Autres troubles humains

63 souris seront immobilisées trois heures par jour pendant vingt et un jours, et 192 rats subiront huit prélèvements de sang en six heures : 322 souris et 192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent aussi des gavages pendant deux à trois semaines et des injections dans l'abdomen sur deux à huit semaines, dont des injections de LPS qui provoquent fièvre, fatigue, repli sur soi et perte de poids. Le porteur décrit ces réactions comme "temporaires, adaptatives et contrôlées", et qualifie le stress de contention de psychologique. Le projet mesure ce que des phytonutriments du régime méditerranéen apportent au "bien vieillir", avec des retombées annoncées sous forme de recommandations nutritionnelles et de produits naturels.

Objectifs

Avec l'allongement de l'espérance de vie, le vieillissement démographique représente un défi majeur pour la société, étant associé à une augmentation des maladies chroniques et des coûts de santé. Pour faire face à ces enjeux, il est impératif d'identifier des moyens de prévention pour favoriser le "bien vieillir" et réduire l'incidence des maladies liées à l'âge telles que les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires. Parmi les facteurs de risque, une alimentation inadéquate a été identifiée comme contribuant à ces maladies. L'alimentation étant un comportement modifiable, elle offre une voie prometteuse pour mettre en place des stratégies préventives basées sur la nutrition. Dans ce contexte, le régime méditerranéen (Medi) se distingue comme l'un des régimes les plus sains, grâce à ses bénéfices sur la santé et la longévité. Ce projet vise donc à explorer le rôle protecteur des phytonutriments du Medi dans la prévention du vieillissement et des maladies chroniques associées. Notre objectif principal est de comprendre les mécanismes d'action des phytonutriments du Medi et d'évaluer leur efficacité potentielle dans la promotion du "bien vieillir", en utilisant des modèles animaux pertinents pour simuler les processus inflammatoires, les effets du vieillissement accéléré, et le stress chronique. Nous cherchons également à développer des méthodes d'analyse fiables permettant de mesurer les phytonutriments et leurs métabolites dans les tissus biologiques des animaux, afin d'évaluer leur biodisponibilité et dans le but d’établir des corrélations entre les niveaux de métabolites des phytonutriments et les effets biologiques associés au vieillissement, tels que l'inflammation, le stress oxydant, et les altérations épigénétiques. Cette étape cruciale nous permettra d'évaluer comment ces composés sont absorbés et métabolisés dans l'organisme, ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhension de leur efficacité potentielle. En utilisant des modèles animaux pertinents, nous évaluerons ensuite les effets protecteurs des supplémentations en phytonutriments du Medi contre l'inflammation, les altérations cognitives liées au vieillissement accéléré, et les effets délétères du stress chronique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à approfondir la connaissance scientifique en nutrition et vieillissement, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour améliorer la santé humaine. En caractérisant les effets des phytonutriments du régime Medi sur le vieillissement et les maladies chroniques à l'aide de modèles animaux spécifiques, cette recherche contribuera à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux bénéfices de ces composés sur la santé. Les résultats permettront d'identifier les phytonutriments clés et leurs combinaisons ayant un potentiel effet protecteur contre le vieillissement et les maladies associées, notamment en modulant l'inflammation, le stress oxydatif et d'autres processus biologiques liés au déclin cognitif et aux pathologies liées à l'âge. Cette caractérisation approfondie des mécanismes d'action des phytonutriments éclairera sur les stratégies nutritionnelles pour favoriser un vieillissement en bonne santé, ouvrant des perspectives pour le développement de produits naturels visant à promouvoir le "bien vieillir" et à réduire l'incidence des maladies chroniques liées à l’âge. En approfondissant notre compréhension des interactions entre les phytonutriments et processus biologiques, cette recherche pourrait conduire à des interventions précoces ou à des recommandations nutritionnelles personnalisées pour améliorer la santé des individus vieillissants. Les bénéfices dépassent la recherche fondamentale, avec des implications potentielles dans la santé publique. Les connaissances générées pourraient conduire à des recommandations nutritionnelles spécifiques pour promouvoir le "bien vieillir", contribuant ainsi à réduire l'incidence des maladies chroniques associées à l'âge et à améliorer la qualité de vie des individus vieillissants. Avec l'allongement de l'espérance de vie, les systèmes de santé et les économies nationales sont confrontés à des défis importants, notamment des problèmes de santé chroniques entraînant des surcoûts en matière de soins, incapacité et dépendance. En identifiant les phytonutriments favorisant un vieillissement en bonne santé, cette recherche pourrait atténuer les impacts économiques du vieillissement de la population. Ce projet revêt ainsi une importance économique dans le contexte du vieillissement démographique. Ce projet vise donc à combler les lacunes actuelles dans notre compréhension des liens entre nutrition, vieillissement et santé, avec des implications potentielles significatives pour la santé publique.

Procédures

Les 322 souris seront soumises à deux prélèvements sanguins à la veine sous maxillaire (maximum 200µL et minimum deux semaines d'intervalle entre les prélèvements). Elles seront également sourmises à une administration orale par gavage pendant 2 à 3 semaines (232 souris), et à des injections intrapéritonéales allant de 2 à 8 semaines (250 souris). 63 souris seront également soumises à un stress de contention quotidien de 3h/jour pendant 21 jours. Les 192 rats quant à eux seront soumis à une cinétique de prélèvements sanguins effectués à la veine caudale ou saphène, et consistant en un prélèvement de 200µL maximum espacés de 30mn minimum ; 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, et 360mn.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les interventions prévues peuvent entraîner diverses réponses physiologiques et comportementales chez les animaux utilisés. Par exemple, l'administration de substances, bien que rapides et non douloureuses lorsqu’effectuées par une personne expérimentée, peut induire un stress temporaire lié à la manipulation directe des animaux. Pour atténuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à ces procédures. Les injections intrapéritonéales de LPS induiront des réactions physiologiques telles qu'une réaction inflammatoire, de la fièvre, de la fatigue et des comportements anormaux tels que le repli sur soi, l'hypophagie et la perte de poids chez les souris. Ces réactions, appelées comportement de maladie, sont temporaires, adaptatives et contrôlées, favorisant la récupération en mobilisant les ressources de l'organisme pour combattre l'agent pathogène. Les prélèvements sanguins répétés chez les rats peuvent causer une légère gêne et une perte de volume sanguin, tandis que les injections répétées chez les souris peuvent entraîner une réaction locale temporaire. Pour minimiser ces effets, nous alternerons le côté d'injection et limiterons le volume prélevé selon les recommandations spécifiques à chaque espèce. Les interventions expérimentales peuvent induire un stress léger entraînant une restriction alimentaire et une légère perte de poids chez les animaux. Tout changement de poids sera surveillé de près et un animal présentant une perte de poids significative sera retiré des expériences pour assurer son bien-être. Concernant le stress de contention chronique, bien que non invasif sur le plan physique, ce modèle entraine un stress psychologique et un inconfort dû à la restriction de mouvement, sans toutefois altérer la mobilité une fois le stress terminé. Ces interventions respecteront les lignes directrices éthiques et les expérimentateurs s'engageront à minimiser les perturbations et les impacts négatifs sur le bien-être des animaux en utilisant des techniques adaptées et en surveillant étroitement leur santé et leur comportement tout au long de l'étude et en prenant en charge la douleur si nécessaire. Des mesures telles que l'enrichissement de leur environnement seront mises en place pour garantir leur bien-être et leur confort. En cas de symptômes persistants ou sévères, les animaux seront euthanasiés selon des critères éthiques stricts pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le but de mener des investifations aux niveaux biologiques et neurobiologiques.

Remplacement

Il existe actuellement peu d'alternatives non animales capables de reproduire adéquatement les interactions complexes entre nutriments et processus biologiques observés chez les animaux vivants. Les modèles animaux restent essentiels pour étudier les effets physiologiques et comportementaux des nutriments dans un contexte biologique pertinent, comme dans notre projet visant à caractériser les effets des phytonutriments sur le vieillissement et les maladies chroniques. L'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre les réponses systémiques et les impacts à long terme sur la santé. Les modèles animaux permettent d'observer les effets intégrés des composés nutritifs sur différents organes et systèmes biologiques, ce qui est essentiel pour une compréhension holistique des mécanismes sous-jacents. Cependant, lorsque l’objectif le permettra, des études seront faites en culture cellulaire afin d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires, ces modèles in vitro offrant des informations utiles sur les réponses cellulaires aux composés nutritifs, mais ne pouvant pas reproduire les interactions complexes et intégrées observées dans un organisme vivant. Par exemple, les cultures de cellules Caco-2 peuvent être utilisées pour étudier l'absorption intestinale des phytonutriments in vitro, évaluant ainsi leur biodisponibilité et leur potentiel effet systémique. Ainsi, ce type d’étude in vitro peut être utilisé pour mener un screening initial des phytonutriments d’intérêts pour notre projet. De même, des cultures cellulaires spécifiques pourront être employées pour évaluer les effets des composés sur divers aspects de la santé cellulaire, comme la modulation de l'inflammation ou du stress oxydatif. Ces études peuvent fournir des informations précieuses sur les mécanismes d'action potentiels des phytonutriments sans nécessiter l'utilisation d'animaux. Cependant, malgré ces avantages, les modèles cellulaires présentent certaines limites. Ils ne peuvent pas reproduire de manière exhaustive les interactions complexes entre différents organes et systèmes biologiques observées dans un organisme vivant entier. Par conséquent, les études sur les modèles animaux restent nécessaires et justifiées pour atteindre nos objectifs scientifiques en l'absence d'alternatives satisfaisantes. Nous nous engageons cependant à minimiser le nombre d'animaux utilisés, à réduire au maximum leur souffrance et à suivre des protocoles rigoureux conformément aux normes éthiques en vigueur.

Réduction

Plusieurs mesures ont été mises en œuvre dans ce projet afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés tout en atteignant nos objectifs scientifiques. Tout d'abord, le nombre d'animaux prévus pour ce projet a été déterminé en tenant compte des besoins expérimentaux et des objectifs de recherche afin de garantir la robustesse de nos résultats, tout en minimisant autant que possible la taille de nos effectifs. En effet, il existe une grande variabilité interindividuelle et nos précédentes études ont montré que la métabolisation des nutriments chez les animaux est sensible à cette variabilité, ce qui nous impose d’avoir un nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à notre problématique, tout en nous restreignant à des effectifs les plus faibles possibles. Le calcul du nombre d’animaux a donc été fait sur la base de 8 à 10 animaux par groupe en fonction du modèle, nombre minimal requis afin d’atteindre une puissance statistique suffisante. De plus, nous adoptons une approche de partage et de réutilisation des tissus animaux pour maximiser leur utilisation. Les foies des rats seront utilisés pour établir des microsomes afin de développer des modèles cellulaires, notamment dans le cadre du protocole INFOGEST. Les tissus non utilisés des souris seront également employés pour le développement de méthodes analytiques sur tissus, minimisant ainsi le besoin de nouveaux prélèvements. Pour optimiser l'utilisation des animaux, nous avons choisi d'utiliser le rat dans la phase d'études de biodisponibilité. Cette décision est motivée par la plus grande taille des rats, qui offre une plus grande disponibilité d'échantillons et permet de nous restreindre à des effectifs les plus faibles possibles comparés à ceux qui auraient été nécessaires avec de plus petits animaux comme la souris. En outre, nous avons adopté une approche expérimentale ciblée pour étudier l'effet des phytonutriments. Dans le modèle de stress inflammatoire induit par le LPS, nous évaluerons l'effet des phytonutriments dans des conditions basales et stimulées. En revanche, dans d'autres modèles, nous nous concentrerons uniquement sur l'effet des phytonutriments en conditions stimulées, ce qui permet de minimiser le nombre de groupes expérimentaux tout en respectant nos objectifs scientifiques. Ces différentes pratiques nous permettent donc de maximiser l'utilisation des ressources disponibles tout en respectant les normes éthiques et les objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, nous mettrons en œuvre des mesures rigoureuses afin à minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux pendant les procédures expérimentales. Tout d'abord, une surveillance quotidienne des animaux sera assurée tout au long de l'étude pour évaluer leur santé et leur comportement, avec un renforcement accru en cas de symptômes de détresse ou de douleur, et des mesures immédiates seront prises pour administrer un traitement de confort afin de soulager la souffrance des animaux le cas échéant. Nous avons défini avec attention des points limites pour chaque procédure expérimentale, permettant d'identifier rapidement les signes de détresse et de prendre des mesures appropriées, y compris l'euthanasie si nécessaire pour éviter toute souffrance inutile. Nous prendrons aussi en compte le bien-être des animaux via l'enrichissement environnemental dans les cages avec l'ajout de carrés de coton, d'igloos en carton et de bâtons de bois. Ces enrichissements offrent aux animaux des possibilités d'exploration et de comportement naturel, réduisant ainsi le stress lié à la captivité. De plus, nous favorisons la stabulation en cages collectives ce qui permet aux animaux de bénéficier de contacts sociaux et de réduire l'isolement. Cette approche contribuera à maintenir le bien-être psychologique des animaux tout au long de l'étude. Nous avons intégré dans nos protocoles des procédures d'entraînement et d'habituation préalable pour familiariser les animaux aux manipulations expérimentales, réduisant ainsi le stress associé aux procédures telles que l'administration orale ou les prélèvements sanguins. Enfin, nous resterons attentifs aux avancées scientifiques et aux nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet, ce qui nous permettra d’intégrer ces avancées dès qu'elles sont disponibles pour améliorer le bien-être des animaux et optimiser nos pratiques expérimentales.

Choix des espèces

Le rat sera utilisé pour les études de biodisponibilité et le développement des méthodes d’analyses en raison de sa taille anatomique, facilitant les prélèvements sanguins et d'organes en quantité suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilisés et en conservant une facilité d’hébergement et de manipulation. Le rat est également préféré à la souris pour la réalisation de cinétiques de prélèvements en raison de son plus gros volume sanguin. La souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement optimal conforme aux règles éthiques, sera choisie pour l’étude des phytonutriments sur le vieillissement. En effet, les souris sont adaptées aux manipulations nutritionnelles et aux expériences comportementales et les modèles sélectionnés sont largement validés et utilisés dans la communauté scientifique sur cette espèce. Enfin, l’utilisation de souris représente un avantage économique, coutant moins cher que les autres rongeurs en terme d’hebergement et de régimes alimentaires. S’agissant d’étude sur le vieillissement, les animaux seront utilisés à l’âge adulte.

Une pompe osmotique est implantée sous la peau ou dans une veine, en dix à vingt minutes d'opération : 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infusion continue se poursuit ensuite sur animal éveillé, avec des prélèvements de sang répétés, puis une injection létale permet de prélever organes et tissus. Le projet est mené par une société privée qui teste ses propres vecteurs d'acheminement de médicaments vers le cerveau, à raison de six études par an et de groupes de quatre animaux. Le porteur retient la souris parce que sa physiologie est bien connue, et parce qu'à 27 ou 30 grammes elle est "particulièrement économique" en termes de posologies.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations, Il s’agira de contourner les problématiques de la pharmacologie (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de notre système de pompe autonome (délivrances prolongées et maîtrisées). Nous pourrons ainsi proposer de meilleures pharmacologies et optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher leurs meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces.

Procédures

Une première partie de mise en place de l’étude sur animaux éveillés, une seconde sous anesthésie et anti-douleurs (chirurgie) et enfin le suivi et manipulation jusqu’à la mise à mort de l’animal en fin de cinétique. -Constitution des groupes d'animaux (éveillés). -Analgésie (éveillé) : Administration simple et unique (5 secondes) sous la peau au niveau de la nuque. - Procédure chirurgicale et implantation des pompes osmotiques : implantation en sous-cutanée (10 min) ou intraveineux (20 min). -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animal éveillé en cours de cinétique. -Mise à mort finale pour prélèvements de tissus et organes.

Impact sur les animaux

Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées : - Du stress et des douleurs légères de courte durée causées par les injections et les prélèvements sur animaux vigiles. - Du stress et de l’inconfort lors des anesthésies et de possible douleurs suites aux interventions chirurgicales Le composé injecté ne devrait pas avoir d'effets indésirables sur les animaux

Devenir

Afin de réaliser l'étude de l'efficacité pharmacologique, les organes et tissus d'intérêts doivent être prélevés. Pour cela, les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement étudiés in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des suivis pharmacologiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de contrôler le maintien de leurs efficacités directement sur leurs cibles (Récepteurs cellulaires), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pharmacologique pour l’infusion médicamenteuse, nous devrons réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de petits groupes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti de manière équivalente pour les deux procédures d’implantations, en sous-cutanée puis en intra-veineux. Les animaux seront répartis en petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 4 groupes tests par étude et 6 études par an, ce qui représente 96 individus/an et par procédure. C’est-à-dire pour les deux procédures, 192 animaux par an (mixité des groupes 96 mâles + 96 femelles). Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles. En expérimentation animale nous travaillons avec des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles que nous prendrons en considération lors des tests statistiques. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données précieuses sur le sang.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. Les opérations chirurgicales et implantations se feront sur animaux anesthésiés + anti-douleur, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se fera sur animal éveillé. Le contrôle des pesées et les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. .

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille (d'animaux) de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, et qui s’avère particulièrement économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risques immunogènes).

9 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir un cathéter jugulaire ou fémoral sous anesthésie, subir jusqu'à huit prélèvements sanguins en 24 heures, des gavages ou injections jusqu'à trois fois par jour, un hébergement individuel jusqu'à dix jours et jusqu'à 48 heures en cage à métabolisme sans enrichissement. La finalité est de mesurer la pharmacocinétique de candidats médicaments, l'effectif étant estimé d'après l'expérience du laboratoire et "le nombre de demandes de nos partenaires". Le porteur reconnaît que les tests in silico et in vitro suffisent à présélectionner les composés, puis conclut que seul un modèle animal permet de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o Par voie intraveineuse à la veine caudale ou via le cathéter sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Procédure chirurgicale de pose de cathéter jugulaire et/ou fémoral : o 1 anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum par animal sur la durée de la chirurgie. o Administration par voie sous-cutanée d’analgésique. Durée 30 secondes sur animaux vigiles ou anesthésié. Unique ou répétée max 2 fois. o Administration unique par voie sous-cutanée de NaCl pour l’hydratation des animaux. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière et matériaux de nidification) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 10 jours. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.

Impact sur les animaux

Au cours des études, - la chirurgie de pose de cathéter sous anesthésie/analgésie peut entrainer une nuisance, douleur et durée modérée - Les administrations et prélèvements sanguins vigiles peuvent entrainer une douleur légère de courte durée par acte, mais la nuisance peut être légère à modérée par la répétition des actes sur une étude, - L’hébergement individuel post-opératoire peut entrainer une nuisance légère de durée modérée ; - Sur certaines études, l’hébergement en cage à métabolisme peut entrainer une nuisance légère à modérée selon la durée. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les cathéters implantés ne sont pas perméables au-delà de 10 jours pour une implantation à la veine jugulaire et 14 jours pour la veine fémorale. De plus, les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.

Remplacement

De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Ces tests préliminaires ex vivo évitent le recours à l’animal. Pour la suite du développement des nouvelles entités thérapeutiques, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. L’estimation du nombre de rats utilisés est basée sur l’expérience acquise sur ce modèle et sur le nombre de demandes de nos partenaires. 9000 rats seront prévus sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - Techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental; - Scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.

Le dossier réglementaire exigé avant une première administration chez l'être humain repose sur 182 macaques à longue queue, tous tués pour évaluer la toxicité et la biodistribution du produit, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures, jusqu'à quatre heures pour un traitement bilatéral, et parfois deux chirurgies espacées d'un mois. Les prises de sang se font sur animal éveillé sous contention manuelle, le liquide cérébrospinal est ponctionné sous anesthésie, et le recueil des urines et des fèces impose un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce comme effets indésirables possibles une perte d'équilibre, un défaut de clignement des paupières et une paralysie faciale transitoire, et présente la réalisation de ce projet chez le primate comme "indispensable".

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le primate afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier les surdités génétiques/héréditaires tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un implant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 et 2 heures (traitement unilatéral) et jusqu’à 4 heures (traitement bilatéral). Chaque animal est soumis à une chirurgie généralement. Potentiellement, un animal peut être soumis à deux chirurgies espacées d’au moins 1 mois pour réaliser des injections bilatérales non simultanées. Examens cliniques : les animaux sont suivis quotidiennement mais des examens spécifiques peuvent être conduits pour suivre les paramètres cardiovasculaires, la pression artérielle par exemple. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces examens sont réalisés entre 2 et 4 fois selon la durée de l’étude. Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes). Liquide de l’oreille, liquide cérébrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie sous anesthésie générale et à la nécropsie après euthanasie). Larmes, salive, température corporelle : ces prélèvements non invasifs sont réalisés chez les animaux avec une contrainte manuelle légère pour que l’animal ne bouge pas le temps du prélèvement (durée : quelques secondes et moins d’1 minute). Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces prélèvements sont généralement réalisés une fois dans les semaines précédant le traitement, deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines après traitement, puis en milieu et en fin d’étude. Les urines et les fèces sont collectés quand l’animal est hébergé dans une cage dédiée pour le recueil de ces fluides. L’hébergement individuel ne peut dépasser 24 heures. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Chaque animal est soumis à 4 collectes généralement, réalisées une fois dans les semaines précédant le traitement, une fois dans les 2 premières semaines après traitement en milieu d’étude et en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère, ponctuelle et transitoire de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre, un défaut de clignement des paupières et/ou une paralysie faciale transitoire(s). Des effets indésirables liés aux prélèvements et/ou aux examens cliniques sont liés à la contention légère des animaux qui peut induire un léger inconfort ou stress aux animaux, qui restent transitoire. Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le primate afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le minimum requis pour permettre une analyse statistique, conformément aux recommandations des lignes directrices. L’estimation du nombre d’animaux a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et d’une éventuelle variation de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire, de réveil et les jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement notamment l’activité et la mobilité des animaux, les interactions sociales, l’apparence physique, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. Toute anomalie est signalée au vétérinaire pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se font sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux est surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a des signes d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de Macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

Irradiées, puis greffées sous anesthésie avec des cellules souches sanguines de souris ou humaines, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour que soit quantifiée la proportion de cellules greffées dans leur moelle et leur sang, chacune ayant subi jusqu'à trois prises de sang au cours de sa vie. Le projet vise à améliorer des protocoles de thérapie génique destinés à la drépanocytose et à la bêta-thalassémie, en testant des gènes thérapeutiques, de sélection, "suicides" ou activateurs de prolifération. Le porteur écrit que l'irradiation non létale n'est pas censée provoquer de douleur, et décrit par ailleurs une irradiation létale des souris immunocompétentes dont seule la greffe assure la survie.

Objectifs

Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs thérapeutiques permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines pour optimiser les conditions de culture, de modification et de sélection des cellules « corrigées » qui seront injectées, afin d’améliorer les protocoles de thérapie génique chez l’humain dans le cadre de maladies génétiques. L’objectif de ce projet consiste à étudier l’effet de gènes thérapeutiques, de gènes de sélection, de gènes « suicides » ou de gènes activateurs de la prolifération cellulaire ayant un effet sur le processus physiopathologique des maladies de l’hémoglobine telles que la béta-thalassémie et la drépanocytose. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles murins de deux maladies (la drépanocytose et la béta-thalassémie), ainsi que dans un modèle murin immunodéficient (n’ayant pas de système immunitaire) qui permet la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’amélioration des protocoles de correction (des cellule souches sanguines défectueuses) et de transplantation des cellules souches sanguines corrigées pour des thérapies géniques qui pourront être appliqués à l’humain dans le cadre de maladies de l’hémoglobine ou de greffes de cellules souches sanguines.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques/sanguines (soit 3 min environ pour les souris immunodéficientes et 2 fois 5 min environ pour les souris immunocompétentes). Les animaux seront également transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques/sanguines murines ou humaines. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin une fois par mois et trois fois maximun durant la vie de l’animal. Ce geste ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’irradiation non létale de ces souris n’est pas censée provoquer de douleur ou d’altération majeure de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rares cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limitée au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique. L’irradiation létale des souris immunocompétentes nécessite une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour assurer leur survie. Suite à l’irradiation, une perte de poids peut être observée mais elle est transitoire (une semaine environ). Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier la proportion de cellules souches sanguines murines ou humaines présentes dans la moelle et le sang des souris et de les caractériser.

Remplacement

La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines/hématopoïétiques (CSHs) est un phénomène complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer les processus physiologiques de guidage, d’implantation, de survie et de différenciation de ces cellules. La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs cultivées et modifiées par des vecteurs thérapeutiques à se loger au niveau de la moelle osseuse et reconstituer l’hématopoïèse (processus physiologique de production des cellules sanguines) à long terme. Par ailleurs il n’existe pas de protocole in vitro permettant de différencier les cellules érythroïdes humaines ou murines en globules rouges parfaitement matures. Les souris sont donc utilisées à la fois pour déterminer si des CSHs ont été génétiquement modifiées par les vecteurs de transfert de gènes mais également à terme, par l’étude de l’effet des vecteurs de thérapie génique sur la fonction des globules rouges.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des conditions de culture et/ou protocoles de modification des cellules dans des systèmes de culture in vitro afin de vérifier qu’ils ne génèrent pas de toxicité cellulaire. Le recours à l’animal est ensuite indispensable à l’étude de l’effet des procédures de culture sur la capacité des cellules à reconstituer le système hématopoïétique (de production de toutes les cellules sanguines). Notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines dans le modèle murin ainsi que les résultats de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 animaux pour rendre des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce et qui est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (enrichissement) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, la greffe de cellules souches sanguines sera réalisée sous anesthésie grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Durant les 15 jours suivant la greffe cellulaire les souris seront examinées par le porteur du projet 3 fois par semaine et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des points limites ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Afin d’éviter toute infection, les souris seront traitées par antibiothérapie durant ces 30 jours. Au bout d’un mois, les souris seront observées par le porteur de projet une fois par semaine en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de cellules souches sanguines. Le projet porte sur quatre lignées murines. Deux lignées sont utilisées comme modèles de pathologies humaines du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. Une lignée est utilisée comme lignée receveuse de transplantations effectuées à partir de cellules souches sanguines murines. Une autre lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet l’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie géniques sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie. Dans ce projet les animaux sont utilisés à l’âge de 10-12 semaines, moment où la prise de greffe est optimale.

Un rat qui ne se déplace plus, ou dont la plaie présente rougeurs et pus, est tué. 20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : un trou percé dans le condyle fémoral de la patte arrière, comblé par un matériau à tester, puis quatre passages au scanner sous anesthésie à 3, 15, 30 et 60 jours. Le porteur reconnaît une douleur et une difficulté à se déplacer les premiers jours, un risque de rupture des sutures et des désagréments liés aux anesthésies répétées. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer ces biomatériaux et que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" passer par des animaux non-humains, d'abord petits, puis plus gros.

Objectifs

Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement. Le projet se fait sur deux EU, que le modèle est fait dans l'EU1 et l'imagerie dans l'EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).

Impact sur les animaux

Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.

Devenir

Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement: les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

Une dent arrachée sous anesthésie générale, l'implant dentaire posé dans la foulée, trente minutes à une heure d'intervention, puis des semaines d'observation ponctuées de prises de sang et d'examens du site d'implantation sous anesthésie. 120 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur liste les suites possibles, douleur, perte d'appétit, gêne à la mastication, infections bactériennes et saignements du site opératoire, puis conclut qu'il n'est pas possible de maintenir les animaux en vie, les tissus autour de l'implant devant être prélevés pour histologie. Il rappelle que le rat ne remplit pas tous les critères recommandés pour ce type de test, hygiène orale et maturité squelettique, et que l'essai est commandé par un donneur d'ordre en vue d'une mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé d’implantologie et de chirurgie dentaire (exemple : implant, vis, ciment, ...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en chirurgie dentaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour l’extraction dentaire, puis l’implantation du dispositif à tester dans la foulée . Ces interventions peuvent durer de 30 minutes à 1h environ et ont lieu sous anesthésie générale et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non (

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : -douleur et stress liés à la chirurgie. -perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -gêne à la mastication et la prise alimentaire pouvant entrainer une perte de poids à plus long terme -les infections bactériennes liées à la chirurgie. -les saignements au niveau du site opératoire.

Devenir

Pour répondre aux objectifs du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les tissus et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé dentaire. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou design d’étude le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et Aavant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (produit de nidification : coton), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (analgésie post-opératoire, désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée si nécessaire en cas de signes cliniques…). Les prises de sang peuvent être réalisées si nécessaire sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous anesthésie locale, ou encore sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie préalable, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle.

Choix des espèces

Il n’existe pas de modèle animal validé pour tester les dispositifs médicaux dentaires, mais les textes de référence recommandent l’utilisation d’animaux dont : -les mâchoires sont de taille adéquate pour permettre l’accès chirurgical et l’implantation du dispositif, -il existe la présence de dents opposées, -la maturité squelettique est atteinte, -l’hygiène orale peut être contrôlée, -l’alimentation est omnivore et qui présentent des mouvements de mastication. La littérature scientifique reporte l’utilisation du rat comme un modèle de choix dans l’évaluation préliminaire des dispositifs médicaux à visée dentaire. Cependant cette espèce ne remplit pas tous les critères citées plus haut tel que la maturité squelettique difficilement objectivable (pas de fermeture des plaques de croissance osseuse + non nécessaire selon la littérature) et hygiène orale difficile à contrôler. Néanmoins, l’espèce rat constitue un modèle de choix car certaines similarités physiologiques sont observées entre l’implantation chez l’humain et chez le rat (structure osseuse, mécanismes de cicatrisation…). Ainsi ce modèle permet d’ obtenir des données préliminaires et contribuer au développement d'interventions sûres et efficaces pour l'implantation dentaire chez l'Hommeutiles pour les étapes de développement du produit.