre l'état général des animaux. En cas de dégradation de cet état général, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter de prolonger une éventuelle souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de souris transgéniques a été choisi pour ce projet du fait de sa pertinence scientifique pour l’étude de notre molécule et de l’expertise du laboratoire partenaire sur ce modèle. En effet, depuis plusieurs années, le modèle est implanté dans ce laboratoire et fait l’objet de nombreuses caractérisations de la tauopathie. Le laboratoire dispose d’une banque de réactifs qui permettent de caractériser très précisément l’évolution de la pathologie dans ce modèle. Ainsi, les partenaires sont capables grâce à leurs outils d’évaluer au mieux les effets de la molécule testée. De plus, ce modèle de souris transgéniques fait l’objet de nombreuses publications scientifiques montrant un déclin cognitif dès 5 mois chez les animaux transgéniques ce qui valide le recours à ce modèle pour étudier l’effet pro-cognitif de notre composé.

Automutilation, saignement incontrôlable, perte de poids supérieure à 15 % : un seul de ces signes suffit à déclencher la mise à mort. 96 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour que leur calvaria soit prélevée et analysée. Chaque animal reçoit deux trous de quatre millimètres percés dans la partie supérieure du crâne, comblés par un matériau expérimental, puis des radiographies hebdomadaires sous anesthésie courte et deux injections de colorants. La perte osseuse visée chez l'humain concerne la mâchoire, mais le crâne a été retenu parce qu'il simplifie l'opération.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester de nouveaux matériaux pour combler une perte osseuse importante (plus de 1 cm²) dans la mâchoire humaine. Ces matériaux doivent favoriser la repousse osseuse, permettre une bonne circulation sanguine et lutter contre les bactéries. L'expérience sera menée sur des rats. Au lieu de la mâchoire, nous choisirons la partie supérieure du crâne pour créer le défaut osseux. Cela simplifiera l'opération et améliorera le bien-être des animaux en réduisant les risques de complications. Les matériaux testés forment une structure poreuse composée d'un plastique biodégradable et de particules de verre spéciales, parfois enrichies d'un élément antibactérien. Ils sont conçus pour être suffisamment solides pour être manipulés par les chirurgiens et supporter la repousse osseuse. Nous avons déjà évalué plusieurs propriétés de ces matériaux, notamment leur dégradation dans l'eau, leur toxicité pour les cellules et leur efficacité contre les bactéries. Des essais préliminaires sur des rats n'ont montré aucun effet secondaire négatif.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider chez les animaux le potentiel de régénération osseuse et de revascularisation d’un matériau poreux constitué d’un réseau de bioverres (supplémentés ou non avec un ion cationique) et d’un polymère biodégradable. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement pour la reconstruction osseuse consécutive à l’ORN (ostéoradionécrose, une complication sévère de la radiothérapie, liée à un défaut de cicatrisation du tissu osseux). Ce matériau a pour objectif d’être pratique à utiliser pour les cliniciens et efficace pour la repousse osseuse, la revascularisation et ayant effet antibactérien (propriété de l’ion cationique).

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé ou non en cation au niveau d’un défaut osseux critique sur la partie supérieure du crâne (calvaria) de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Certains des animaux seront anesthésiés de manière hebdomadaire sur des temps courts pour effectuer des radiographies de suivi de repousse osseuse (temps 10 à 20 secondes). L’ensemble des animaux vigiles seront aussi soumis à deux injections intrapéritonéales de colorants vitaux de quelques secondes, 14 et 2 jours avant leur mise à mort. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (4 mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie, l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort. Les cadavres des animaux seront évacués exceptés les calvarias qui seront prélevées, fixés et préparées pour réaliser les analyses radiologiques et histologiques au laboratoire qui permettront l’évaluation de la néoformation osseuse et des propriétés angiogéniques des biomatériaux.

Remplacement

Cette étude portant sur le tissu osseux, il n'existe pas de solution de remplacement utilisant des invertébrés L'utilisation de rongeurs reste donc nécessaire afin de vérifier si les nouveaux matériaux sont bien tolérés par l'organisme et s'ils favorisent la croissance osseuse. Dans ce but, des études ont été réalisées en laboratoire sur des cellules, il est maintenant nécessaire de tester nos matériaux sur des petits animaux vivants pour observer les effets réels sur un organisme entier.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les biomatériaux utilisés ont été sélectionnés en amont et déjà testés in vitro et in vivo (expérience pilote) pour leur biocompatibilité. Lors de la procédure, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animal, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. De plus, une étude bibliographique nous a permis de déterminer la quantité d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs (n=7). Cela nous permet ainsi de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, reproductibles et valorisables. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au strict minimum.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 20 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les rats seront ensuite transférés dans une couveuse chauffante le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les rats seront hébergés en groupe sociaux de 2 individus par cage avec enrichissement physique sous forme de tunnel en carton 12x9cm, un bâton de bois à ronger et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours. Cela étant, nous serons vigilants à ces critères: - Signes cliniques notables (Le point limite est atteint en présence de 3 signes simultanés) Lésion sans effraction cutanée Signes spécifiques: grattage de cicatrice en regard de la reconstruction calvariale Agitation/agressivité Hypomotilité/hyporéactivité Incoordination modérée Stéréotypie Poil piqué Coloration anormale de la peau Flaccidité musculaire généralisée Gonflement abdominal Zone ano génitale souillée Fèces liquides Fèces mucoïdes Perte de poids inférieure à 15% Diminution/absence de prise de nourriture -Signes cliniques sévères (Le point limite est atteint en présence d’un seul signe) Lésion sévère automutilation masse ulcérée Signes spécifiques: infection de la cicatrice, saignement incontrôlable, plaie suintante Akinésie Décubitus Difficulté/impossibilité de mobilisation Incoordination marquée Tremblements généralisés Convulsion Hémiplégie Persistance du pli cutané Coloration jaune ou bleue des muqueuses Voussure du dos/dos cambré Absence de fèces Urines rouges Perte de poids supérieure à 15% Absence de prise de nourriture> à 2/jour En cas d’apparition d’un de ces symptômes malgré le traitement antalgique adapté ou en cas d'atteinte du point limite l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgés de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

Mesurer combien de nouveaux antibiotiques passent dans le liquide cérébro-spinal, en vue d'ouvrir la voie à un essai clinique : 848 souris femelles vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour analyser leur cerveau. Elles reçoivent dans le ventre un lipopolysaccharide destiné à mimer une inflammation infectieuse, puis un inhibiteur de transporteurs, puis l'antibiotique. Le crâne est rasé et la peau incisée sur un centimètre pour ponctionner cinq microlitres de liquide cérébro-spinal, avant un prélèvement de sang à la veine de la queue. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et décrit un effectif calculé "au plus juste", qui comprend 10 % de souris supplémentaires prévues en cas de mortalité.

Objectifs

Les infections bactériennes au niveau cérébral sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance des bactéries, les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, plusieurs molécules sont recommandées dans les infections cérébrales cependant ces antibiotiques peuvent présenter des effets indésirables sévères et générer des résistances bactériennes. De nouveaux antibiotiques, actifs sur les bactéries résistantes, possèdent de plus longues durées d'action et moins d'effets indésirables. Cependant, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion au niveau cérébral. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral. Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système cérébral de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

La possibilité d’usage de ces nouveaux antibiotiques pour lutter contre les infections cérébrales par des bactéries résistantes est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système cérébral de la souris pourront ouvrir les portes à un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Nous administrerons aux souris, par voie intra-péritonéale en 10 à 15 secondes : des antibiotiques, du lipo-poly-saccharide (afin de mimer une inflammation liée à une infection), ainsi que des molécules inhibitrices des transporteurs de médicaments afin d’explorer les mécanismes de passage des antibiotiques au niveau cérébral. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Cérébro-Spinal (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le liquide cérébro-spinal puis le sang seront prélevés. Pour prélever le liquide cérébro-spinal, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement d'un anesthésiant 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection d'antalgique 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipo-poly-saccharide par voie injectable en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 30 minutes après l’administration de lipo-poly-saccahride et 2 heures après l'administration de la molécule inhibitrice.

Impact sur les animaux

Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (cerveau).

Remplacement

L'utilisation des animaux est indispensable en raison des nombreux mécanismes impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte le devenir du médicament dans l'organisme ou des effets comme l'inflammation. Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système cérébral de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre minimum de points de dosage des médicaments (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le liquide cérébro spinal. Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point de dosage est nécessaire. Des analyses statistiques des résultats sont réalisées. Le nombre de 848 souris nécessaires au total (8 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Les prélèvements du liquide cérébro spinal (5µl) et du sang (200µl) se font sous anesthésie. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le liquide cérébro spinal, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale par voie injectable 10min avant prélèvement du liquide cérébro spinal. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipopolysaccharide, et les souris recevront un traitement antidouleur par voie injectable 30 minutes avant l’injection du lipopolysaccharide. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du lipopolysaccharide. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaire pour pouvoir étudier les concentrations des médicaments dans le sang et le liquide cérébro spinal.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Évaluer pour un sponsor l'efficacité d'un implant d'hydrogel contenant des îlots de Langerhans humains conduit à utiliser 2 000 souris et 500 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de projet pour récupération des tissus, des organes et du sang. Les implants sont posés ou retirés par chirurgie intrapéritonéale sous anesthésie d'une heure, avec administrations de glucose par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, jeûnes pouvant aller jusqu'à six heures, et hébergement individuel sans enrichissement pendant deux heures pour la collecte d'urine et de fèces. Le point limite est fixé à plus de 20 % de perte de poids, ou à un maintien au-delà de 15 % pendant plus de trois jours. Le nombre d'animaux par groupe, de 5 à 15, est établi sur les données du sponsor.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel sur une souche de souris immunodéficiente. L’implant est à base d’hydrogel conçu pour le traitement curatif du diabète de type 1 par thérapie cellulaire. En cas de diabète de type 1, les cellules bêta des îlots de Langerhans sont détruites par un mécanisme auto-immun. La transplantation d’îlots de Langerhans est le seul traitement curatif. Cette technique est pratiquée dans différents pays. Cependant, elle se heurte à un obstacle majeur : elle nécessite l’utilisation de traitements immunosuppresseurs lourds (comme toute allogreffe) présentant des effets indésirables importants. L’implant, une matrice immuno-protectrice contenant des îlots de Langerhans, améliore significativement les protocoles actuels de transplantation :

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel chez la souris ou le rat.

Procédures

DDes implants intrapéritonéaux pourront être posés ou retirés par chirurgie. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Des injections ou administration de glucose pourront être réalisées par voie oral, intrapéritonéale ou intraveineuse (durée des injections de quelques secondes). Suite à ces administrations ou injections où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun durant 6h au maximum. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination du composé administré. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement durant une à deux heures (maximum 2heures). En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit (glucose ou autres). Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsque le constat aura été fait que la greffe des ilots de Langerhans est acceptée ou non par les animaux et que l’évaluation de la fonctionnalité des ilots aura été appréciée. Les animaux ayant été greffés ne seront pas réutilisés pour d’autres procédures ou projets.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot sera déterminé sur la base des expériences déjà menées par le sponsor, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue. Un minimum de 5 animaux par groupe devra être inclus (avec un maximum de 15 animaux par groupe). L’utilisation de tests ou d’outils statistiques sur les paramètres mesurés en cours d’étude permettront limiter le nombre d’animaux engagés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 15% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 15 et 20% du poids : les animaux seront réhydratés avec un soluté de remplissage 1 fois par jour. Une perte de poids de plus de 20% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 15% constituera un point limite. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les poses et retraits d’un implant seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait par animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Pour les implants intrapéritoneaux (pose ou retrait), sera ajouté un analgésique administré avant la chirurgie en sous cutané et/ou un anesthésique local en sous cutané au niveau de la zone d’incision avant l’incision. En fonction de la nature des implants, une couverture antibiotique large spectre pourra être mise en place en per et post opératoire. En fonction de la douleur associée à leur pose, une couverture par anti inflammatoire non stéroïdiens sera potentiellement mise en place. Suite aux chirurgies, de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les sutures seront nettoyées si besoin. La glycémie sera monitorée au cours des premières heures suivant la pose des implants. En cas d’hypoglycémie (par excès d’insuline synthétisé par les ilots), de la nourriture sera ajoutée, de l’eau sucrée pourra être donné au animaux anisi que des injections de glucose en sous cutanée.

Choix des espèces

La souris et le rat seront privilégiés pour évaluer la pharmacocinétique in vivo de la transplantation d’ilots de Langerhans humains encapsulés dans une matrice d’hydrogel, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation du diabète. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte permettant la réalisation de la chirurgie dans des conditions optimales. Les animaux adultes pourront mieux supporter la chirurgie et les injections ainsi que les potentiels effets secondaires des composés ou dispositifs à tester.

Enfermés seuls deux heures par jour pendant une semaine, le temps d'avaler un repas à base de viande, 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sous anesthésie, deux prélèvements de sang sont faits dans la veine porte et dans l'artère abdominale, avec les contenus digestifs, avant la mise à mort. Le projet cherche à identifier les peptides libérés par la digestion des protéines à deux âges, et le porteur revendique par là une contribution au remplacement, les données devant servir à valider un modèle de digestion in vitro. Le rat est retenu pour son espérance de vie de vingt-quatre mois, deux groupes étant comparés à six et à dix-huit mois.

Objectifs

La digestibilité, mais surtout la vitesse de digestion, sont des déterminants importants dans l’optimisation de l’apport protéique chez les populations cibles telles que les seniors ou les malades chroniques. En plus de son rôle de fournir des acides aminés à l’organisme, la digestion des protéines alimentaires conduit également à la libération de peptides. Ces peptides sont l’objet de nombreuses études en raison de leur importance dans le déterminisme de l’effet santé des aliments. En effet, le peptidome, défini comme l’ensemble des peptides issus de la digestion des protéines, varie quantitativement et qualitativement tout au long du tractus digestif. Ce peptidome contient des peptides potentiellement bioactifs à propriétés antioxydantes, antihypertensives, ou encore anti-diabétiques. La question de l’altération des fonctions digestives au cours du vieillissement est clairement posée concernant la digestibilité des protéines alimentaires, mais son impact sur le peptidome biologiquement actif reste non exploré, ainsi que son rôle dans l’altération de certaines fonctions du tractus digestif ou organes périphériques. Une des raisons de ce peu d’information sur l’impact du vieillissement du tractus digestif sur la composition du peptidome est qu’il faut faire face à un verrou méthodologique qui est l’identification par spectrométrie de masse des peptides issus de la digestion, dans un milieu complexe, appelée peptidomique ou digestomique. Par ailleurs, des questions se posent également concernant les modèles pertinents pour étudier la digestion des protéines alimentaires et la libération des peptides, i.e. in vivo sur digestats à différents niveaux du tractus digestif ou in vitro sur digesteur artificiel.

Bénéfices attendus

A court terme, les prélèvements de contenus digestifs d’aliments marqués permettront de travailler sur la mise au point d’une méthode d’identification des peptides issus de la digestion, sans ambigüité avec les peptides endogènes. Ce point est un verrou méthodologique très important limitant grandement les études sur la digestion des aliments protéinés. A moyen terme, ce projet permettra d’obtenir des données physiologiques objectives sur le vieillissement de la fonction digestive ; il s’agit là d’un véritable verrou de connaissance pour lequel il y a très peu d’éléments de bibliographie. Lever ce verrou permettra d’approfondir les recherches sur les difficultés d’adaptation au cours du vieillissement des organismes à leur environnement ; des défauts d’adaptation pouvant potentiellement conduire à des dysfonctionnements métaboliques et fonctionnels des organes. Le long du tractus digestif, une altération et/ou diminution de l’efficacité de la digestion des aliments affecte la dégradation des aliments en nutriments, leur biodisponibilité et leur devenir métabolique. En conséquence, une moindre biodisponibilité en nutriments est un des éléments potentiellement explicatifs du développement de la malnutrition des séniors et augmenterait le risque de développement de pathologies associées au vieillissement. Il est en effet aujourd’hui admis que le besoin en acides aminés d’origine alimentaire est augmenté lors du vieillissement, et que l’apport en protéines alimentaires doit être supérieur à celui d’individus adultes plus jeunes. Les raisons sont multiples, et notamment d’origine métabolique, mais une altération de la digestion des protéines et de sa vitesse a été évoquée pour expliquer cela. In fine, la combinaison des résultats obtenus avec ceux obtenus in vitro en utilisant le protocole standardisé de digestion in vitro permettra à plus long terme de valider cette approche pour l’étude de la digestion chez l’âgé, et permettrait à l’avenir de s’affranchir de modèles in vivo sur animaux. Par ce biais, ce projet participe à apporter des éléments à un des piliers des 3R, le Remplacement.

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles, 2h par jour pendant une semaine, le temps de manger un repas à base de viande. En fin d'expérimentation, après un repas ils subiront sous anesthésie et analgésie 2 prélèvements de sang (en veine porte et en artère abdominale) et de contenus digestifs. Après les prélèvements qui dureront moins de 10 minutes, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les procédures nécessitent de contrôler la consommation alimentaire des animaux et requiert donc une mise en cage individuelle des animaux pour le temps du repas. Celle-ci sera faite 10-12 jours avant le protocole expérimental afin d’acclimater les animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de procéder à des prélèvements de tissus et organes pour des analyses.

Remplacement

Le seul modèle de digestion in vitro repose seulement sur des recommandations sur des paramètres physiologiques (pH, concentration en enzymes, durée de vidange des compartiments digestifs) moyennés selon les informations issues de la bibliographie. Comme le mentionnent les auteurs eux-mêmes, des études sont nécessaires pour valider ce modèle in vitro chez le sénior et s’assurer que les adaptations du protocole de digestion in vitro sont bien représentatives de la physiologie digestive au cours du vieillissement. Il y a donc un réel besoin de données objectives quant à la physiologie digestive au cours du vieillissement afin de pouvoir valider le modèle in vitro et ainsi proposer une alternative fiable aux modèles animaux. Néanmoins, si nos résultats de tests de comparaison entre les données in vivo et in vitro sont concluants, nous pourrons utiliser, lors d’étude ultérieures, les modèles in vitro pour étudier la génération de peptides lors de la digestion chez les adultes jeunes et âgés, au moins lors des étapes de screening lors d’étude ultérieures.

Réduction

La mise en œuvre de la première procédure pour étudier la faisabilité de plusieurs conditions a été conçue pour réduire au maximum les effectifs de la seconde procédure, et notamment limiter les conditions Témoin (i.e repas sans protéines), si les résultats de marquage des protéines permettent de distinguer les peptides alimentaires des peptides endogènes, et donc permettent de s’affranchir du groupe ‘Témoin’.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à 2 par cage pour une période de deux semaines correspondant à la période d’habituation et d’acclimatation à l’animalerie. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard d’animalerie conventionnelle, dans des cages de taille conforme à la réglementation (1800 cm3) et transparentes afin que les animaux puissent se voir et positionnées proches les unes des autres afin que les animaux puissent s’entendre et se sentir. Les animaux bénéficieront d'enrichissement de leur environnement : ils auront dans leurs cages des objets en inox : balles et tunnels en alternance pour continuer à susciter de l'intérêt Les animaux seront pesés 2 fois par semaine et observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés.

Choix des espèces

L’étude porte sur les modifications de la fonction digestive au cours du vieillissement. Pour cela, deux populations de rats seront comparées, âgées de 6 et de 18 mois.Les animaux seront des rats Wistar âgés de 6 mois (jeunes) et 18 mois (âgés). Le rat est un animal de référence dans les études sur le vieillissement de par son espérance de vie de 24 mois.