Autres troubles humains

Six échantillons de biomatériau sont implantés sous la peau de chaque rat, ce qui permet de limiter l'effectif à 15 animaux sur trois ans. Ces 15 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse histologique des échantillons implantés. L'intervention dorsale dure une trentaine de minutes et peut provoquer une douleur modérée, l'évaluation de cette souffrance étant confiée au personnel de l'animalerie. L'étape sert à vérifier la biocompatibilité de matrices osseuses avant leur implantation en site osseux, le porteur indiquant que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur des animaux non-humains avant tout essai clinique.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe où le patient est son propre donneur est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Ce projet vise à évaluer de nouveaux matériaux réalisé par une technique de fabrication spécifique (moulage dynamique). Cette nouvelle technologie de fabrication permet de créer des matériaux avec plusieurs tailles de porosités (interne et externe) afin de d'améliorer les propriétés de la matrice, et dont le design peut être adapté à l’indication clinique ciblée. L'objectif de cette étude est d'évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés grâce au modèle d'implantation sous-cutané chez le rat. Il s'agit d'un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité qui a l'avantage d'être facile à mettre en œuvre et reproductible.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à s'assurer de la biocompatibilité de ces nouvelles matrices avant de les implanter en site osseux pour évaluer leur potentiel pour la régénération osseuse. A plus long terme, ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matrices pour la régénération osseuse) dans la perspective d’une utilisation en clinique. La technique de fabrication (par moulage dynamique) pourrait permettre de fabriquer des matériaux sur mesure pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal. L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. De rares complications post-opératoires sont à envisager. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques des échantillons implantés

Remplacement

L'absence de toxicité cellulaire des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon la norme en vigueur. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de toxicité cellulaire in vitro, et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 6 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’acclimatation de deux semaines sera respectée avant le début des expérimentations afin d’obtenir une meilleure récupération post-opératoire. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'analgésique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés et placé sur un tapis chauffant. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Des critères stricts permettront d’évaluer le bien-être des animaux. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères avec présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. La lignée choisie est d’ailleurs volontairement identique à celle utilisée par d’autres travaux réalisés également au sein de notre unité, permettant la comparaison des résultats ainsi que la diminution du nombre d’animaux nécessaires, par la reprise de données déjà disponibles. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

15 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse histologique de leur fémur. Chacun passe environ une heure sous anesthésie gazeuse pour l'implantation, puis trois passages en IRM sous anesthésie, en hébergement individuel. Le porteur indique que les lapins supportent mal l'anesthésie et la chirurgie, qu'ils auront probablement des difficultés à s'en remettre et pourraient perdre leur mobilité. L'étude vise à valider un implant osseux résorbable, le porteur écrivant que les essais sur l'animal sont "indispensables" et que le recours aux animaux non-humains est de toute façon rendu obligatoire par le règlement européen pour obtenir un marquage CE.

Objectifs

Les implants métalliques, bien qu’ils soient largement utilisés dans la reconstruction osseuse, présentent des limitations significatives. Ils ne permettent pas une régénération complète de l’os, nécessitent souvent une seconde intervention chirurgicale pour leur retrait, et peuvent entraîner des complications telles que des infections. Ces contraintes renforcent le besoin urgent de développer des alternatives résorbables et biocompatibles, capables de s’intégrer dans l’organisme tout en évitant ces problématiques. Le projet repose sur l’utilisation d’un implant associant deux matériaux complémentaires. L'un est un polymère biodégradable, offrant un support mécanique temporaire grâce à sa résistance et sa stabilité initiale, tout en se dégradant progressivement pour permettre la régénération osseuse sans résidus toxiques. L'autre quant à lui, est reconnu pour sa bioactivité, favorisant la croissance osseuse grâce à ses propriétés de supportde la repouse osseuse. De plus, son action antibactérienne contribue à limiter les risques d’infections, un avantage notable par rapport aux implants métalliques conventionnels. Le choix du modèle animal repose sur le lapin, dont le métabolisme osseux est proche de celui de l’humain. Il fait partie des modèles animaux préconisés par la norme. Cela garantit une évaluation fiable de la biocompatibilité et de la résorption des implants dans un contexte physiologique pertinent. Le design de l’étude a été établi en conformité avec la norme, qui encadre l’évaluation biologique des dispositifs médicaux dans l’os, notamment les tests sur les effets locaux après implantation. L’imagerie IRM sera utilisée pour suivre l’évolution des implants in vivo, permettant une analyse détaillée et non invasive des performances de l'implant dans le temps. En fin d'étude les animaux seront euthanasiés pour réaliser des études histologiques des os.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de transformer durablement les pratiques dans le domaine de l’ostéosynthèse en proposant une approche thérapeutique améliorée : un implant bioactif et résorbable, évitant ainsi une seconde intervention et diminuant le risque d’infection. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant les dossiers en vue d’une mise sur le marché, et ainsi assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés chimiquement pour la réalisation de la procédure chirurgicale et les IRM. Les injections d'anesthésiques se feront dans le muscle et seront très bref, quelques secondes. Les animaux seront ensuite maintenus anesthésiés grâce à une anesthésie gazeuse. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de réalisation des différents actes, soit 1h environ que ce soit pour la réalisation de la chirurgie ou l'acquisition des images IRM. Il y aura 3 IRM par animal pour toute l'étude

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatibles. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu sur des cellules : les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. L’hébergement individuel provoquera un inconfort chez l’animal. Les effets attendus sur les animaux peuvent être dus à l’anesthésie (sédation profonde, difficulté de récupération,), ou à la chirurgie (inflammation de la zone opérée.). Les lapins étant très sensibles à l’anesthésie et aux procédures chirurgicales, ils auront probablement des difficultés à s'en remettre avec potentiellement une perte de la mobilité. Les contentions pour les actes techniques (anesthésie) ou quotidiens (pesée) engendreront un stress chez les animaux, les contentions seront de courte durée, quelques minutes par animal. Aucune mise à jeun n’est nécessaire avant les anesthésies.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin de réaliser des analyses sur le fémur.

Remplacement

Les essais de tolérance et de compatibilité avec les tissus sur l'animal sont indispensables en complément des tests sur les cellules, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permet d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires, et de caractériser les phénomènes de dégradation et d'intégration des différents produits. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le Règlement Européen, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est basé sur, la norme ISO 10993. Nous utiliserons 5 lapins par étude afin d’avoir le minimum d’observation demandé par la norme. Plusieurs études sont prévues car conformément à la norme ISO 10993, une nouvelle évaluation doit être fait en cas de modification du dispositif médical (modification de l’état de surface ou modification d’un matériau). Nous prévoyons de réaliser une étude par an sur 3 ans soit 15 lapins pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Tout d’abord le premier point de raffinement est l’utilisation de l’IRM. En effet, l'IRM est une technique non invasive, permettant d'obtenir des images internes du corps des animaux sans avoir à recourir à des interventions chirurgicales ou à l'extraction de tissus. Il est possible de suivre l’évolution d’un phénomène biologique ou pathologique dans le temps sans avoir à euthanasier des animaux pour obtenir des échantillons à différents stades de l'étude. Toutes les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations avec un minimum de stress et de contraintes. Lors de la phase de chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, de l’ocrygel sera appliqué sur les yeux et les paramètres physiologiques des animaux seront régulièrement suivi. Lors de la période post-opératoire, une surveillance accrue sera mise en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement avec une pesée une fois par semaine dont la fréquence pourra être adaptée. La récupération post-opératoire pourra être améliorée par mise à disposition d’aliment gelifié. Des points limites adaptés au projet et suffisament prédicitif ont étés mis en place.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal repose sur le lapin, dont le métabolisme osseux est proche de celui de l’humain. Cela garantit une évaluation fiable de la biocompatibilité et de la résorption des implants dans un contexte physiologique pertinent. Il fait partie des modèles animaux préconisés par la norme ISO 10993. Nous choisissons des lapins matures pour l’implantation de dispositifs médicaux et le suivi de l’évolution dans l’os car, à cet âge, la matrice osseuse est complètement développée et stabilisée.

Six journées de neuf heures, onze prélèvements sanguins sur chacun des deux cathéters à chaque journée, 165 ml de sang par journée : 20 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit d'abord trois heures de chirurgie pour la pose de cathéters permanents et d'une canule reliée à son intestin, puis quinze jours de récupération avant le premier jour de prélèvements, en cage individuelle pendant toute l'expérience. L'objet est de mettre au point un mélange de protéines de maïs et de légumineuses enrichi en leucine, destiné à des produits alimentaires pour personnes âgées, la zéine étant aujourd'hui vendue pour des aliments sans gluten. Le porteur retient le mini-porc pour son appareil digestif proche de celui de l'être humain et parce qu'il accepte de manger tous types d'aliments.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer, à partir de la zéine, un mélange de protéines végétales équilibré et optimisé en leucine qui permettra de prévenir et/ou lutter contre la sarcopénie sans recours à un régime hyperprotéique, dans un contexte de durabilité de l’alimentation.

Bénéfices attendus

La zéine est une protéine peu étudiée en France et son potentiel en alimentation de l'Homme n’est que peu envisagé dans les formulations protéiques. La végétalisation de l’alimentation est une préoccupation sociétale majeure ; les industriels veulent y répondre en optimisant les valeurs nutritionnelles et santé des ingrédients et produits qu’ils proposent. Les protéines de maïs en ingrédient sont aujourd’hui proposées pour élaborer des « gluten-free foods », sans préoccupation pour leur apport en leucine ou de leur digestibilité. Le projet posera les bases cognitives et expérimentales pour une utilisation de la zéine en tant que source de leucine dans des produits alimentaires à destination de populations cibles, notamment les personnes âgées. Le projet devrait lever les verrous principaux à son utilisation en définissant un mélange zéine-légumineuse équilibré en acides aminés, digestible et sans impact négatif sur le comportement alimentaire.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents et de canule iléale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 6 cinétiques post-prandiales d’une durée de 9 h suivie d’une période de récupération de 5 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment un des régimes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique de 11 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal, étalés sur une journée de 9 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 5 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter à chaque point de cinétique. Le volume total prélevé sera de 165 ml par cinétique (moins de 10% du volume sanguin de l'animal).

Impact sur les animaux

La piqûre d'aiguille pour l'injection de la pré-anesthésie avant intervention chirurgicale entraîne une douleur légère de courte durée. La procédure chirurgicale entraîne une douleur abdominale modérée prise en charge par antalgiques, de courte durée. L'hébergement en cages individuelles entraîne un isolement de l'animal et une limitation de ses comportements sociaux.

Devenir

En fin d'expérimentation les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer le matériel implanté et d'effectuer des prélèvements d'organes pour l'évaluation de l'effet des régimes sur la physiologie des animaux via des analyses biologiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement à de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). L'équipe de recherche impliquée dans le projet a une longue expérience sur l'utilisation d'animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans le projet, et de prévenir les processus douloureux. L’analyse statistique des données cinétiques (concentrations artérielles en acides aminés, flux de matière sèche et d’azote dans l’intestin chez le porc) sera réalisée. Un nombre minimal de 8 animaux a été déterminé par une approche statistique, ce nombre est nécessaire pour obtenir une différence significative entre les régimes sur le critère principal (biodisponibilité des acides aminés issus de la digestion des protéines). Chaque animal testera successivement les 6 conditions de régimes. 2 mini-porcs suplémentaires sont prévus pour faire face aux aléas (problème lors de l'opération chirurgicale, perte précoce de la perméabilité des cathéters, cochons qui refuseraient un ou plusieurs régimes).

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical lequel se déroule sous anesthésie générale avec monitoring des constantes vitales. Les animaux auront reçu en pré-opératoire un traitement antalgique. En post-opératoire, les animaux recevront pendant 6 jours un traitement anti-inflammatoire, anti-biotique, analgésique et spamolytique. Ce traitement a été validé par notre vétérinaire référent. Après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Des points limites ont été définis pour le projet, spécifiques de la période de récupération post-opératoire ou de la période d'expérimentation. En cas d'observation d'un point limite une discussion, entre les personnes en charge du soin aux animaux et les responsables du projet, sera mise en place pour décider du devenir de l'animal (soin et/ou sortie d'expérimentation ou euthanasie). Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages, individuelles de taille réglementaire, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide de jouets en caoutchoux adaptés aux porcs. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ce modèle animal est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour des études sur la digestibilité d'aliments avec une transférabilité facilitée à des études de la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.

Tués à l'issue parce que les données d'élimination des composés n'arrivent que bien après la fin des expériences, 11 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des candidats médicaments par gavage, par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale, jusqu'à trois fois par jour pendant dix semaines, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et des séjours de 48 heures en cage métabolique sans enrichissement. Le projet prévoit de tester 150 entités pour le compte du développement préclinique, en amont d'une première administration à l'être humain ou d'un médicament vétérinaire. Le porteur reconnaît que des tests in silico et in vitro prédisent déjà l'absorption et le métabolisme, avant de conclure que "seul un modèle animal" caractérise l'ensemble des paramètres.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme ou l‘animal. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme mais aussi dans le développement de médicaments vétérinaires, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement. Il est envisagé de tester 1500 candidats-médicaments sur la durée du Projet.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme ou à l’animal dans le cadre de médicaments vétérinaires.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie, sur une durée maximale de 10 semaines o Par voie intraveineuse à la veine caudale sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour, sur une durée maximale de 10 semaines • Prélèvements de sang : o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque transcutanée en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, tunnel et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 72h. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.

Impact sur les animaux

Au cours des études, les animaux peuvent être soumis à un certain stress (manipulation non invasive de l'animal, administration orale, hébergement en cage individuelle ou en cage métabolique) ou à une douleur passagère liée au geste lui-même (injection de l'administration de type intraveineux, intramusculaire ou sous cutanée ou réalisation du prélèvements). Ces nuisances sont de niveau de gravité léger, à modéré par leur cumul. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.

Remplacement

De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme ou l’animal.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. Ce nombre est augmenté à 5 dans le cas d’administration topique qui présente plus de variabilité.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui assurent leur bien-être. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Quand un hébergement individuel est nécessaire pour les besoins des études,, ils seront hébergés dans des cages conformes à la réglementation, équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Une période d’habituation sera mise en place avant l'hébergement d'individuel pour permettre à l’animal de s’habituer à cet hébergement tout en maintenant les contacts visuels et olfactifs entre les animaux. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné, ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur, expérimenté pour les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques utilisées.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental - scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique à un modèle ou une cible thérapeutique.

Anesthésiés puis incisés trois fois dans le dos, 8 rats mâles reçoivent deux membranes de biomatériau de cinq millimètres de côté, la troisième incision étant refermée sans implant pour servir de témoin. Ils passent les vingt-quatre heures suivantes isolés, puis un mois sous observation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur juge le risque de réaction inflammatoire douloureuse "très limité" du fait des essais in vitro préalables, alors que l'étude a précisément pour objet de mesurer l'inflammation produite par ces implants. Il conclut que les étapes de validation chez l'animal ne peuvent pas être "totalement remplacées" avant le passage à l'humain, et tous les rats sont tués au bout du mois pour prélever les implants et les tissus alentour.

Objectifs

A la suite de traumatismes ou d’opérations au niveau du cerveau, la dure-mère (partie localisée entre le crâne et le cerveau) peut être endommagée. Lorsque cela arrive, des substituts artificiels de remplacement, créés en laboratoire, peuvent être implantés pour remplacer les zones où la dure-mère est lésée. Ces derniers sont cependant responsables de nombreux effets secondaires (infection, douleurs, fuite de liquide en provenance du cerveau …), qui affectent la récupération des patients. Notre équipe travaille donc au développement de nouveaux substituts, dont la composition est très proche de celle de la dure-mère naturelle, dans le but de limiter ces effets indésirables. Les études menées en laboratoire à partir de cultures cellulaires montrent que deux des substituts que nous avons créés pourraient être compatibles avec un usage chez le patient. Le travail que nous proposons aujourd’hui vise à faire une première évaluation de la compatibilité de ces matériaux dans un organisme entier. Pour cela, les deux substituts seront implantés sous la peau de 8 rats et nous analyserons l’inflammation et le devenir de ces substituts 1 mois après leur implantation. Si les résultats sont concluants, de nouvelles études plus sensibles seront envisagées, avec implantation des substituts au niveau crânien, après un retrait de la dure-mère.

Bénéfices attendus

Ces implantations permettront de confirmer une réponse biologique positive après implantations peu invasives (sous la peau) des substituts candidats et d’envisager ainsi la suite des étapes pré-cliniques avec un risque de complication réduit au minimum, ou bien de mettre à jour des effets indésirables non anticipés suite aux campagnes d’évaluation et de caractérisation in vitro, permettant alors une amélioration des substituts ou l’arrêt du projet sans recourir à plus d'animaux. A long terme, ce projet doit permettre d’améliorer le parcours de santé des patients ayant subi un intervention sur la dure-mère (baisse du risque de complication, donc baisse des coûts et hausse du bien-être des patients).

Procédures

Suite à une période d’acclimatation, chaque individu recevra sous analgésie et anesthésie générale les deux biomatériaux candidats en implantation sous-cutanée sur le dos. Les biomatériaux se présentent sous la forme de membranes carrés de 5 mm de côté et de moins d’1 mm d’épaisseur. Une troisième incision sera réalisée puis suturée sans insertion de biomatériau comme auto-contrôle. Les animaux seront maintenus en observation quotidienne pendant 1 mois puis euthanasiés après analgésie et anesthésie pour réaliser l’analyse des tissus et le devenir des biomatériaux.

Impact sur les animaux

La réalisation de l’incision suivie d’une suture entraine un faible risque d’infection indépendant du biomatériau implanté. L’anesthésie et la manipulation liées à la chirurgie peuvent entrainer du stress, tout comme l’isolement temporaire post-chirurgie (24 heures). La chirurgie elle-même entraine une douleur locale à chaque site d’implantation, qui sera prise en charge pendant et après la procédure par des analgésiques cutanés. La littérature indique pour les sutures cutanées une disparition de la douleur dans les 24h. L’implantation du biomatériau peut engendrer une réaction inflammatoire à l’origine de douleurs locales, mais ce risque est jugé très limité du fait de la caractérisation in vitro de la cytocompatibilité effectuée en amont et de la littérature sur les matériaux utilisés.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort à la fin de la procédure pour prélever les implants et les tissus environnants, les analyser et pouvoir ainsi remplir les objectifs scientifiques de l'étude.

Remplacement

Nous cherchons à développer des biomatériaux pour soigner la dure-mère chez l'homme, des étapes de validation chez l’animal ne peuvent pas être totalement remplacées pour évaluer précisément leur comportement après implantation et leurs conséquences sur l'organisme entier, avant de passer aux études cliniques. Une importante phase d’évaluation in vitro a cependant précédé l’étude présentée ici afin de réduire à 2 les biomatériaux candidats à tester chez le rat et anticiper des résultats positifs avec confiance.

Réduction

Seuls deux substituts candidats seront évalués. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, les deux biomatériaux seront implantés sur le même animal, séparés de quelques centimètres. Une incision supplémentaire sans implantation de biomatériaux (incision contrôle) sera réalisée afin que chaque animal soit son propre contrôle. Cette approche permettra de limiter à 8 le nombre d’animaux nécessaires à cette étude. Seul des mâles seront utilisés, des différences selon le sexe n’étant pas attendues pour les phénomènes étudiés (évolution des biomatériaux et inflammation).

Raffinement

La composition et la compatibilité des substituts candidats ont été vérifiés in vitro avant implantation chez l’animal afin de limiter le risque d’effets indésirables. De plus, une amélioration des conditions d'hébergement sera mise en place par des jouets présents dans les cages et des interactions avec les soigneurs encouragées lors des inspections quotidiennes. Analgésie et anesthésie seront utilisées pendant et après la procédure, et des points limites adaptés ont été établis. Pour minimiser les biais liés au rythme jour/nuit et éviter les erreurs engendrées par de nombreuses répétitions du même geste à la chaine, les animaux seront implantés 2 par 2 chaque matin, le groupe total de 8 étant ainsi étalé sur 4 jours.

Choix des espèces

Le rat constitue une espèce peu sensible et bien référencée pour ce type d’étude, facile à manipuler (réduisant ainsi le stress) et d’une taille suffisante pour permettre l’implantation de deux matériaux ainsi qu’une incision contrôle sur chaque individu. Les animaux seront adultes (10 semaines) : les éléments évalués au cours de l’étude n’impliquent aucune notion de développement qui amènerait à utiliser des rats immatures ou âgés, le substitut développé est à visée d’utilisation chez l’humain adulte, et la taille des rats adultes permettra l’implantation de plusieurs substituts candidats sur le même individu.