Autres troubles humains

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

Un rein prélevé par chirurgie ouverte, transporté par drone, puis regreffé au même animal avant l'ablation du rein restant: 9 porcs subissent cette séquence au cours d'une procédure unique de sept jours, d'un niveau de souffrance modéré, et sont tués au septième jour pour analyse histologique du greffon. Chaque animal est à la fois son propre donneur et son propre receveur, avec une heure de chirurgie pour le prélèvement, trois heures pour la transplantation, un cathéter central, des prises de sang quotidiennes et un hébergement individuel jusqu'à reprise de la diurèse. Le projet porte sur le mode de transport, le drone étant présenté comme une solution prioritaire pour ramener la durée d'ischémie sous dix heures, avec un intérêt économique et sécuritaire déclaré. Le porteur écrit que trois porcs par groupe ne permettent aucune analyse statistique, tout en jugeant cet effectif suffisant pour fonder la sécurité du dispositif avant son autorisation en clinique humaine.

Objectifs

Le plan ministériel (ministère de la santé) pour le prélèvement et la greffe d’organes et de tissus 2022-2026 en coordination avec l’Agence de BioMédecine a pour objectif de diminuer la durée moyenne de transport des organes. Le but est d’atteindre pour les transplants rénaux une durée d’ischémie au cours du transport < 10 heures. L’utilisation de systèmes d’avions pilotés à distance (drones aériens) fait partie des solutions prioritaires car il permet de diminuer significativement la durée de transport des transplants. Il présente aussi un intérêt sécuritaire en diminuant le nombre d’intervenants et travailleurs nocturnes et également un intérêt économique. Le transport de transplants rénaux par drones représente néanmoins un challenge et fait apparaitre de nouvelles problématiques non explorées (Condition non pressurisée et non thermo-régulée, avec exposition des transplants à des température décroissantes et à des vibrations). L’objectif de ce projet est d’évaluer l’utilisation d’un nouveau mode de transport par drones des transplants rénaux. Notre projet vise à réaliser une première en utilisation d’un drone développé pour le transport d’organe avant autorisation en clinique humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d’apporter des données de sécurité de l’utilisation des drones dans le transport des transplants rénaux. Les évaluations biopsiques visent à évaluer l’absence de lésion histologique. La surveillance clinique vise à assurer la reprise de fonction des transplants après transport. Ces données de sécurité permettront la mise en place des premiers protocoles de transport des transplants rénaux en clinique humaine.

Procédures

Ce projet prévoit l’utilisation de 9 porcs sur une procédure unique expérimentale de 7 jours reproduisant un processus complet de transplantation rénale avec prélèvement, transport du transplant, transplantation et suivi. - Sous anesthésie générale, un prélèvement rénal gauche sera réalisée par chirurgie ouverte. (1 heure) - Après transport des transplants rénaux selon 3 distances de références avec une phase de décollage, de vol et d’atterrissage Sous anesthésie générale, transplantation rénale puis néphrectomie droite seront réalisées par la même cicatrice de chirurgie. (3 heures) . - Un suivi des animaux sera réalisé pendant 7 jours avec une surveillance clinique, de la diurèse et par prises de sang quotidiennes sur cathéter central. - Mise à mort des sujets sous procédure d’anesthésie

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux pourraient inclure : • Anesthésie profonde et prolongée des animaux • Effets secondaires systémiques liés à l'anesthésie générale et ou aux médicaments administrés pendant les procédures chirurgicales et pour la gestion de la douleur post-opératoire. • Douleur en lien avec la chirurgie abdominale. • Risques de complications chirurgicales telles que l'infection des plaies ou les saignements. • Hébergement individuel des animaux pour surveiller la diurèse jusqu’à reprise franche de la diurèse.

Devenir

Au 7ème jour, les porcs seront euthanasiés sous procédure complète d’anesthésie générale, pour prélèvement et analyse histologique du greffon explanté.

Remplacement

L'étude de la fonction d’un organe dans sa complexité, ne peut se concevoir que dans un modèle animal pré-clinique (donneur), il n’existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. Cependant, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, les modèles porcins seront à la fois leur donneur et leur receveur pour diminuer le nombre de sujet nécessaire.

Réduction

Il s’agit d’une première étude de sécurité. L’inclusion de 3 porcs par groupe permet d’avoir des éléments de sécurité nécessaires pour passer aux groupes suivants. Bien que le nombre de 3 animaux par groupe ne permettent pas une analyse statistique des résultats, il est suffisant pour cette première étude de sécurité. En cas de lésions trop importantes des transplants, les porcs suivants ne seront pas inclus. De façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, les modèles porcins seront à la fois leur donneur et leur receveur pour diminuer le nombre de sujet nécessaire.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au raffinement dans l’hébergement individuel et dans la prise en compte des souffrances de l’animal. A leur arrivée les animaux seront hébergés en groupe durant une période d’acclimatation pré-expérimentale de 7 jours minimum. La température de la pièce sera maintenue à la même température que chez l’éleveur et l’alimentation sera poursuivie telle que chez l’éleveur de façon à établir une continuité et diminue le stress thermique et alimentaire. Une alimentation humidifiée sera apportée aux animaux en post-opératoire pour faciliter la prise alimentaire. Un pansement gastrique par Keal 1g per os sera apporté une fois par jour aux porcs pour diminuer le risque d’ulcère gastrique. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Durant les opérations, les porcs seront installés sur des tapis chauffants. Un gilet avec une voie veineuse centrale sera installée sur chacun des animaux pour faciliter l’administration IV des antalgiques, faciliter l’hydratation des sujets et enfin faciliter le prélèvement des biologies sanguines. L’utilisation d’un cathéter central permet d’éviter l’usage itératif d’anesthésies légères nécessaires aux prélèvements veineux périphériques. Enrichissement du milieu : Des Jouets et une diversification seront à disposition pendant toute la phase d’expérimentation, conformément aux moyens disponibles dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront hébergés individuellement pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase du fait de l’utilisation de cages métaboliques associée au suivi de la diurèse et à des gilets de maintien de la voie veineuse centrale. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif. Un enrichissement et contact avec les animaliers sera alors accru pendant cette phase.

Choix des espèces

La race de porc utilisée est Landrace x Piétrain x Large White. Le modèle porcin est le modèle de référence en transplantation rénale car la physiologie rénale est proche de celle humaine. L’anatomie abdominale ainsi que la physiologie du porc de 70 kg sont proches de celles de l’homme adulte et font donc de cette espèce un excellent modèle pré-clinique pour l’analyse des transplants rénaux. Jeunes mâles, 70Kg, similitude anatomique et physiologique avec un homme adulte au niveau abdominal. Modèle de référence pour l’analyse des transplants rénaux.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Opérés du fémur pendant une trentaine de minutes pour qu'un trou soit percé dans le condyle puis comblé par un matériau à tester, 20 rats passent ensuite au scanner sous anesthésie à trois, quinze, trente et soixante jours, dans un établissement différent de celui de la chirurgie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que l'opération provoque de la douleur et des difficultés à se déplacer pendant les premiers jours, avec un risque de rupture des sutures, et que les anesthésies répétées causent des désagréments. Au soixantième jour, tous sont tués pour que l'os régénéré et ses vaisseaux soient prélevés et analysés.

Objectifs

Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).

Impact sur les animaux

Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.

Devenir

Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

Tous tués en fin de protocole pour prélever leur sang, leur liquide alvéolo-pulmonaire et leurs tissus pulmonaires, 1 680 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun inhale, vigile, des substances tussigènes pendant vingt à trente minutes pour déclencher des épisodes de toux, isolé dans une boîte en plexiglas. Le porteur décrit une bronchoconstriction, une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de mucus par le museau, et prévoit en plus des chirurgies de pose de cathéter de vingt à trente minutes et des ponctions veineuses répétées sous anesthésie. Il écrit limiter le nombre d'animaux "tout en prenant en compte les besoins de nos clients", et fixe le sexe et le poids des cobayes "selon la demande client".

Objectifs

La toux est un réflexe primordial pour la protection des voies respiratoires et pulmonaires contre la production de substances internes (sécrétions) ou externes (inhalées). La toux chronique (durée dépassant les 8 semaines) affecte environs 10% des adultes de la population mondiale et représente un des symptômes les plus courant pour lequel les individus consultent les centres de soins primaires. La toux représente également la manifestation clinique dont les patients atteints de pathologies respiratoires se plaignent le plus. De nombreux facteurs de risques sont associés à la toux dont l’âges et le genre, les pathologies pulmonaires et extra-pulmonaires (e.g. infections respiratoires, asthme, reflux gastroœsophagiens…), les facteurs environnementaux (e.g. polluants), les produits chimiques irritants ou les allergènes. Le plus souvent, les patients souffrant de toux chroniques présentent également une hypersensibilisation des voies nerveuses impliquées dans le réflexe de toux amplifiant la fréquence et le nombres d’épisodes de toux. Malgré l’existence de nombreux traitements permettant de lutter contre ces épisodes de toux, l’efficacité de ces derniers peut être limitée et présentent un effet interindividuel très variable. De plus, chez 40% des patients, les mécanismes physiopathologiques à l’origines de la toux chronique ne sont pas toujours bien identifiés diminuant ainsi l’efficacité de la prise en charge du patient avec un traitement adapté. Le projet a donc pour objectif de tester l’efficacité de candidats médicaments sur un modèle de toux in vivo chez le cobaye vigile. De plus, il est essentiel de pouvoir connaitre la dose efficace d’un candidat médicament en déterminant sa concentration permettant d’assurer son effet thérapeutique optimal tout en minimisant le risque d’effets indésirables. Pour cela, il pourra être établi une analyse du devenir du candidat médicament dans l'organisme après son administration, et testé en parallèle de l’étude de son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des arguments scientifiques sur l’efficacité de nouveaux candidats médicaments chez le cobaye soumis à l’inhalation d’agent irritants des voies respiratoires. Les effets de ces molécules pourront être évalués sur une analyse solide de la réponse comportementale des épisodes de toux mais pourront également être confortés par une analyse approfondie de la réponse moléculaire et/ou immunohistochimique. En parallèle, l’établissement du profil pharmacocinétique des candidats médicaments pourra permettre de déterminer leur dose thérapeutique optimale pour, à terme, proposer une posologie adaptée de la molécule d’intérêt.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'inhalation de substances tussigènes afin d'induire des épisodes de toux. La durée de cette étape est d'environ 20 à 30 min et s'effectue sur animaux vigiles. Ces derniers seront également traités avec des candidats médicaments ou des analgésiques par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale de manière aigue ou répétée (pour les analgésiques si besoin). Ces types d'administrations prennent 1 minute pour être effectuées. Les cobayes pourront également être traités avec les candidats médicaments par voie intraveineuse directement dans la veine jugulaire lorsqu'une seule administration sera nécessaire. Cette procédure se déroule sous anesthésie gazeuse et dure environs 10 min. Les administrations intraveineuses peuvent également être effectuées à travers un cathéter veineux sur animaux vigiles pour réaliser des traitements répétés et l'acte prend 1 minute. Il sera cependant nécessaire de réaliser une chirurgie unique sous anesthésie gazeuse pour implanter le cathérer dont la durée de l'intervention est de 20 à 30 min. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux veineux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée pour une durée de 10 min par prélèvement.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. De plus, pour l’analyse de la toux, l’animal doit être placé et isolé dans une boite en plexiglass pendant plusieurs minutes ce qui peut engendrer de l’anxiété. L’induction des épisodes de toux via l’inhalation de substances tussigènes est une source d’inconfort pour le cobaye car ce sont des agents irritants pour les voies respiratoires et peuvent également causer une bronchoconstriction entrainant une gêne respiratoire, des épisodes de toux sévères et un écoulement de muscus par le museau. Pour les administrations de composés par voie sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Une ou plusieurs administration par voie orale des composés pourront être réalisées, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille pouvant être source de douleur. Certaines modalités d’administration, telles que les injections intraveineuses directement dans les vaisseaux veineux nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux tout comme lors des chirurgies d’implantation de cathéters. Cette dernière modalité peut entrainer un risque d’infection et être l’origine de douleur et de perte de poids en post-opératoire. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée, générant potentiellement du stress et de l’inconfort.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir collecter le sang, le liquide alvéo-pulmonaire, les tissus pulmonaires et les voies aériennes pour quantifier les effets du candidat médicament sur l’aspect moléculaire et/ou immunohistochimique. De même, certains animaux seront mis à mort pour les analyses de pharmacocinétique permettant de quantifier la biodistribution par organes du candidat médicament étudié.

Remplacement

L’objectif principal du projet étant de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur les caractéristiques comportementales de la toux (i.e., fréquence et/ou intensité des épisodes de toux), il n’est pas possible de substituer les cobayes par des modèles in vitro. Par ailleurs, si des méthodes d’extrapolation in vitro-in vivo sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (nombre de voies d’administrations et de doses à tester et nécessité de collecter les organes en fin de protocole). Selon l’objectif des projets, chaque animal pourra être son propre contrôle au cours des inductions des épisode de toux. Un même animal inclus dans un des groupes d’efficacité subira les tests d’induction de la toux, les prélèvements sanguins et la collectes des organes permettant de faire un suivi longitudinal. Le nombre d'animaux choisi par groupe doit permettre de mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre le groupe contrôle négatif et le(s) groupe(s) traité(s) avec un composé de référence. Par ailleurs, suite à la phase de pré-sélection des animaux répondeurs ou non-répondeurs aux agents tussigènes, les animaux non-répondeurs pourront être utilisés dans les groupes d’analyse de pharmacocinétique du même projet. Pour ces analyses pharmacocinétiques, chaque animal pourra être son propre contrôle en fonction du volumes de sang nécessaire (

Raffinement

Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures, les nouveaux environnements ainsi qu’aux expérimentateurs. Avant de rentrer dans la salle d’hébergement, il est demandé aux expérimentateurs de toquer 2 fois à la porte pour diminuer le stress lié à la surprise. Pour l'induction de la toux par inhalation d’agents tussigènes : - les inductions sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. - les animaux sont habitués à être placés dans la boite de plexiglass. - l’induction de la toux se fait sur animaux vigiles évitant l’expositions à des agents anesthésiques et aux méthodes d’administrations de ces agents qui peuvent être source de stress. - pour limiter la bronchoconstriction, un bronchodilatateur est administré à la fin après la nébulisation facilitant la ventilation. Les actes pouvant générer de la douleur telles que les implantations de cathéter et les administration/prélèvements dans la veine jugulaire nécessitant une incision cutanée seront réalisés sous anesthésie chimique ou gazeuse et analgésie pré-opératoire et/ou locale et/ou post-opératoire selon le score sur la grille d’observation. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins et les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent) pour compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (min 2x/jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus appropriée pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments antitussifs et la physiologie du réflexe de toux est le cobaye. Cette espèce exprime une réaction comportementale proche de celle de l’Homme en présence de 3 agent tussigènes communément utilisés pour induire des épisodes de toux chez l’Homme. En effet, les cobayes sont capables de tousser contrairement aux rats et aux souris ne permettant pas, chez ces espèces, de modéliser la toux d’un point de vue comportemental. De plus, les mécanismes nerveux sous-tendant le réflexe de la toux impliquent les fibres sensorielles composant le nerf vague, dont la neurophysiologie et l’aspect histologique sont très similaires à ceux de l’Hommes. Suite à l’activation de ces fibres, l’intégration des influx nerveux au niveau supraspinal se fait dans le bulbe rachidien dans le noyau du tractus solitaire tout comme chez l’Homme. Selon la demande client, les animaux utilisés dans le cadre de ces études seront des cobayes : -Femelles : > 200g correspondant à un âge > 4-8 semaines -Mâles : > 350g correspondant à un âge > 9-10 semaines Ces âges correspondent, en fonction du genre, à l’atteinte de la maturité sexuelle indiquant un ralentissement du développement, limitant ainsi la variabilité des résultats.

Trois cents rats sont réutilisés pour entraîner du personnel à des gestes techniques, les autres tués dès la fin de la phase expérimentale parce que les composés testés ont pu modifier leurs structures et leur immunité. 2 750 rats juvéniles à adolescents vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des candidats médicaments contre la douleur. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter intrathécal ou intraveineux, jusqu'à six stimulations mécaniques ou thermiques par jour répétées sur plusieurs jours, des administrations par une dizaine de voies différentes, des prélèvements sanguins et jusqu'à vingt-quatre heures de mise à jeun. Le porteur affirme que la douleur, "expérience sensorielle et émotionnelle", ne peut pas être étudiée in vitro et que l'évaluation chez l'animal vigile "reste la seule option" avant le passage chez l'être humain.

Objectifs

La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. D’une part, le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur et tests comportementaux et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). D’autre part, certains tests visent à évaluer les effets secondaires de composés pharmacologiques issus de différentes classes. En effet, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». De plus, les Gabapentinoides provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. C’est pourquoi il est nécessaire de développer de nouvelles molécules antalgiques de référence tout en limitant les effets secondaires. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de composés administrés en perfusion ou de manière répétée. Ces tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour l’implantation de cathéters. Lors des tests ils pourront être exposés à une stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux seront également soumis à la contention ou isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. Les animaux seront soumis à un anesthésiant gazeux durant quelques minutes pour l'implantation du cathéter qui nécessite une micro-chirurgie (10minutes). De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’un stimulus douloureux ou non (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (légère < 1 min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 4h maximum). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle :, nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Le port d'un adaptateur au système de de perfusion dans la nuque peut etre une nuisance légère (légère gène,) Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Certains animaux subiront les nuisances liées à la mise à jeun (modérée maximum 24h). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie. La nuisance liée aux perfusions est l’anesthésie gazeuse qui peut-être répétée.

Devenir

Le test de composé pharmacologique en développement ne permet pas la réutilisation des animaux pour tester de nouveaux composés car un impact des composés pharmacologique sur les structures, l’immunité, etc… n’est pas exclu. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité. Néanmoins, dans le cas des procédures n'impliquant pas la mise à mort immédiate des animaux, les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Ces tests sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place au laboratoire.Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclus ou limités à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse si certains groupes contrôles ne sont pas nécessaires. En fonction du design de chaque étude de tests statistiques appropriés seront effectués.

Raffinement

Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de certains tests, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (c’est-à-dire la réponse à un stimulus non douloureux chez l’animal sain). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection sous cutanée de solution hydratante en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. La pose d’un système de perfusion est un raffinement en soi car il permet d’éviter les injections répétées en intraveineux et réduit les temps d’anesthésie pour injection.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents (4-7semaines). Ce stade a été choisi car ilpermet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.

Caractériser un candidat médicament développé par une société privée, l'O2L-001, en vue d'un essai clinique annoncé dans deux ans: 160 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'histologie ou pour quantifier les traceurs injectés. Cinquante d'entre eux reçoivent une injection du produit directement dans le cerveau, cinquante autres dans les ventricules cérébraux, soixante subissent la pose d'un cathéter intraveineux et cent passent une IRM de quatre-vingt-dix minutes. Sur les effets subis par les rats, le RNT tient en une ligne, des douleurs, sans autre précision. Le projet relève à la fois de la recherche fondamentale, du contrôle qualité et des tests réglementaires d'efficacité et de tolérance, pour un produit dont l'entrée en clinique est déjà annoncée.

Objectifs

Cette étude cherche à examiner les caractéristiques d'un nouveau médicament appelé O2L-001, développé par la société Op2lysis pour traiter les hématomes qui se forment après des saignements cérébraux. Ce médicament contient un ingrédient actif nommé OptPA, qui est une version améliorée d'une substance utilisée pour dissoudre les caillots sanguins. L'OptPA a été modifié de manière à être moins toxique et à provoquer moins d'effets secondaires que les traitements actuels. Pour le rendre encore plus efficace, il est mélangé avec un matériau spécial appelé Poloxamère 407. Ce matériau se comporte comme un liquide lorsqu'il est injecté, mais se transforme en gel à la température du corps (37°C) pour libérer le médicament lentement dans l'hématome, aidant ainsi à dissoudre le caillot plus efficacement. L'objectif principal de cette recherche est d'en savoir plus sur les propriétés de l'OptPA et de comprendre comment O2L-001 fonctionne dans le corps.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'O2L-001 et sur son principe actif l'OptPA. L'O2L-001 est une nouvelle génération de thrombolytique qui vise à être testé en clinique d'ici 2 ans pour le traitement et l'évacuation des hématomes formés suite à un AVC hémorragique.

Procédures

1- Pose de cathéter intraveineux pour injection d’OptPA, tPA ou NaCl (30 minutes/animal, n=30 animaux) 2- Pose de cathéter intraveineux pour récupération de sang (30 minutes/animal, n=30 animaux) 3- Injection intracérébral d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux. 4- Injection intraventriculaire d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux) 5- IRM (90 minutes environ, n=100 animaux) 6- Imageur IVIS® (5 minutes environ, n=20 animaux)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux seraient des douleurs.

Devenir

Les animaux feront l'objet d'une mise à mort, soit, afin de générer des tissus permettant des observations histologiques, soit, pour quantifier les traceurs injectés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le rat est l’une des espèces les plus utilisés dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 160 rats seront nécessaires pour réaliser cette étude et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et d’étudier la distribution du produit permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux : 160 animaux) a été évalué via un test statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad lithium. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l’issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu’à l’obtention d’un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placé sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température de la salle d’expérimentation est contrôlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces animales les plus utilisées pour les études de pharmacodynamique et de pharmacocinétique. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie du rat sont également documentés et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que le rat représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ce stade est adapté aux études de pharmacocinétique et pharmacodynamique.